急冷與空氣暴露聯(lián)合脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生理代謝影響

徐德峰，吳嘉鑫，孫力軍，秦小明，范秀萍

急冷與空氣暴露聯(lián)合脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生理代謝影響

徐德峰，吳嘉鑫，孫力軍，秦小明，范秀萍

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088; 大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

【目的】探明無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中凡納濱對(duì)蝦（）響應(yīng)急冷（acute cold，AC）與空氣暴露（waterless duration，WD）聯(lián)合脅迫的生理代謝調(diào)節(jié)規(guī)律?！痉椒ā垦芯磕M產(chǎn)業(yè)運(yùn)輸實(shí)際，分析聯(lián)合脅迫（AC+WD）進(jìn)程中凡納濱對(duì)蝦血液和肝胰腺典型生化指標(biāo)，以及肝胰腺組織病理變化?！窘Y(jié)果】AC脅迫后，凡納濱對(duì)蝦生理應(yīng)激指標(biāo)血清皮質(zhì)醇含量由正常組（normal control，NC）的（326.90±4.61）pg/mL顯著增加到AC組的（427.16±7.92）pg/mL（< 0.05），AC+WD組則隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。血清葡萄糖含量在聯(lián)合脅迫6 h后達(dá)到最大值（26.31±1.05）mg/dL，乳酸在9 h達(dá)到峰值（7.90±0.11）mmol/L。AC及AC+WD組中血藍(lán)蛋白、尿素氮和肌酐含量較NC組均發(fā)生不同程度的增加，而總蛋白含量先升后降，總膽固醇和甘油三酯含量呈脅迫時(shí)間依賴性下降。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、酸性和堿性磷酸酶活力呈上升趨勢(shì)，并在9 h達(dá)到峰值。以上生化指標(biāo)在脅迫復(fù)蘇組有所恢復(fù)，表明AC+WD雙重脅迫引起凡納濱對(duì)蝦物質(zhì)代謝紊亂，復(fù)蘇后機(jī)體生理應(yīng)激和代謝系統(tǒng)發(fā)生一系列代償性調(diào)節(jié)，且脅迫進(jìn)程中肝胰腺組織病理?yè)p傷特征進(jìn)一步解釋了凡納濱對(duì)蝦響應(yīng)環(huán)境聯(lián)合脅迫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?！窘Y(jié)論】無(wú)水保活流通過(guò)程中雙重脅迫時(shí)間依賴性改變凡納濱對(duì)蝦生理應(yīng)激水平和物質(zhì)代謝，在9 h時(shí)可明顯造成肝胰腺組織結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而影響機(jī)體存活。

凡納濱對(duì)蝦；無(wú)水?；盍魍ǎ簧響?yīng)激；代謝響應(yīng)；肝胰腺

水產(chǎn)品無(wú)水?；盍魍ㄟ\(yùn)載量大，結(jié)合航空運(yùn)輸可實(shí)現(xiàn)快速長(zhǎng)途運(yùn)輸，綜合成本較低，近年來(lái)得到了快速發(fā)展[1,2]。凡納濱對(duì)蝦（）是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良蝦種之一，對(duì)外界環(huán)境刺激極其敏感，?；盍魍ㄟ^(guò)程中環(huán)境脅迫對(duì)其造成的應(yīng)激性傷殘時(shí)常發(fā)生，綜合運(yùn)輸成本偏高。通常機(jī)體應(yīng)激水平與血液生理生化指標(biāo)密切相關(guān)，動(dòng)物的生理病理變化可引起血液成分發(fā)生改變，因此檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中血液生化指標(biāo)可間接反映機(jī)體響應(yīng)環(huán)境脅迫的生理調(diào)節(jié)規(guī)律，為改善?；盍魍l件提供理論依據(jù)。

受環(huán)境脅迫時(shí)，機(jī)體血液生理生化指標(biāo)波動(dòng)是反映體內(nèi)代謝失衡的重要特征，與動(dòng)物存活質(zhì)量密切相關(guān)。Selye[3]研究表明，當(dāng)動(dòng)物受到不良環(huán)境脅迫時(shí)，其生理變化會(huì)在血液指標(biāo)中體現(xiàn)出來(lái)。雖然蝦類有水保活過(guò)程中血液生化指標(biāo)的變化特征目前已有相關(guān)報(bào)道[4]，且徐子涵[5]模擬凡納濱對(duì)蝦無(wú)水保活運(yùn)輸，探究了蝦在無(wú)水低溫脅迫環(huán)境中發(fā)生的氧化應(yīng)激和抗氧化反應(yīng)、免疫反應(yīng)、糖代謝及相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，并設(shè)計(jì)了無(wú)水?；钸\(yùn)輸技術(shù)裝置，但其過(guò)程中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝規(guī)律尚不清楚，且反應(yīng)臟器損傷程度的相關(guān)生化指標(biāo)也有待進(jìn)一步闡明。脅迫環(huán)境下，為維持正常生理狀態(tài)，水產(chǎn)動(dòng)物會(huì)從神經(jīng)內(nèi)分泌、生理生化、免疫調(diào)節(jié)等層面進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié)以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[6]，其中生理應(yīng)激與代謝調(diào)節(jié)是經(jīng)典途徑。目前從物質(zhì)和能量代謝途徑解析長(zhǎng)時(shí)間低溫?zé)o水?；盍魍▽?duì)大口黑鱸（）[7]、蝦夷扇貝（）[8]、縊蟶（）[9]等水產(chǎn)動(dòng)物影響的研究已有相關(guān)報(bào)道，廣溫性魚(yú)類在低溫環(huán)境中可調(diào)節(jié)生理應(yīng)激和代謝途徑相關(guān)酶活力，從而使代謝和生理功能逐漸適應(yīng)環(huán)境變化[10, 11]。整體而言，凡納濱對(duì)蝦無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中急冷（acute cold exposure，AC）及空氣暴露（waterless duration，WD）聯(lián)合脅迫（AC+WD）誘導(dǎo)的生理應(yīng)激及代謝相關(guān)途徑變化研究報(bào)道鮮見(jiàn)，機(jī)體響應(yīng)雙重環(huán)境脅迫的生理應(yīng)激和代謝調(diào)節(jié)規(guī)律亟待揭示。因此，本研究通過(guò)模擬無(wú)水?；盍魍ㄟ\(yùn)輸環(huán)境，評(píng)價(jià)AC+WD對(duì)凡納濱對(duì)蝦血液生化指標(biāo)的影響，分析肝胰腺組織響應(yīng)聯(lián)合脅迫的特征性病理變化，探明生理應(yīng)激、代謝響應(yīng)和組織損傷相關(guān)參數(shù)變化的內(nèi)在聯(lián)系，揭示無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中凡納濱對(duì)蝦響應(yīng)急冷聯(lián)合無(wú)水暴露雙重脅迫的生理應(yīng)激與代謝調(diào)節(jié)規(guī)律，以期為后續(xù)存活質(zhì)量預(yù)測(cè)和改善?；盍魍l件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

約300尾體質(zhì)量（16.23±1.12）g、體長(zhǎng)（7.36±0.42）cm的凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自廣東省湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。用空氣壓縮泵充分打入壓縮空氣后將對(duì)蝦于2 h內(nèi)運(yùn)送至廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院?；盍魍▽?shí)驗(yàn)室，新鮮海水適應(yīng)性暫養(yǎng)6 h（溫度25 ℃，鹽度35），暫養(yǎng)期間不投放餌料，氧泵連續(xù)供氧，挑選無(wú)明顯傷殘、大小基本一致、活動(dòng)正常、狀態(tài)良好的180尾對(duì)蝦進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

氯化鈉、葡萄糖、檸檬酸三鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉等均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；皮質(zhì)醇測(cè)定試劑盒（貨號(hào)MM-9000501）購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒（貨號(hào)F006-1-1）購(gòu)于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；總蛋白測(cè)定試劑盒（貨號(hào)BC3185）購(gòu)于上海索萊寶生物科技有限公司；乳酸測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A084-2-1）、甘油三酯測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A110-1-1）、總膽固醇測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A111-1-1）、尿素氮測(cè)定試劑盒（貨號(hào)C013-1-1）、肌酐測(cè)定試劑盒（貨號(hào)C011-1-1）、酸性磷酸酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)A060-2-1）、堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)A059-2-2）、谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒（貨號(hào)C010-2-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒（貨號(hào)C009-2-1）均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

HX-1508低溫冷卻循環(huán)泵，江蘇天翔儀器有限公司；S-20氧泵，中國(guó)浙江寧波塞爾電氣公司；25 cm ×20 cm塑料自封袋，天津永業(yè)塑料制品有限公司；PYX-CXG250電腦恒溫層析柜，四川科力儀器技術(shù)有限公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德有限公司；Varioskan全自動(dòng)酶標(biāo)儀，塞默飛世爾科技中國(guó)有限公司；

1.3 方法

1.3.1 凡納濱對(duì)蝦分組與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)以正常對(duì)照組（Normal control，NC）和急冷休眠組（Acute cold，AC）為對(duì)照，考察AC+WD對(duì)血液主要生化指標(biāo)的影響。根據(jù)目前凡納濱對(duì)蝦保活流通實(shí)際，參照本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)方法[12]，取暫養(yǎng)后的30尾凡納濱對(duì)蝦放于裝有30 L自然海水中的塑料周轉(zhuǎn)筐中（490 mm ×345 mm ×285 mm），室溫25 ℃下放置，設(shè)為NC組。脅迫組采用低溫冷卻循環(huán)泵將海水溫度降至12 ℃，然后將暫養(yǎng)后的凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)移到該冷水進(jìn)行急性低溫誘導(dǎo)休眠，觀察其活動(dòng)狀態(tài)，待對(duì)蝦對(duì)外界刺激反應(yīng)微弱時(shí)，隨機(jī)選取其中30尾放于裝有30 L自然海水并冷卻至12 ℃的塑料周轉(zhuǎn)筐（490 mm × 345 mm × 285 mm）中，實(shí)驗(yàn)期間一直存放于此環(huán)境，設(shè)為AC組。其余急冷脅迫休眠后的凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)放入塑料自封袋中并充氧密封（氧氣體積分?jǐn)?shù)95%），每袋10尾，每組3袋，共4組，然后參照Xu等[13]方法將對(duì)蝦儲(chǔ)存在12 ℃的層析柜中，模擬水產(chǎn)品無(wú)水保活運(yùn)輸環(huán)境作為AC+WD組，取雙重脅迫開(kāi)始3、6、9 h，以及9 h后放入自然水（水溫25 ℃）復(fù)蘇2 h的對(duì)蝦樣品，分別記為AC+WD(3 h)、AC+WD(6 h)、AC+WD(9 h)、AC+WD(9 h)+R組。筆者前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NC組在12 h的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)其行為正常，且生化指標(biāo)基本無(wú)變化；而AC組在12 ℃的海水中30 min即可進(jìn)入完全休眠狀態(tài)，之后可能是代謝速率顯著下降，各生化指標(biāo)也保持基本一致。因而在滿足代表性的前提下為減少實(shí)驗(yàn)數(shù)量，NC和AC組僅在30 min時(shí)取樣，而AC+WD組結(jié)合表觀和皮質(zhì)醇含量變化則分別在3、6、9 h，以及復(fù)蘇2 h后取血淋巴和肝胰腺組織，檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)，并行肝胰腺常規(guī)組織化學(xué)分析，綜合闡明凡納濱對(duì)蝦響應(yīng)AC+WD的生理應(yīng)激與代謝調(diào)節(jié)。

1.3.2 樣品采集 參照文獻(xiàn)[14]預(yù)先配制無(wú)菌抗凝劑（140 mmol/L氯化鈉，100 mmol/L葡萄糖，30 mmol/L檸檬酸三鈉，26 mmol/L檸檬酸，10 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，pH 4.6），用1 mL一次性無(wú)菌注射器預(yù)先吸取0.2 mL上述抗凝劑，再按照血液與抗凝劑體積比1∶1從凡納濱對(duì)蝦圍心腔內(nèi)抽取血淋巴，將同一處理組對(duì)蝦血液進(jìn)行合并（約0.2 mL），放入1.5 mL離心管，4 ℃冰箱中低溫靜置2 h，迅速經(jīng)3 000 r/min、4 ℃離心10 min，得上清液，液氮速凍后分裝保存于-80 ℃用于各生化指標(biāo)測(cè)定。通常血淋巴只在存活對(duì)蝦體內(nèi)才能抽取，如實(shí)驗(yàn)期間對(duì)蝦個(gè)體死亡則血淋巴因凝血而無(wú)法抽取，因此本實(shí)驗(yàn)血清各指標(biāo)測(cè)定均取自存活個(gè)體。

1.3.3 生化指標(biāo)測(cè)定 皮質(zhì)醇、葡萄糖、總蛋白、乳酸、甘油三酯、總膽固醇、尿素氮、肌酐含量，酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定均嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。血藍(lán)蛋白含量測(cè)定參照潘魯青等[15]方法稍作修改。取血液樣品10 μL與990 μL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH = 7.0）混勻，充分震蕩，避免產(chǎn)生氣泡，在波長(zhǎng)334 nm處測(cè)量光密度值，以PBS為對(duì)照。血藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）= 2.30 ×(334 nm) × 100。

1.3.4 肝胰腺組織結(jié)構(gòu)分析 按照本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)方法[16]，對(duì)各組對(duì)蝦肝胰腺組織進(jìn)行石蠟組織切片化學(xué)制樣和結(jié)構(gòu)觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行組，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異分析，顯著性水平= 0.05。采用Origin Pro 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AC+WD對(duì)凡納濱對(duì)蝦行為及生理應(yīng)激影響

由圖1(A)可以明顯看出，NC組對(duì)蝦呼吸正常，自由游動(dòng)；AC組對(duì)蝦側(cè)倒，游泳足擺動(dòng)無(wú)規(guī)律，而后進(jìn)入休眠狀態(tài)，機(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)；而AC+WD組表現(xiàn)出更弱的行為反應(yīng)；AC+WD(9 h)+R組對(duì)蝦身體重新正立，恢復(fù)平衡性。

由圖1(B)可以看出，AC組對(duì)蝦血液中皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度為（427.16±7.92）pg/mL，相比NC組的（326.90±4.61）pg/mL顯著升高（< 0.05），提示AC脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)生了強(qiáng)烈的環(huán)境應(yīng)激。在AC+WD組隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)，復(fù)蘇后進(jìn)一步下降至（356.45±3.56）pg/mL，表明生理應(yīng)激在復(fù)蘇后有明顯降低。

凡含一個(gè)相同字母，表示差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.2 AC+WD對(duì)凡納濱對(duì)蝦糖、脂類底物代謝水平的影響

葡萄糖和乳酸是反映機(jī)體糖代謝速率的重要指標(biāo)。本研究中，凡納濱對(duì)蝦血清葡萄糖的質(zhì)量濃度在AC和AC+WD脅迫后逐漸升高，至AC+WD(6 h)組達(dá)到峰值（26.31±1.05）mg/dL，與NC組的（20.38±0.95）mg/dL相比差異顯著（< 0.05）；AC+WD9 h組有所下降，AC+WD(9 h)+R組進(jìn)一步下降至（23.92±0.60）mg/dL，但未能恢復(fù)至NC組水平（圖2(A)）。此外，AC組與AC+WD(3 h)組之間血清乳酸水平變化不大（圖2(B)），而AC+WD(3 h)組乳酸濃度較NC組顯著增加，且在AC+WD(9 h)組達(dá)到最大值（7.90±0.11）mmol/L，復(fù)蘇后雖有所下降但仍顯著高于NC組（< 0.05），提示在保活后期細(xì)胞以無(wú)氧呼吸為主。

除了糖代謝有顯著改變外，血液中脂類物質(zhì)代謝也經(jīng)歷了明顯改變。由圖2(C-D)可以看出，AC脅迫處理后總膽固醇和甘油三酯均較NC組略微下降，且隨AC+WD脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步下降。總膽固醇濃度在AC+WD(6 h)組較NC組顯著降低（< 0.05），而甘油三酯濃度在AC+WD(3 h)組就顯著下降（< 0.05）。之后兩者均小幅下降，且在AC+WD(9 h)組達(dá)到最小值，分別為（8.51±0.30）mmol/L和（1.78±0.08）mmol/L，復(fù)蘇后有所上升，但無(wú)法恢復(fù)至NC組水平。

凡含一個(gè)相同字母，表示差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.3 AC+WD對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)代謝和氧運(yùn)輸能力的影響

無(wú)水?；钸^(guò)程中凡納濱對(duì)蝦血液總蛋白含量變化由圖3(A)所示，與NC組相比，血液總蛋白質(zhì)量濃度在經(jīng)歷單獨(dú)AC或AC+WD脅迫時(shí)均顯著增加（< 0.05），且AC+WD(3 h)組達(dá)到最大值（11.96±0.21）g/dL，隨后在AC+WD(6 h)和AC+WD(9 h)組進(jìn)一步下降，但在AC+WD(9 h)+R復(fù)蘇又略微上升。血藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度在AC組變化不大，聯(lián)合脅迫后隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，AC+WD(9 h)組達(dá)到最大值（30.59±1.16）mg/mL，與NC組（19.59±0.84）mg/mL相比差異顯著（< 0.05）（圖3(B)）。血藍(lán)蛋白是氧運(yùn)輸主要蛋白，結(jié)合上述血液乳酸含量的變化規(guī)律，可以推測(cè)，凡納濱對(duì)蝦在應(yīng)對(duì)雙重環(huán)境脅迫后期供能方式發(fā)生顯著改變。

另外，血液中尿素氮和肌酐濃度是反映腎臟功能的重要標(biāo)志物。由圖3(C)可以看出，AC組尿素氮濃度達(dá)到（19.61±0.22）mmol/L，相比NC組的（9.45±0.62）mmol/L顯著增加（< 0.05），在隨后的AC+WD脅迫過(guò)程中呈時(shí)間依賴性增加，AC+WD(9 h)組達(dá)到最大值（19.61±0.22）mmol/L，復(fù)蘇后（AC+WD(9 h)+R組）雖有所恢復(fù)但仍舊顯著高于NC組水平（< 0.05），上述改變可能是因?yàn)榧崩涿{迫刺激皮質(zhì)醇的大量釋放，進(jìn)而帶動(dòng)尿素氮的釋放，復(fù)蘇后隨著皮質(zhì)醇濃度降低而逐漸恢復(fù)到正常水平。同時(shí)，與NC組相比，血液中肌酐含量在經(jīng)歷AC和AC+WD脅迫后均顯著增加（圖3(D)，< 0.05），復(fù)蘇后雖有所下降，但無(wú)法恢復(fù)至對(duì)照組水平，這可能與腎臟濾過(guò)功能受損有關(guān)。

2.4 AC+WD對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺代謝功能酶活力的影響

由圖4(A、B)可知，AC+WD脅迫過(guò)程中，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。AC脅迫后谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力開(kāi)始上升，AC+WD(3 h)組活力顯著高于NC組（< 0.05），AC+WD(9 h)組谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力達(dá)到峰值，分別為（6.11±0.32）和（6.19±0.24）U/L，提示凡納濱對(duì)蝦在AC+WD脅迫下肝臟損傷逐漸加重；復(fù)蘇后二者分別顯著下降至（4.05±0.19）和（3.84±0.21）U/L，但仍顯著高于NC組（1.61±0.19）和（1.48±0.27）U/L（< 0.05），說(shuō)明水產(chǎn)動(dòng)物在應(yīng)答強(qiáng)烈環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)伴隨重要臟器的不同程度結(jié)構(gòu)損傷。另外，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均是通過(guò)肝臟向外表達(dá)的酶類，直接參與磷酸基團(tuán)的代謝，同時(shí)與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等代謝相關(guān)[17]。由圖4(C、D)可知，與NC組相比，AC組凡納濱對(duì)蝦酸性磷酸酶活力有所下降，而堿性磷酸酶活力略微上升；AC+WD脅迫后酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力均基本呈時(shí)間依賴性增加，且AC+WD(9 h)組二者達(dá)到最大值，分別為（9.14±1.24）和（17.07±0.21）U/100 mL；復(fù)蘇后兩者基本恢復(fù)至NC組水平，可能是因?yàn)槊{迫環(huán)境下凡納濱對(duì)蝦提高代謝速率，調(diào)節(jié)自身免疫能力以抵抗不良環(huán)境脅迫，維持生命活動(dòng)正常進(jìn)行。

凡含一個(gè)相同字母，表示差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.5 AC+WD對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

甲殼動(dòng)物肝胰腺中通常含分泌細(xì)胞（B細(xì)胞）、吸收細(xì)胞（F細(xì)胞）、儲(chǔ)存細(xì)胞（R細(xì)胞）和胚細(xì)胞（E細(xì)胞)，環(huán)境變化會(huì)對(duì)B、R細(xì)胞的比例造成影響。從圖5可知，NC組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常且分布均勻；AC脅迫時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)泡體積減小，基膜收縮；AC+WD聯(lián)合脅迫3 h時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)泡體積變小，空泡數(shù)量相較NC組明顯增加，B細(xì)胞數(shù)量減少，肝小管變形；AC+WD聯(lián)合脅迫6 h時(shí)管腔變形嚴(yán)重，空泡數(shù)量明顯減少，體積變大，R細(xì)胞數(shù)量減少；AC+WD聯(lián)合脅迫9 h時(shí)管腔中可看到破碎的細(xì)胞組織，轉(zhuǎn)運(yùn)泡體積變大導(dǎo)致管腔被明顯擠壓變形；AC+WD聯(lián)合脅迫9 h后復(fù)蘇組中肝小管破裂，空泡數(shù)量明顯減少，管腔和肝小管組織間隙的細(xì)胞破碎得到明顯改善。說(shuō)明凡納濱對(duì)蝦在應(yīng)答AC+WD聯(lián)合脅迫時(shí)，肝胰腺組織結(jié)構(gòu)受到一定程度的損傷，與上述酶活力變化一致，指明了物質(zhì)代謝變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

凡含一個(gè)相同字母，表示差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

B，B細(xì)胞B-cells；L，管腔Lumen；R，儲(chǔ)存細(xì)胞Restore-cells；TV，轉(zhuǎn)運(yùn)泡Transport vesicle；BM，基膜Basement membrane

3 討論

動(dòng)物受不良環(huán)境脅迫時(shí)，首先進(jìn)行由神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的初級(jí)反應(yīng)，促使皮質(zhì)醇的合成與釋放，實(shí)現(xiàn)機(jī)體的自我保護(hù)[18]。本研究中，凡納濱對(duì)蝦在單獨(dú)AC脅迫后血清皮質(zhì)醇含量迅速增加，在隨后的AC+WD脅迫過(guò)程中逐漸下降，但均高于NC組（圖1(B)），推測(cè)是在急性低溫脅迫時(shí)，生存溫度的驟變對(duì)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈應(yīng)激，使得皮質(zhì)醇含量迅速升高。另外，皮質(zhì)醇作為一種應(yīng)激激素，同時(shí)具有調(diào)節(jié)糖、脂肪生物合成的作用[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，AC+WD脅迫下機(jī)體血糖含量有所增加，很可能是因?yàn)槠べ|(zhì)醇的釋放調(diào)節(jié)了體內(nèi)糖代謝速率所致，且皮質(zhì)醇具有對(duì)抗胰島素的作用，可抑制外周組織對(duì)葡萄糖的利用，從而使血糖升高，出現(xiàn)高血糖癥。另外，葡萄糖含量在AC+WD(6 h)組內(nèi)增加，后期略微下降，而乳酸含量在雙重脅迫前期變化不大，6 h后顯著增加（圖2(A、B)），提示凡納濱對(duì)蝦在無(wú)水?；詈笃谟醒醮x減弱，而無(wú)氧代謝相對(duì)增強(qiáng)。梁敏等[21]發(fā)現(xiàn)將凡納濱對(duì)蝦用CO2麻醉后進(jìn)行低溫?zé)o水運(yùn)輸，血清乳酸含量隨運(yùn)輸時(shí)間延長(zhǎng)而隨之積累，其結(jié)果與本研究相符，證實(shí)乳酸含量是機(jī)體應(yīng)答環(huán)境脅迫的敏感指標(biāo)。膽固醇是類固醇激素合成的重要原料，甘油三酯是機(jī)體儲(chǔ)存及氧化供能的重要形式[22]，本研究中凡納濱對(duì)蝦在AC+WD雙重脅迫下，總膽固醇和甘油三酯含量均有不同程度的下降（圖2(C、D)）。常玉梅等[23]發(fā)現(xiàn)，低溫會(huì)使鯉（）肝臟受損，總膽固醇和甘油三酯無(wú)法通過(guò)腸肝循環(huán)途徑進(jìn)入肝臟被重吸收，致使血液總膽固醇和甘油三酯含量升高，這與本研究結(jié)果基本一致，推測(cè)是在低溫環(huán)境下，為維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的相對(duì)恒定，水產(chǎn)動(dòng)物通過(guò)啟動(dòng)代謝補(bǔ)償途徑以加強(qiáng)自身產(chǎn)能來(lái)適應(yīng)不良環(huán)境脅迫。

本研究發(fā)現(xiàn)，AC+WD脅迫進(jìn)程中凡納濱對(duì)蝦血液總蛋白含量呈先升后降（圖3(A)），與冀德偉等[24]對(duì)大黃魚(yú)（）響應(yīng)8.5 ℃低溫脅迫血液生化變化規(guī)律一致。同時(shí)，尿素氮和肌酐含量在AC及AC+WD脅迫組中均高于NC組，且呈時(shí)間依賴性上升（圖3(C、D)），提示雙重脅迫對(duì)肝腎功能損傷較大。黃建盛等[25]發(fā)現(xiàn)急性低氧脅迫下，軍曹魚(yú)（）幼魚(yú)血液總蛋白含量比脅迫前略有降低，而肌酐含量上升，這些研究結(jié)果均說(shuō)明，環(huán)境脅迫影響水產(chǎn)動(dòng)物物質(zhì)代謝，并對(duì)腎組織造成一定的損傷，使其機(jī)能出現(xiàn)紊亂。同時(shí)，本研究中AC+WD脅迫過(guò)程中血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力有所上升而復(fù)蘇后則明顯下降（圖4(A、B)），可能是因?yàn)榧崩涿{迫使得凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織受損，細(xì)胞膜通透性增加，使肝胰腺中的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶外流至血液中，這與CO2麻醉低溫保活運(yùn)輸羅氏沼蝦（）血液生化指標(biāo)變化結(jié)果一致[26]。酸性和堿性磷酸酶活力同樣隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而上升（圖4(C、D)），史文竟等[27]研究環(huán)境水溫對(duì)克氏原螯蝦（）血液相關(guān)酶活力的影響也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。因此，鑒于酸性和堿性磷酸酶在免疫防御系統(tǒng)中起重要作用，雙重脅迫下血漿ACP和AKP規(guī)律性變化有利于對(duì)蝦適應(yīng)環(huán)境脅迫。同時(shí)，肝胰腺組織結(jié)構(gòu)變化進(jìn)一步在組織化學(xué)層面證明，AC+WD雙重脅迫對(duì)機(jī)體臟器結(jié)構(gòu)造成了一定的損傷（圖5）。綜合上述血液生化指標(biāo)中生理應(yīng)激、物質(zhì)代謝、肝胰腺相關(guān)酶活力水平和結(jié)構(gòu)損傷情況，可以初步闡明無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中凡納濱對(duì)蝦響應(yīng)AC+WD雙重環(huán)境脅迫的生理應(yīng)激和代謝調(diào)節(jié)規(guī)律（圖6）。

圖6 AC+WD雙重脅迫下凡納濱對(duì)蝦生理應(yīng)激與代謝調(diào)節(jié)規(guī)律

4 結(jié)論

無(wú)水?；钸^(guò)程中AC+WD雙重脅迫會(huì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦造成明顯的行為和生理應(yīng)激，使糖、脂和蛋白質(zhì)代謝加強(qiáng)，同時(shí)血液尿素氮和肌酐含量，以及谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力顯著上升，且肝胰腺組織出現(xiàn)規(guī)律性損傷。本研究整體揭示了無(wú)水?；盍魍ōh(huán)境下機(jī)體響應(yīng)AC+WD脅迫的生理應(yīng)激和代謝調(diào)節(jié)規(guī)律，為后續(xù)?；钸^(guò)程中的存活質(zhì)量監(jiān)控和保活流通參數(shù)調(diào)整提供了理論參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 何蓉, 謝晶. 水產(chǎn)品?；罴夹g(shù)研究現(xiàn)狀和進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(5): 243-246.

[2] 孫寧. 羅氏沼蝦活蝦無(wú)水運(yùn)輸研究[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(5): 41-46.

[3] SELYE H. Stress and the general adaptation syndrome[J]. British Medical Journal, 1950, 17(1): 1383 -1392.

[4] 楊豐, 吳涵, 王逸鑫, 等. 羅氏沼蝦低溫有水保活試驗(yàn)[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 46(5): 601-607.

[5] 徐子涵. 凡納濱對(duì)蝦無(wú)水?；钸\(yùn)輸技術(shù)開(kāi)發(fā)和關(guān)鍵裝備研制[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2018: 67-75.

[6] BAL A, PANDA F, PATIA S G, et al. Modulation of physiological oxidative stress and antioxidant status by abiotic factors especially salinity in aquatic organisms[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2021, 241, 108971.

[7] 王彩霞, 白嬋, 李寧, 等. 不同降溫速率休眠的加州鱸無(wú)水保活品質(zhì)比較[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2020, 36(5): 129-138.

[8] 陳文秀. 蝦夷扇貝保活品質(zhì)變化與貯藏條件調(diào)控技術(shù)研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2020: 40-45.

[9] 郝爽, 張敏. 不同冷脅迫方式對(duì)縊蟶無(wú)水?；钇诳寡趸富钚约爸|(zhì)過(guò)氧化的影響[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 35(4): 584-590.

[10] 謝晶, 王琪. 水產(chǎn)動(dòng)物?；钸\(yùn)輸中環(huán)境脅迫應(yīng)激及生理調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2021, 42(1): 319-325.

[11] VERBERK C E P W, BUCHWALTER B D, KEFFORD J B. Energetics as a lens to understanding aquatic insect's responses to changing temperature, dissolved oxygen and salinity regimes[J]. Current Opinion in Insect Science, 2020, 41: 46-53.

[12] 徐德峰, 王雅玲, 孫力軍, 等. 降溫及生態(tài)冰溫條件對(duì)凡納濱對(duì)蝦無(wú)水存活時(shí)間的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(6): 101-107.

[13] XU Z H, REGENSTEIN J M, XIE D, et al. The oxidative stress and antioxidant responses ofto low temperature and air exposure[J]. Fish & shellfish immunology, 2018, 72: 564-571.

[14] XU Z, GUAN W, XIE D, et al. Evaluation of immunological response in shrimpsubmitted to low temperature and air exposure[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2019, 100: 103413.

[15] 潘魯青, 李彥飛. 注射病原菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白合成、酚氧化酶活力的影響[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2009, 39(5): 889-896.

[16] XU D F, YANG X Q, WANG Y L, et al. Cascading mechanism triggering the activation of polyphenol oxidase zymogen in shrimpafter postmortem and the correlation with melanosis development[J]. Food and Bioprocess Technology, 2020, 13(7): 1131-1145.

[17] 王夢(mèng)潔, 儲(chǔ)天琪, 劉峰, 等. 鹽度脅迫對(duì)小黃魚(yú) () 抗氧化酶、非特異性免疫酶和Na+/K+-ATP酶活力的影響[J]. 海洋學(xué)報(bào), 2021, 43(2): 59-66.

[18] ANUSHAA K D, JORGE M F., VISWANATH K. Acclimation of Zebrafish to transport stress[J]. Zebrafish, 2013, 10(1): 87-98.

[19] PICKERING A D, POTTINGER T G. Stress responses and disease resistance in salmonid fish: Effects of chronic elevation of plasma cortisol [J]. Fish Physiology and Biochemistry, 1989, 7(1-6): 253-258.

[20] 李亞娟, 王佳佳, 張才, 等. 海參酶解液對(duì)斑馬魚(yú)糖尿病并發(fā)抑郁樣行為的改善作用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(1): 84-89.

[21] 梁敏, 吉宏武, 郝記明, 等. 凡納濱對(duì)蝦在二氧化碳麻醉無(wú)水?；钸^(guò)程中呼吸代謝及免疫的變化[J]. 食品工業(yè)科技, 2018, 39(4): 280-284.

[22] 張洪淵, 萬(wàn)海清. 生物化學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2006: 35.

[23] 常玉梅, 曹鼎臣, 孫效文, 等. 低溫脅迫對(duì)鯉血清生化指標(biāo)的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2006, 19(2): 71-75.

[24] 冀德偉, 李明云, 王天柱, 等. 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)大黃魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2009, 28(1): 1-4.

[25] 黃建盛, 陸枝, 陳剛, 等. 急性低氧脅迫對(duì)軍曹魚(yú)大規(guī)格幼魚(yú)血液生化指標(biāo)的影響[J]. 海洋學(xué)報(bào), 2019, 41(6): 76-84.

[26] 楊豐, 王逸鑫, 沈思遠(yuǎn), 等. CO2麻醉處理對(duì)羅氏沼蝦保活的影響[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 35(6): 874-882.

[27] 史文競(jìng). 溫度影響下氨氮對(duì)克氏原螯蝦血淋巴和鰓組織中免疫指標(biāo)的影響[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2020: 35-38

Physiological Response and Metabolic Regulation ofExposed to Combination Stress of Acute Cold Exposure and Chronic Waterless Duration

XU De-feng, WU Jia-xin, SUN Li-jun, QIN Xiao-ming, FAN Xiu-ping

（////,524088,;,,116034,）

【Objective】To elucidate the physiological modulation mechanism ofin responseto a combination stress of acute cold exposure and chronic waterless duration during water-free transportation. 【Methods】Based on the simulation of transport practice, the changing profiles of typical biochemical indicators in hemolymph and hepatopancreas tissues were determined, and the histopathology injury was characterized. 【Results】The serum cortisol concentration significantly increased from the value of (326.90±4.61) pg/mL at AC group to (427.16±7.92) pg/mL at NC group (< 0.05), and the gradual decrease was observed at AC+WD groups. With the prolongation of combined stress of AC+WD, the glucose concentration reached the maximum of (26.31±1.05) mg/dL at 6 h in AC+WD group, while the maximum of lactic acid concentration (7.90±0.11) mmol/L was detected at 9 h (< 0.05). The concentrations of hemocyanin, urea nitrogen and creatinine in serum increased to some different degrees at AC and AC+WD groups. Although the concentration of total cholesterol and triglyceride decreased in a duration-dependent manner, the total protein concentration in serum elevated before 3 h and descend afterwards. The activities of aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, acid phosphatase and alkaline phosphatase in serum of shrimps elevated with the prolongation of combined stress and reached the maximum at 9 h. The above-detected at revived group exhibited regression towards the values at NC group. In addition, histopathological result suggested the impairment of hepatopancreas tissue during combined stress. Overall, these variations of biochemical indicators and histopathological impairment indicated that combined stress caused the disorder of substrate metabolism and induced the cytostructural degradation. 【Conclusion】Combined stress altered the physiology and substrate metabolism ofin a time dependent manner during waterless live transport and the obvious pathology injures in hepatopancreas tissue was observed, which consequently induced the mortality.

; waterless live transport; physiological stress; metabolic response; hepatopancreas

TS254.1

A

1673-9159（2022）01-0020-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.004

徐德峰，吳嘉鑫，孫力軍，等. 急冷與空氣暴露聯(lián)合脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生理代謝影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（1）：20-28.

2021-10-05

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2019YFD0901601）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31772048）；廣東海洋大學(xué)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C16396）

徐德峰（1978―），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品保鮮保活與高值化利用。E-mail: 13827198525@163.com；

吳嘉鑫（1996―），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閷?duì)蝦保活流通冷應(yīng)激生理響應(yīng)機(jī)制。E-mail：3336138343@qq.com

（責(zé)任編輯：劉朏）