廣東惠州地區(qū)609例血紅蛋白Constant Spring的血液學(xué)與基因型分析

官志揚(yáng) 陳迪娜 鐘澤艷 賀海林 陳劍虹

血紅蛋白Constant Spring（hemoglobin Constant Spring，Hb CS）是我國南方地區(qū)最常見的非缺失型α-地中海貧血（以下簡稱地貧）［1-2］。Hb CS是由于α2-珠蛋白基因第142 位的終止密碼子TAA 突變?yōu)镃AA，從而使生成的α 鏈比正常α 鏈延長了31 個(gè)氨基酸，合成了具有172 個(gè)氨基酸的α 鏈。該延長的α 鏈非常不穩(wěn)定，易降解，從而使α 鏈減少，屬地中海貧血樣變異［3］。由于Hb CS 合并不同基因型時(shí)臨床表征輕重不一，可表現(xiàn)為輕型、中間型甚至重型。惠州市位于廣東省珠三角地區(qū)，常住人口達(dá)488 萬人，是地貧的高發(fā)地區(qū)之一。本研究通過分析惠州地區(qū)609 例Hb CS 病例，總結(jié)其血液學(xué)表型和基因型之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2014年9月至2019年12月在本院進(jìn)行地貧基因檢測的患者共76 283 例（包括在本院就診和惠州市轄縣區(qū)醫(yī)院就診），選取其中明確診斷為Hb CS 的609 例患者作為研究對象，其中男237 例，平均年齡（27.26±8.37）歲，女372 例，平均年齡（26.18±7.51）歲。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

日本希森美康公司XN-10 血細(xì)胞分析儀，法國Sebia 公司Capillarys 2 flex piercing 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀，廈門百維信生物公司Lab-Aid 824核酸提取儀，美國ABI 公司Veriti Dx PCR 擴(kuò)增儀，美國Luminex公司Luminex Magpix 液態(tài)懸浮芯片檢測儀。血常規(guī)及電泳試劑均為儀器配套；DNA 提取試劑盒購自廈門致善生物公司；核酸提取儀（DA Smart32 型）、全基因組DNA提取試劑盒、地中海貧血（α/β型）基因檢測試劑盒均購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

采集待檢者的靜脈血兩管（2 mL/管），一管以乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，用于血常規(guī)分析；一管以酸性檸檬酸葡萄糖（ACD）抗凝，用于血紅蛋白電泳分析及DNA 提取。

1.3.2 血液學(xué)分析

使用血細(xì)胞分析儀檢測紅細(xì)胞參數(shù)，主要觀察指標(biāo)為血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume，MCV）及平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）；使用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀分析血紅蛋白組分及含量。其中，外院樣本的血液學(xué)分析在當(dāng)?shù)乜h區(qū)醫(yī)院完成。

1.3.3 DNA 提取

使用Lab-Aid 824 核酸提取儀和DA Smart32型核酸提取儀，配套使用相應(yīng)的DNA 提取試劑盒提取全血DNA。

1.3.4 地貧基因分析

獲取的全血DNA 采用地中海貧血（α/β 型）基因檢測試劑盒，使用懸浮陣列技術(shù)進(jìn)行地貧基因分析，具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑說明書和儀器操作使用說明書進(jìn)行操作。對罕見異常血紅蛋白樣本行α-或β-珠蛋白基因測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（）表示，采用One-Way ANOVA比較。計(jì)數(shù)資料采用n表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hb CS 的人群發(fā)生率及基因型構(gòu)成比

在76 283 例樣本中檢測出Hb CS 609 例，人群發(fā)生率為0.798%（609/76283）。研究中共檢出18種基因型，其中Hb CS 雜合子最多，占82.923%，Hb CS-H 病次之，占4.269%。見表1。

表1 廣東惠州地區(qū)人群Hb CS 的發(fā)生率及構(gòu)成比Table 1 The incidence and constituent ratio of Hb CS in Huizhou area of Guangdong Province

2.2 血液學(xué)參數(shù)結(jié)果

按基因突變類型分為5 組，分別為αCSα/αα組、αCSα/α+組、Hb CS-H 組、αCSα/αα，β0/ βN組和αCSα/αα，β+/ βN組，其血液學(xué)分析及其它基因型的血液學(xué)分析見表2。

經(jīng)毛細(xì)管電泳分析，Hb CS 合并β 地貧雜合子樣本均未檢出Hb CS 波峰；Hb CS-H 病均檢出Hb CS 波峰，且同時(shí)檢出Hb H 或Hb Bart's 波峰；505 例Hb CS 雜合子樣本中只有161 例檢出Hb CS 波峰，檢出率為31.9%，含量為0.3%～2.1%；部分新生兒雖未檢出Hb CS 波峰，但檢出Hb Bart's波峰。其它基因型Hb CS 波峰檢出情況及含量見表2。

表2 不同類型基因型Hb CS 樣本的血液學(xué)參數(shù)Table 2 The hematological parameters of Hb CS samples with different genotypes

2.3 基因型與血液學(xué)表型比較分析

因αCSα/αα，β+/ βN組只有3 例樣本，不具代表性，故將以上劃分的其余4 組基因型的血液學(xué)參數(shù)結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，各組間的Hb A2差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4 種類型基因型Hb CS 樣本的血液學(xué)參數(shù)比較分析Table 3 Comparative analysis of hematological parameters of Hb CS samples in four different genotypes

3 討論

Hb CS 是α 地貧的一種特殊突變類型，其突變導(dǎo)致合成的Hb CS 鏈極不穩(wěn)定，易被破壞。Hb CS雜合子在臨床上可無癥狀，但當(dāng)其合并其它不同地貧的基因突變時(shí)，臨床表現(xiàn)存在較大差異。Hb CS純合子表型各異，可以無明顯血液學(xué)變化，也可以表現(xiàn)為Hb CS-H ?。?］，甚至可以表現(xiàn)為水腫胎［5-6］。

本研究共檢出609 例Hb CS，人群發(fā)生率為0.798%，高于廣東省平均水平（0.304%）［7］以及廣州地區(qū)（0.338%）［8］、東莞地區(qū)（0.319%）［9］和肇慶地區(qū)（0.169%）［10］，略低于河源地區(qū)（0.881%）［11］。本研究共檢出18 種基因型，各基因型的頻率與以往廣東地區(qū)人群的地貧基因頻率的報(bào)道基本一致［7］。以Hb CS 雜合子為主，Hb CS 復(fù)合的α 地貧以--SEA為主，Hb CS 合并的β 地貧以βCD41-42和βCD17為主。

Hb CS 復(fù)合α+-地貧表現(xiàn)為輕型地貧，Hb CS-H病大多數(shù)表現(xiàn)為中度貧血，少數(shù)可表現(xiàn)為重度貧血。He 等［12］曾報(bào)道，Hb CS-H 病的胎兒出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，表明Hb CS-H 病的臨床表現(xiàn)存在個(gè)體差異。這可能是Hb CS-H 病不僅僅受α 珠蛋白基因突變的影響，還有可能受環(huán)境因素的影響。本研究中的兩例Hb CS 純合子均表現(xiàn)為輕度貧血，MCV 和MCH 正常或稍降低，而Hb CS 異常升高，均達(dá)到5%以上，與陳萍等［4］的研究一致。

Hb CS 合并β 地貧均表現(xiàn)為輕度貧血，Hb A2均大于3.5%，且均未檢出Hb CS 波峰，呈現(xiàn)出β 地貧的血液學(xué)特征，而將α 地貧特征掩蓋，與Jiang等［13］的研究結(jié)果一致。在兩例再復(fù)合α+-地貧時(shí)，一例未能檢出Hb CS 波峰，一例能檢出Hb CS 波峰，但Hb CS 含量很低，只有0.4%，說明突變的α鏈和β 鏈得以重新保持相對平衡。有研究報(bào)道，Hb CS-H 病合并β 地貧表現(xiàn)為中度貧血，且能檢出Hb Bart's［14］。而本研究的三例Hb CS-H 病合并β地貧均表現(xiàn)為輕度貧血，未檢出Hb Bart's，但MCV 和MCH 都很低，說明Hb CS-H 病合并β 地貧可能是Hb CS-H 病導(dǎo)致α 鏈合成嚴(yán)重減少，而β地貧導(dǎo)致β 鏈合成也減少，緩解了α/β 鏈的嚴(yán)重失衡，在低水平保持相對平衡，也許正是如此，均未檢出Hb H 和Hb Bart's。再者，三例的血紅蛋白電泳結(jié)果中，Hb A2數(shù)值差異性大，一例＜2.5%，一例＞3.5%，一例正常且能檢出Hb CS 波峰，含量為1.7%，表明Hb CS-H 病合并β 地貧患者存在明顯的個(gè)體差異性，當(dāng)突變的α 鏈和β 鏈能得以重新達(dá)到相對平衡，則能檢出Hb CS 波峰。

值得注意，本研究中Hb CS 合并Hb New York表現(xiàn)為輕型地貧，而Hb CS 合并Hb J-Bangkok 以及Hb CS 復(fù)合αWSα 合并Hb J-Bangkok 均無明顯血液學(xué)改變。Hb New York 和Hb J-Bangkok 都是β 鏈上突變形成的異常Hb。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［15］，單純Hb New York 和Hb J-Bangkok 的表型正常，但本研究中似乎是Hb J-Bangkok 能平衡Hb CS 對血液學(xué)的影響，而Hb New York 無法平衡Hb CS 對血液學(xué)的影響。但這都是個(gè)案，需收集更多的樣本進(jìn)一步研究。Hb CS 合并Hb E 表現(xiàn)為輕型地貧（Hb121g/L，MCV77.8fL，MCH26.5pg），但在李友瓊等［16］的研究病例中Hb CS 合并Hb E 表現(xiàn)為中度貧血，兩個(gè)病例的血液學(xué)表現(xiàn)不一致，分析也許是前人的病例還存在有其他因素造成了貧血的加重。

因血紅蛋白電泳能檢出Hb CS，故常被用作Hb CS 的初步篩查。但本研究中，只有31.9%的Hb CS 雜合子能檢出Hb CS 波峰，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于韋媛等［17］的研究。主要原因是，本研究大部分樣本的地貧篩查數(shù)據(jù)來自于縣級醫(yī)院，而縣級醫(yī)院從事血紅蛋白電泳檢測的部分檢驗(yàn)者未經(jīng)進(jìn)修學(xué)習(xí)，只會判讀常規(guī)的血紅蛋白及一些容易判讀的異常血紅蛋白（如Hb H 和Hb Bart's 等），而對于較難判讀的異常血紅蛋白的結(jié)果判讀水平欠佳；或者是Hb A2降低，檢驗(yàn)者認(rèn)為該結(jié)果已經(jīng)是地貧篩查陽性，常規(guī)建議行α 地貧基因檢測，故將無把握判讀的C 區(qū)域波峰刪去；再者是由于毛細(xì)管老化，Hb CS 含量過低，系統(tǒng)未能自動(dòng)讀數(shù)，檢驗(yàn)者容易忽略；從而造成很多在C 區(qū)域的波峰結(jié)果漏報(bào)。

綜上所述，惠州地區(qū)是地貧的高發(fā)地區(qū)之一，Hb CS 發(fā)生率較高，本研究能在一定程度上補(bǔ)充該地區(qū)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。通過對該地區(qū)人群行婚前孕前地貧篩查，對篩查陽性者行地貧基因診斷，對夫妻同型地貧基因攜帶者行產(chǎn)前基因診斷，能有效減少重型地貧患兒的出生，從而減少出生缺陷。當(dāng)Hb CS 合并其它地貧的基因突變時(shí)，臨床表現(xiàn)有較大差異。本研究通過對Hb CS 的血液學(xué)表型與基因型分析，為臨床醫(yī)生提供遺傳咨詢提供參考，同時(shí)有助于完善惠州地區(qū)的地貧防控工作。