遺傳性視神經(jīng)病變患者臨床表型及基因檢測多態(tài)性分析—單中心隊列研究△

馮超逸 孫平 孫興懷,2 陳倩 田國紅,2

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031；2.國家衛(wèi)健委及中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院近視眼重點實驗室(復(fù)旦大學(xué)) 上海市視覺損害與重建重點實驗室(復(fù)旦大學(xué)) 上海 200031)

遺傳性視神經(jīng)病變(hereditary optic neuropathy，HON)是兒童及青少年中導(dǎo)致視力障礙的主要眼疾之一。由于年齡、遺傳背景分布各異，臨床因急、慢性視力下降或“視神經(jīng)萎縮”來診的患者中，HON的疾病分類不盡相同。臨床常見的是Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)和國外報道較多的常染色體顯性遺傳性視神經(jīng)病變(autosomal dominant hereditary optic atrophy，ADOA)，以及伴發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)其他損害的疊加綜合征[1-3]。以往我們的研究[4]顯示，國內(nèi)HON患者中最常見類型仍為LHON，其次為ADOA。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，基因檢測手段得以不斷更新，使得臨床疾病的診斷精準(zhǔn)化。一些與線粒體疾病相關(guān)的核基因突變越來越多地被發(fā)現(xiàn)并報道，以往“不明原因”的視神經(jīng)萎縮患者大多得以精準(zhǔn)診斷。很多HON伴有復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)或多系統(tǒng)損害或綜合征，視神經(jīng)萎縮是其共同特征。本研究通過對近8年來本院神經(jīng)眼科中心擬診HON的一組患者進(jìn)行完善的二代測序及家系驗證，總結(jié)分析國人HON常見病因及臨床特征，以及少見基因突變的多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1 資料 入組2013年5月～2021年10月就診于本院神經(jīng)眼科或轉(zhuǎn)診評估的視神經(jīng)萎縮患者。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(KJ2011-04)。所有患者均簽署紙質(zhì)知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①視力下降、視野缺損、色覺減退；②檢眼鏡(眼底鏡)下觀察到視神經(jīng)萎縮；③顱腦/眼眶磁共振成像或CT掃描未見顱內(nèi)占位、腦積水、炎癥及靜脈系統(tǒng)狹窄；④常規(guī)血液學(xué)檢查及感染組套未見異常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①明確與急性視力下降相關(guān)的顱腦/眼眶外傷史；②血清學(xué)/影像學(xué)證實視神經(jīng)萎縮由視神經(jīng)炎導(dǎo)致，激素/免疫治療后視力有所好轉(zhuǎn)；③感染性疾病，如結(jié)核、梅毒、艾滋病等；④臨床資料欠完整。

1.2 人口學(xué)資料及眼科檢查 收集患者年齡、性別、出生史、發(fā)育史、系統(tǒng)性疾病史、煙酒及用藥史。眼科檢查包括檢眼鏡下視盤及視網(wǎng)膜形態(tài)觀察及裂隙燈檢查。眼科輔助檢查包括最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)、眼底照相、視野檢查、光學(xué)相干層析成像(optical coherence tomography，OCT)、眼部高頻B超等。

1.3 視力分級 BCVA測量后分為1～5級：0.8或以上；0.4～0.7；0.1～0.3；＞數(shù)指(CF) ～＜0.1；無光感(NLP)～CF。

1.4 視野檢查 靜態(tài)Humphrey/Octopus視野；視力＜0.1的患者行Goldmann視野檢查。結(jié)果分為6種類型：正常、中心暗點/連生理盲點暗點、旁中心暗點、象限缺損、視敏度下降、彌漫性缺損。

1.5 Cirrus OCT檢查 使用Cirrus OCT 5000 (Carl Zeiss Meditec，德國)對能配合的患者進(jìn)行視盤周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer，RNFL)厚度及黃斑區(qū)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-內(nèi)叢狀層(ganglion cell and inner plexiform layer，GCIPL) 厚度測量。使用視盤ONH 200 × 200 程序覆蓋視盤周圍直徑3.4 mm范圍。GCIPL掃描使用512 × 128 Cirrus 程序覆蓋黃斑6 mm×6 mm范圍。使用分析軟件測量RNFL和GCIPL厚度，信號強度≥7 為有效測量。

1.6 基因二代測序 取患者及其家屬外周靜脈血各2 mL(EDTA抗凝)。使用血液基因組DNA提取試劑盒(康為世紀(jì))提取樣本DNA，使用 Nanodrop 2000對DNA進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后進(jìn)行下一步實驗。

1.6.1 高通量測序 使用標(biāo)準(zhǔn)文庫構(gòu)建試劑盒(邁基諾自主研發(fā))進(jìn)行基因組文庫構(gòu)建。對純化產(chǎn)物進(jìn)行鏈接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(ligation-mediated polymerase chain reaction，LM-PCR)，擴增純化后得到DNA文庫，使用 Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳對文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測。采用目標(biāo)序列捕獲探針(MyGenostics，GenCap)對194個已知的神經(jīng)眼科疾病相關(guān)基因外顯子及其上下游50 bp區(qū)域進(jìn)行捕獲。借助Illumina NovaSeq 6000對捕獲的外顯子區(qū)域進(jìn)行高通量測序。

1.6.2 數(shù)據(jù)分析 利用BWA軟件將過濾后的序列比對到NCBI數(shù)據(jù)庫人類基因組參考序列(hg19)上[5]。結(jié)合疾病遺傳模式和患者臨床表征進(jìn)行綜合分析，篩選出可疑候選變異。

1.6.3 Sanger測序驗證 利用PCR和Sanger測序驗證經(jīng)分析篩選后得到的候選變異位點。利用Primer 3.0在線軟件設(shè)計PCR引物。PCR擴增產(chǎn)物使用3130XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序并在ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上進(jìn)行分析。再在家系成員中進(jìn)行共分離驗證。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 人口學(xué)數(shù)據(jù)使用均數(shù)及百分比。BCVA、視野采用分級指標(biāo)并計算百分比。采用IBM SPSS 統(tǒng)計軟件 version 26.0 (IBM Corp，Armonk，美國)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 537例擬診HON患者中，遺傳性視網(wǎng)膜病變88例(16.4%)。入組449例擬診HON患者中，除外13例確診為視神經(jīng)炎、13例為藥物及中毒(甲醇、甲醛、四氯化碳等)誘發(fā)、1例梅毒感染引起、42例臨床資料不全，共計375例患者納入統(tǒng)計學(xué)分析。獲得基因檢測陽性結(jié)果249例(66.4%)，其中男性196例、女性53例，男/女比為3.7∶1。二代測序基因結(jié)果顯示：LHON 169例(67.9%)、ADOA 45例(18.1%)、Wolfram綜合征(Wolfram syndrome，WFS)16例(6.4%)，基因型及表型具體見表1。確診時患者平均年齡為(21.15±13.06)歲(95%CI：19.51～22.79)，中位數(shù)年齡為18歲(P25=11，P75=30)，呈偏態(tài)分布。ADOA、LHON、WFS 3 組間確診年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.193)。

表1 HON表型及基因型人口學(xué)數(shù)據(jù)

男性196例(78.7%)、女性53例(21.3%)。男女性別比，ADOA和LHON間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.285)，ADOA與WFS間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012)，LHON與WFS間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。

2.2 基因型及臨床表現(xiàn) LHON患者中3個原發(fā)位點11778、14486及3460突變的比例分別為60.9%、9.5%及5.9%。男女比為5.5∶1，年齡分布見圖1A。患者初始視力分級見圖1B。發(fā)病時平均視力為0.08±0.12。完成視野檢查128眼，視野缺損類型中，中心暗點/旁中心暗點72眼(56.3%)，彌漫性缺損51眼(39.8%)?；驒z測環(huán)DNA點突變位點分布見表2。

表2 本研究LHON基因突變位點分布

圖1 LHON患者年齡分布及視力分級 A.年齡分布；B.視力分級。

ADOA患者中OPA1突變占96.6%，2例患者的突變基因為OPA3。OPA1患者男女比為3.3∶1，年齡分布見圖2A?；颊叱跏家暳Ψ旨壱妶D2B。發(fā)病時平均視力為0.30±0.23。視野缺損類型中，中心暗點/旁中心暗點28眼(63.6%)，彌漫性缺損5眼(11.4%)。

圖2 ADOA患者年齡分布及視力分級 A.年齡分布；B.視力分級。

WFS患者共計16例，其中WFS1突變的WFSⅠ型14例、CISD2突變的WFS Ⅱ型2例，男女比為1∶1.3，中位數(shù)年齡為19.5歲?；颊甙l(fā)病時平均視力為0.24±0.18。視野缺損類型中，彌漫性缺損10眼(58.8%)，視敏度下降7眼(41.2%)。

發(fā)病時平均視力，LHON與ADOA間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，LHON與WFS間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，ADOA與WFS間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.260)。視野缺損類型，ADOA與LHON、WFS間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＞0.05)，LHON與WFS間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。

3 討論

HON的典型特征是乳斑束區(qū)域神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的不可逆變薄。診斷時需要排除隱匿的視網(wǎng)膜變性類疾病，因其同樣可表現(xiàn)為視盤顏色蒼白。常見的遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及線粒體遺傳。它具有臨床異質(zhì)性，同一致病基因在不同家庭成員之間可能臨床表現(xiàn)不同，線粒體基因的突變頻率也會導(dǎo)致表型的變化。不同的基因型也有可能導(dǎo)致相似或相同的表型。

LHON作為通常具有急性病程的視神經(jīng)病變，被認(rèn)為是中國人主要的HON[18-19]。近年來隨著基因檢測手段的提高以及神經(jīng)眼科醫(yī)師對視神經(jīng)萎縮疾病認(rèn)識的深入，除LHON以外的其他類型線粒體疾病，尤其是核基因相關(guān)的ADOA、WFS等逐漸被認(rèn)識[20]。本研究中甚至有很多極為罕見的基因突變導(dǎo)致的特殊視神經(jīng)病變。

LHON是中國人重要的導(dǎo)致青少年致盲的遺傳性疾病。我們的隊列研究顯示：發(fā)病年齡高峰在10～20歲；平均視力差，中位視力集中在＞CF～＜0.1。早期眼底視盤毛細(xì)血管擴張充血的假性水腫表現(xiàn)極具診斷價值(圖3)，亞急性期與慢性期雖然也有其特征性表現(xiàn)，但與其他疾病導(dǎo)致的視神經(jīng)萎縮不易鑒別(圖4)。乳斑束在不同時期均呈現(xiàn)明顯萎縮、變薄。視野表現(xiàn)與以往報道的中心視野受累類似(圖5)。隨著OCT技術(shù)廣泛用于神經(jīng)眼科，我們發(fā)現(xiàn)急性期(甚至超急性期)患者視盤周圍RNFL并不會變薄，相反是假性水腫導(dǎo)致的增厚；但黃斑GCIPL出現(xiàn)變薄的趨勢。這種趨勢在亞急性期與慢性期尤為明顯；晚期不可避免地出現(xiàn)RNFL及GCIPL明顯變薄的特征。OCT的此種表現(xiàn)可用于與急性視神經(jīng)炎的鑒別診斷：視神經(jīng)炎是以視神經(jīng)軸索損害為主的疾病，急性期(1個月內(nèi))不會出現(xiàn)黃斑GCIPL的丟失；相反，LHON為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞為主的線粒體能量代謝疾病，GCIPL在急性期即明顯丟失(圖6)。

圖3 LHON患者眼底照片及熒光素眼底血管造影 A.雙眼發(fā)病患者早期眼底視盤毛細(xì)血管擴張充血。B.熒光素眼底血管造影顯示無熒光滲漏，為假性水腫。C.右眼發(fā)病患者眼底示右眼視盤鼻側(cè)充血、色紅，顳側(cè)蒼白，乳斑束萎縮；左眼視盤亦表現(xiàn)為充血、色紅。D.雙眼先后發(fā)病患者右眼視盤蒼白、萎縮(晚期)；左眼視盤邊界欠清、假性水腫(急性期)。

圖4 LHON患者不同時期眼底形態(tài) A.急性期雙側(cè)視盤毛細(xì)血管擴張充血、色紅，假性水腫；B.亞急性期視盤充血逐漸消退，視乳頭黃斑束萎縮；C.晚期視盤顳側(cè)蒼白萎縮，神經(jīng)纖維層彌漫性變薄。

圖5 LHON患者視野損害類型 A.中心暗點；B和C.連生理盲點中心暗點；D.中心視野缺損；E.雙眼上方弓形視野缺損；F.中心暗點(Goldmann視野檢查)。A～E為Humphrey視野檢查。

圖6 LHON患者不同時期OCT表現(xiàn) A.急性期雙側(cè)視盤RNFL基本正常(或輕度增厚)，但黃斑GCIPL開始變薄(左眼為先發(fā)病眼)；B.亞急性期視盤RNFL未見明顯變薄，但黃斑GCIPL明顯丟失變??；C.晚期視盤RNFL及黃斑GCIPL顯著變薄。

該隊列研究中ADOA的發(fā)病高峰年齡為5～10歲，較LHON明顯降低。ADOA單眼發(fā)病的患者比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LHON?；佳垡暳λ郊性?.1～0.3。視野表現(xiàn)多為中心暗點或旁中心暗點。表明ADOA發(fā)病平均年齡更小，常常無主觀急性視力下降的主訴，而是學(xué)前體檢時發(fā)現(xiàn)來診。該隊列中還包括2例罕見的OPA3突變。ADOA的家族遺傳史相比LHON的單純母系遺傳更加復(fù)雜，且家族中發(fā)病患者視力水平相差甚遠(yuǎn)。我們的經(jīng)驗是單眼/雙眼不明原因的視神經(jīng)萎縮患兒，排除顱內(nèi)明確占位性病變后，建議行基因檢測明確是否有HON的基因突變(圖7)。

圖7 OPA1患兒眼底檢查 A.雙眼視盤彌漫性蒼白萎縮，眼位偏斜(斜視)；B.Humphrey視野檢查示雙眼顳側(cè)偏盲；C.CT檢查示雙眼視盤顳側(cè)RNFL對稱性變薄，黃斑GCC彌漫性變薄。

該隊列顯示大齡/老齡(年齡＞45歲)發(fā)病的LHON/ADOA患者絕大多數(shù)為酗酒、吸煙、抗結(jié)核藥物導(dǎo)致，符合線粒體疾病發(fā)病與肝臟能量代謝衰竭密切相關(guān)；也證實線粒體疾病的發(fā)病除了先天基因異常外，外界環(huán)境也是促發(fā)病變的重要因素。有趣的是，該隊列中很多患者甚至攜帶了2個或以上的線粒體點突變位點，或者OPA1合并線粒體點突變位點。這類患者發(fā)病可能是原發(fā)突變位點起主要作用，繼發(fā)位點加重了線粒體能量代謝異常的損害。

WFS作為少見的疾病在該隊列中亦有特殊表現(xiàn)。明確診斷WFS的16例患者，除2例CISD2基因突變外，均為WFS1常染色體隱性遺傳，且家系驗證顯示父母均為雜合攜帶者。由于WFS1基因編碼的蛋白功能為調(diào)控線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道蛋白，其突變間接導(dǎo)致線粒體功能異常，因此出現(xiàn)與線粒體疾病類似的視神經(jīng)萎縮[23-24]。臨床中如單純檢測線粒體相關(guān)基因則容易漏診。

本研究中發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報道過的可導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括視神經(jīng)萎縮5型(DNM1L)[25]、視神經(jīng)萎縮9型(ACO2)[26-27]、脊髓小腦共濟失調(diào)28型(AFG3L2)[28-29]、遺傳性痙攣性截癱(SPG7)[29]、Leigh綜合征(NDUFS2)[30-32]、Crouzon綜合征(FGFR2)[33-34]、Bardet-Biedl 綜合征(BBS10)[35]、多小腦回視神經(jīng)萎縮(TUBA8)[36]、身材矮小、視神經(jīng)萎縮和Pelger-Huet異常(NBAS)[37]、Warburg micro綜合征3型(RAB18)[38-39]、線粒體腦肌病伴高乳酸血癥及卒中樣發(fā)作MELAS(m.13513G＞A)[40]、肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維MERRF(m.8344A＞G)[41]等罕見突變。

綜上所述，兒童及青少年不明原因的視力下降及視神經(jīng)萎縮很多是由于遺傳性疾病導(dǎo)致的，有針對性地進(jìn)行基因檢測有助于疾病的精準(zhǔn)診斷以及為后續(xù)的基因治療奠定基礎(chǔ)。

志謝：感謝復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院生物樣本庫及邁基諾基因公司對本研究的大力支持。