單葉省藤材胞間層超微結(jié)構(gòu)及多糖組成*

文世濤 代琳心 劉杏娥 馬建鋒

(國際竹藤中心 竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100102)

依據(jù)化學(xué)組成和微纖絲取向差異，植物細(xì)胞通常分為胞間層、初生壁和次生壁，其中次生壁是細(xì)胞力學(xué)承載的主體(Gibson，2012)。當(dāng)植物細(xì)胞完成次生壁骨架結(jié)構(gòu)組裝后，便從胞間層區(qū)域開始其木質(zhì)化過程，木質(zhì)素沿初生壁向細(xì)胞腔方向逐漸沉積(Higuchi，1990；Donaldson，2001)。伴隨著木質(zhì)化過程的進(jìn)行，相鄰細(xì)胞通過胞間層區(qū)域(細(xì)胞角隅胞間層和復(fù)合胞間層)相互黏連在一起形成木質(zhì)部、韌皮部和維管束等植物組織(Grünwaldetal.，2002)。研究表明，當(dāng)木、竹、藤材作為工程材料使用時，其力學(xué)失效往往發(fā)生在胞間層與次生壁連接區(qū)域(Qinetal.，2018；Wangetal.，2018)；在制漿造紙過程中，胞間層區(qū)域木質(zhì)素的濃度和組成直接影響造紙工藝的選擇(Zhaoetal.，2018；Jinetal.，2019)。因此，胞間層區(qū)域的微納結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成對天然纖維原料實(shí)現(xiàn)高效利用具有重要影響。但受研究手段限制，學(xué)者們主要關(guān)注胞間層區(qū)域木質(zhì)素濃度及其組成結(jié)構(gòu)單元差異，而該區(qū)域的超微結(jié)構(gòu)及多糖組成鮮見報(bào)道(Kimetal.，2015；Mellerowiczetal.，2001)。

目前，關(guān)于棕櫚藤微觀結(jié)構(gòu)的研究主要聚焦于其解剖結(jié)構(gòu)(組織比量、維管束分布、微纖絲取向)和超微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞次生壁分層結(jié)構(gòu)、壁層厚度)隨藤種、生長周期、藤莖高度等因子的變異規(guī)律方面(Bhatetal.，1993；Schmittetal.，1995；Abasoloetal.，2000)，僅見劉杏娥等(2017)利用分子光譜成像技術(shù)分析了黃藤(Daemonoropsmargaritae)材細(xì)胞壁木質(zhì)素分布，國內(nèi)外未有關(guān)于藤材細(xì)胞間層超微結(jié)構(gòu)及多糖組成的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究以我國重要商業(yè)藤種——單葉省藤(Calamussimplicifolius)為研究對象，采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)和共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，對酸性亞氯酸鈉溶液處理的藤莖橫切面切片進(jìn)行成像研究，分析不同類型細(xì)胞間層的微納結(jié)構(gòu)特征及多糖組成特點(diǎn)，旨在深入理解藤材細(xì)胞壁生物合成規(guī)律和力學(xué)失效機(jī)制，為藤材增韌改性以及高性能藤基復(fù)合材料開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

多年生單葉省藤采自廣西憑祥熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心林場。從基部至梢部第5節(jié)節(jié)間截取完整藤莖，利用單面刀片切取靠近藤皮部分0.5 cm(長)×0.5 cm(寬)×1.0 cm(高)的樣品塊，使用滑走式切片機(jī)(Leica RM 2010R)切取15 μm厚樣品橫切面切片，保存于去離子水中供共聚焦顯微拉曼光譜成像用。

1.2 試樣制備

切取0.2 cm(長)×0.2 cm(寬)×1.0 cm(高)的藤莖置于0.5 mol·L-1亞氯酸鈉溶液中，75 ℃水浴鍋內(nèi)處理1.0 h，15 μm厚樣品橫切面切片在相同條件下進(jìn)行脫木質(zhì)素處理。反應(yīng)結(jié)束后，小心取出藤莖和切片，用去離子水反復(fù)沖洗至中性備用。

1.3 試樣觀測

1.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)成像 部分脫除木質(zhì)素的藤莖經(jīng)無水乙醇梯度脫水后，采用Spurr低黏度樹脂逐級滲透，經(jīng)100%樹脂滲透5 h的樣品條置于包埋板中，70 ℃烘箱固化24 h。頂端修整為梯形的包埋塊，使用超薄切片機(jī)(Leica EM-UC6)切取90 nm厚切片撈于覆膜銅網(wǎng)上備用，切片用鉆石刀為Diatome-Ultra 45°。室溫下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾對切片染色5 min，蒸餾水反復(fù)沖洗3遍后自然晾干。利用JEM-1230透射電子顯微鏡在80 kV工作電壓下成像。

1.3.2 共聚焦顯微拉曼光譜成像 將15 μm厚樣品橫切面切片置于載玻片上，用無污染的勾線筆將切片平整展開，吸水紙吸取切片周圍多余水分，重新滴一滴去離子水，蓋玻片封片。采用共聚焦顯微拉曼光譜(LabRAM HR Evolution，HORIBA Jobin Yvon)進(jìn)行光譜采集和成像，激發(fā)波長選擇532 nm，到達(dá)樣品的激光功率8 mW，測試光柵300 mm-1，狹縫寬度100 μm，掃描步距0.5 μm，單點(diǎn)光譜采集時間1 s，光譜測定范圍3 100～300 cm-1，光譜分辨率2 cm-1。為得到較高的空間分辨率，采用100倍油鏡(MPlan 100×Oil,NA=1.40；Olympus，Tokyo，Japan)進(jìn)行顯微成像。利用LabSpec6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整體基線校正和光譜去卷積處理，并對特征峰峰面積進(jìn)行成像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤材細(xì)胞間層的超微結(jié)構(gòu)

TEM成像發(fā)現(xiàn)，單葉省藤材細(xì)胞具有類似于禾本科(Poaceae)毛竹(Phyllostachysedulis)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(馮龍等，2020)，也可分為胞間層、初生壁和次生壁，其纖維細(xì)胞(圖1a)和薄壁細(xì)胞(圖1b)的角隅胞間層(cell corner middle lamella，ccml)和復(fù)合胞間層(compound middle lamella，cml，由初生壁和胞間層共同構(gòu)成)均呈現(xiàn)較高的電子密度，主要源于雙染色劑與高濃度木質(zhì)素特異性結(jié)合。從圖1a 和1c可以看出，木質(zhì)素脫除存在明顯的選擇性，相較于cml區(qū)域，高度木質(zhì)化ccml區(qū)域的木質(zhì)素更易脫除。木質(zhì)素脫除亦受細(xì)胞類型影響，與相鄰纖維細(xì)胞間的角隅胞間層(cell corner middle lamella among adjacent fibers，ff-ccml)和復(fù)合胞間層(compound middle lamella among adjacent fibers，ff-cml)相比，纖維細(xì)胞與薄壁細(xì)胞構(gòu)成的角隅胞間層(cell corner middle lamella between fiber and parenchyma，fp-ccml)和復(fù)合胞間層(compound middle lamella between fiber and parenchyma，fp-cml)區(qū)域的木質(zhì)素更難脫除。部分脫除木質(zhì)素后，ff-ccml和ff-cml暴露出相互交聯(lián)的多孔纖絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖1d箭頭所指區(qū)域)，部分纖維細(xì)胞中初生壁與次生壁之間發(fā)生層狀剝離，暴露出疏松的纖絲狀結(jié)構(gòu)(圖1e)，而在其他區(qū)域整個間層完整剝離出來(圖1f)。同樣，在木、竹材的胞間層區(qū)域也具有類似的多孔結(jié)構(gòu)，且孔隙間距受區(qū)域微纖絲致密程度影響(Suzukietal.，2001；Kimetal.，2015)。與纖維細(xì)胞不同，薄壁細(xì)胞間層則發(fā)生明顯潤脹和形變(圖1c)。

圖1 藤莖橫切面TEM圖像Fig.1 TEM image of cross section of rattan stema:對照組纖維細(xì)胞；b:薄壁細(xì)胞；c、d、e、f:脫除木質(zhì)素樣品。ff-ccml：纖維細(xì)胞間角隅胞間層；pp-ccml：薄壁細(xì)胞間角隅胞間層；fp-ccml：纖維和薄壁細(xì)胞間角隅胞間層；ff-cml：纖維細(xì)胞間復(fù)合胞間層；pp-cml：薄壁細(xì)胞間復(fù)合胞間層；fp-cml：纖維和薄壁細(xì)胞間復(fù)合胞間層;f-s：纖維細(xì)胞次生壁；p-s：薄壁細(xì)胞次生壁；pw：初生壁。下同。a:Control fiber;b:Parenchyma;c,d,e,f:Delignified sections of rattan cane.ff-ccml:Cell corner middle lamella among adjacent fibers;pp-ccml:Cell corner middle lamella among adjacent parenchyma;fp-ccml:Cell corner middle lamella between fiber and parenchyma;ff-cml:Compound middle lamella among adjacent fibers;pp-cml:Compound middle lamella among adjacent parenchyma;fp-cml:Compound middle lamella between fiber and parenchyma;f-s:Fiber secondary wall;p-s:Parenchyma secondary wall;pw:Primary wall.The same below.

2.2 藤材細(xì)胞間層拉曼光譜分析

圖2a為藤材纖維和薄壁細(xì)胞不同形態(tài)區(qū)域的拉曼光譜，可以看出藤材細(xì)胞角隅胞間層(ccml)、復(fù)合胞間層(cml)和次生壁(secondary wall，s)拉曼光譜特征峰主要出現(xiàn)在2 942 cm-1(纖維素、半纖維素及木質(zhì)素C—H非對稱伸縮振動)、2 897 cm-1(碳水化合物C—H、H—C—H伸縮振動)、1 598 cm-1(木質(zhì)素芳香環(huán)對稱伸縮振動)、1 094 cm-1(纖維素C—O—C非對稱伸縮振動)、854 cm-1(果膠)、380 cm-1(纖維素O—H振動)等處(Agarwaletal.，1986；Bocketal.，2020；Gierlingeretal.，2012；Gierlinger，2018；Synytsyaetal.，2003)，多糖及木質(zhì)素特征峰歸屬見表1。

表1 細(xì)胞壁多糖及木質(zhì)素拉曼特征峰歸屬Tab.1 Raman band assignments of cell wall polysaccharides and lignin

對比不同形態(tài)區(qū)域與多糖相關(guān)的拉曼特征峰可以看出，纖維細(xì)胞次生壁(fiber secondary wall，f-s)和薄壁細(xì)胞次生壁(parenchyma secondary wall，p-s)存在較明顯的纖維素(380 cm-1)信號，而薄壁細(xì)胞間角隅胞間層(cell corner middle lamella among adjacent parenchyma，pp-ccml)和薄壁細(xì)胞間復(fù)合胞間層(compound middle lamella among adjacent parenchyma，pp-cml)存在較強(qiáng)的果膠類物質(zhì)(854 cm-1)信號。1 247 cm-1和1 318 cm-1為木聚糖特征峰(Agarwaletal.，1997；Kaurkovetal.，1999)，對1 210～1 510 cm-1進(jìn)行光譜去卷積處理，可以清楚區(qū)分出1 318 cm-1木聚糖特征峰，1 247 cm-1因與相鄰1 268 cm-1特征峰峰位具有較多重疊難于區(qū)分(圖2b)。

圖2 細(xì)胞壁不同形態(tài)區(qū)域拉曼光譜(a)及纖維細(xì)胞次生壁光譜去卷積(b)Fig.2 Average Raman spectra extracted from various cell wall layers (a)and deconvoluted spectra from fiber secondary wall (b)

2.3 藤材細(xì)胞間層拉曼光譜成像分析

2.3.1 細(xì)胞間層形態(tài)成像 藤材纖維細(xì)胞壁具有典型的胞間層和次生壁分層結(jié)構(gòu)，且次生壁呈現(xiàn)出寬窄交替的同心層狀結(jié)構(gòu)(厚度0.3～0.4 μm)(圖3a、b)。對碳水化合物及木質(zhì)素C—H伸縮振動特征峰區(qū)域(2 789～3 000 cm-1)進(jìn)行積分發(fā)現(xiàn)，纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞以及細(xì)胞不同形態(tài)區(qū)域(ccml、cml、f-s和p-s)清晰可見(圖3c)。

圖3 藤材纖維細(xì)胞(a)和薄壁細(xì)胞(b)TEM圖像及細(xì)胞形態(tài)顯微拉曼光譜成像(c)Fig.3 TEM images showing wall ultrastructure of rattan fiber (a)and parenchyma (b)as well as Raman image showing the morphology of fiber and parenchyma (c)

2.3.2 細(xì)胞間層組分成像 作為細(xì)胞壁主要組分之一，木質(zhì)素賦予了植物組織優(yōu)良的力學(xué)強(qiáng)度。對木質(zhì)素芳香環(huán)伸縮振動特征峰區(qū)域(1 540～1 700 cm-1)進(jìn)行積分，可以觀察到2種類型細(xì)胞壁層木質(zhì)素不均一地脫除，細(xì)胞間層區(qū)域的木質(zhì)素移除程度高于次生壁(圖4a)。對纖維素—OH特征峰區(qū)域(334～404 cm-1)進(jìn)行積分，可以觀察到纖維素在細(xì)胞間層區(qū)域濃度較低，主要均一地分布于細(xì)胞次生壁中(圖4b)。對木聚糖特征峰區(qū)域(1 301～1 328 cm-1)進(jìn)行積分，可以觀察到木聚糖主要沉積于纖維細(xì)胞次生壁(f-s)、薄壁細(xì)胞次生壁(p-s)和角隅胞間層(ccml)中(圖4c)，角隅胞間層區(qū)域木聚糖的沉積主要?dú)w因于木聚糖的生物合成起始于初生壁以及次生壁外側(cè)臨近角隅胞間層的區(qū)域(Kimetal.，2010；Mortimeretal.，2015)，次生壁中高濃度木聚糖主要是由于半纖維素與木質(zhì)素間存在復(fù)雜的酯鍵和醚鍵連接，酯鍵在酸性條件下很難斷裂，進(jìn)而保留了部分木聚糖(Terrettetal.，2019)。對果膠類物質(zhì)特征峰區(qū)域(830～860 cm-1)進(jìn)行積分，可以觀察到果膠類物質(zhì)在薄壁細(xì)胞次生壁(p-s)和薄壁細(xì)胞間復(fù)合胞間層(pp-cml)中廣泛分布(圖4d)，這些區(qū)域果膠的存在有利于細(xì)胞壁延展特性的維持(Cosgroveetal.，2018)。

圖4 藤材纖維細(xì)胞和薄壁細(xì)胞木質(zhì)素(a)、纖維素(b)、木聚糖(c)及果膠類物質(zhì)(d)顯微拉曼光譜成像Fig.4 Raman images showing the lignin (a),cellulose (b),xylan (c)and pectin (d)distribution within the fiber and parenchyma wall

3 結(jié)論

整合TEM與共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)，能夠成功揭示出藤材纖維細(xì)胞和薄壁細(xì)胞壁間層的超微結(jié)構(gòu)特征及多糖組成特點(diǎn)。部分脫除木質(zhì)素后，纖維細(xì)胞間的角隅胞間層呈現(xiàn)交聯(lián)的纖絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而薄壁細(xì)胞間層區(qū)域發(fā)生潤脹，細(xì)胞間隙增大?；瘜W(xué)成像進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞間層區(qū)域中富含果膠類物質(zhì)和少量木聚糖，而纖維素較為均一地分布于細(xì)胞次生壁中。