生脈散對(duì)心衰大鼠心肌重塑及TGF-β1∕Smad3信號(hào)通路的影響*

趙 地 趙 添 趙 卓 高 妍 董振飛 王世軍△

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250031；2.山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250001；3.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355）

心力衰竭是多種心臟疾病導(dǎo)致的心臟功能異常，是眾多心臟病的終末期表現(xiàn)形式[1]。研究表明，心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心室重構(gòu)，而心肌肥厚和心肌纖維化是其重要的病理基礎(chǔ)[2]。心肌肥厚主要以心肌細(xì)胞體積增大、蛋白質(zhì)的間質(zhì)成分改變，同時(shí)伴有心室形態(tài)結(jié)構(gòu)減退為主要病理特征，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，心肌纖維化可以導(dǎo)致心肌僵硬度增加、順應(yīng)性降低和心臟的舒縮功能下降，預(yù)防心室重構(gòu)已經(jīng)成為心力衰竭治療的主要靶點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）∕Smad3經(jīng)典通路參與了所有心血管相關(guān)的疾病，在心肌纖維化過(guò)程中該信號(hào)通路起主導(dǎo)作用[4]。故干預(yù)TGF-β1∕Smad3通路可能有助于延緩心肌纖維化進(jìn)展。

中醫(yī)學(xué)把本病歸于“心悸”“喘證”“水腫”等范疇?；颊叱Ｓ行募隆舛?、乏力、自汗或盜汗、舌紅少苔、脈細(xì)無(wú)力等表現(xiàn)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)氣虛、陰虛為慢性心力衰竭的重要證候要素[5]。生脈散是益氣養(yǎng)陰的名方，由人參、麥冬、五味子組成。研究表明，生脈散可用于治療心力衰竭和改善心功能的作用[6]，但其作用機(jī)制仍不清楚。本研究探討生脈散是否通過(guò)抑制TGF-β1∕Smad 3表達(dá)改善心衰大鼠的心肌重構(gòu)，為生脈散的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SPF級(jí)SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g，8～10周齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0028，飼養(yǎng)于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所，在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中飼養(yǎng)，食水充足，保持溫度22～25℃，自由取食。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2019-1222）。

1.2 試藥及儀器 人參、麥冬、五味子購(gòu)自山東省醫(yī)科院藥物所，厄貝沙坦（賽諾菲公司，批號(hào)SM20190813），HE染色試劑盒（C0105）、RIPA裂解液（P015B）、Masson染色試劑盒（SBJ-0288）購(gòu)自南京森貝伽生物公司，Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）（F1062）、Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）（F1055）試劑盒購(gòu)自濟(jì)南立言公司，TGF-β1（ab92486）、Smad3（RLM3123）、p-Smad3（RLP0585）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，GAPDH（5174）購(gòu)自美國(guó)CST公司。儀器DM3000型光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司），Vevo2100型小動(dòng)物超聲系統(tǒng)（加拿大Visual Son公司），ES-2型紫外光度儀（日本Malcom公司），EPS-300型電脈儀與轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)伯樂公司），CM1950冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；Stepone熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。生脈散的制備：根據(jù)文獻(xiàn)研究[7]方中各藥物用量為人參9 g，麥冬9 g，五味子6 g。稱取以上藥物，加純凈水浸泡1 h后煮沸，將藥液濾出，再次煎煮30 min，將2次煎煮藥液混合。大鼠灌胃劑量按照成人的用量∕70 kg×6.3，配制成生藥濃度為0.25 g∕mL的生脈散灌胃溶液，大鼠灌胃劑量為2.5 g（∕kg·d）[8]。

1.3 造模與分組 誘導(dǎo)大鼠心力衰竭模型：腹腔注射0.08%戊巴比妥鈉（40 mg∕kg）麻醉，氣管切開插管后，以胸骨左緣第2肋間隙切開約1～1.5 cm切口。剪斷肋骨，打開胸腔，暴露主動(dòng)脈弓，與主動(dòng)脈弓平行放置28號(hào)針頭，結(jié)扎使主動(dòng)脈狹窄約60%～70%，縫合切口，等待大鼠蘇醒。對(duì)照組采用相同步驟，但不結(jié)扎主動(dòng)脈。術(shù)后4周行超聲評(píng)價(jià)左室射血分?jǐn)?shù)（EF）＜50%為造模成功[9]。對(duì)照組和模型組給予[10 mL（∕kg·d）]生理鹽水灌胃，生脈散低劑量組給予2.5 g（∕kg·d）的中藥灌胃；生脈散高劑量組給予5.0 g（∕kg·d）中藥灌胃，厄貝沙坦給予15 mg（∕kg·d）混懸液灌胃，連續(xù)給藥8周。

1.4 標(biāo)本采集 1）藥物干預(yù)8周，禁食、不禁水12 h，稱重，腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血5 mL，3 000 r∕min離心10 min，留取血漿，置于-20℃冰箱保存待測(cè)。采血后處死大鼠，摘取心臟，留取左室心肌組織，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，用于病理染色，剩余心肌組織轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

1.5 觀察指標(biāo) 1）心功能指標(biāo)檢測(cè)：大鼠麻醉后，仰臥固定，用超聲心動(dòng)圖儀10 MHz高頻探頭置于左胸骨旁，顯示左室長(zhǎng)軸切面，獲得M型超聲心動(dòng)圖，測(cè)定左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、EF、短軸收縮率（FS）。連續(xù)記錄3個(gè)心動(dòng)周期數(shù)據(jù)。2）HE染色觀察心臟組織學(xué)：4%多聚甲醛固定心臟組織48 h后，乙醇梯度脫水進(jìn)行石蠟包埋，切成3～4 μm的石蠟薄片進(jìn)行HE染色。3）Masson染色觀察心臟纖維化：制成石蠟切片后常規(guī)脫蠟，復(fù)染并梯度脫水后，用中性樹膠封片，于光鏡下觀察心肌纖維化情況。4）實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）檢測(cè)膠原蛋白collagenⅠ、collagenⅢ的表達(dá)：取約100 mg心肌組織，用TRIzol法提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，應(yīng)用Takara反轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)。通過(guò)溶解曲線，基因測(cè)序確定產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，mRNA表達(dá)程度采用相對(duì)定量計(jì)算。將β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列如下：CollagenⅠ上游：5'-TGCTCATAGCAGCCCCCTCCG-3'，下游：5'-TCCTTGACTTGGGAAGGTT-3'。CollagenⅢ上游：5'-AGGCCAATGGCAATGTAAAG-3'，下游：5'-TGTCTTGCTCCATTCACCAG-3'。β-actin上游：5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3'，下游：5'-TGTC TTGCTCCATTCACCAG-3'。5）Western blotting檢測(cè)：收集100 g組織勻漿后，加入RIPA細(xì)胞裂解液1 mL，冰上裂解30 min，取上清液，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，上樣后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h后，按計(jì)算好的蛋白濃度，依次加樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)模、恒溫封，加入稀釋好的一抗TGF-β1（1∶3 000）、Smad3（1∶2 000）、p-Smad3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）的單克隆一抗4℃孵育PVDF膜過(guò)夜，室溫孵育二抗2 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影條帶，用Image J量化蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Graphpad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠基本情況 見圖1。藥物干預(yù)8周后，對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，攝食攝水正常，反應(yīng)靈敏，毛色有光澤，精神狀態(tài)好，未見異常反應(yīng)，無(wú)死亡。模型組大鼠術(shù)后隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)出毛發(fā)無(wú)光澤，活動(dòng)力降低、呼吸急促、食欲下降，精神萎靡且易怒，死亡2只。給予藥物干預(yù)的大鼠的狀況較模型組有好轉(zhuǎn)，體重增加，攝食攝水正常，反應(yīng)正常，無(wú)死亡。超聲心動(dòng)圖顯示，模型組LVIDd、LVIDs明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），表明心衰模型建立成功。

圖1 大鼠心臟M型超聲心動(dòng)圖切面圖像

2.2 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)超聲參數(shù)比較 見表1，圖1。與對(duì)照組相比，模型組大鼠LVIDd、LVIDs明顯升高（P＜0.01），LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，生脈散低、高劑量組LVIDd、LVIDs降低（P＜0.01），LVEF、LVFS升高（P＜0.01），厄貝沙坦組LVIDd、LVIDs降低（P＜0.01），LVEF、LVFS升高（P＜0.01）。提示生脈散可以減輕心衰大鼠心室代償性增大，改善其心功能。

表1 各組大鼠心臟超聲參數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠心臟超聲參數(shù)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同。

組 別n LVIDd（mm）LVIDs（mm）LVEF（%）LVFS（%）對(duì)照組模型組生脈散低劑量組生脈散高劑量組厄貝沙坦組10 10 10 10 10 5.92±0.15 8.46±0.22△6.74±0.37**6.12±0.43*6.36±0.12*2.28±0.21 5.55±0.38△4.73±0.22*3.57±0.36*3.52±0.44*80.31±3.21 55.77±4.52△65.27±8.24*74.55±7.56*70.28±6.26*50.33±6.34 30.69±5.32△36.74±4.33*40.62±2.35*38.4±3.35*

2.3 各組大鼠心臟組織HE染色結(jié)果 見圖2。鏡下可見，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)清晰、心肌細(xì)胞染色均勻、整齊，未見明顯細(xì)胞增大。模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞腫大、細(xì)胞核增大，間質(zhì)可見纖維結(jié)締組織增生并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。生脈散低劑量組和厄貝沙坦組心肌細(xì)胞排列較紊亂，局部有心肌細(xì)胞增大，伴有零星炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；生脈散高劑量組心肌細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠心臟組織Masson染色結(jié)果 見圖3。光鏡下可見Masson染色后心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。對(duì)照組心肌纖維排列整齊，橫紋較清楚，肌纖維連接完好。而模型組心肌肌束間隙增大，心肌細(xì)胞間質(zhì)可見明顯纖維化改變，伴嚴(yán)重膠原沉積。生脈散高劑量組：肌纖維排列整齊，可見極少量的膠原纖維。生脈散低劑量組和厄貝沙坦組：肌纖維排列局部紊亂，觀察到少量膠原纖維沉積。

圖3 各組大鼠心肌組織（Masson染色，200倍）

2.5 各組大鼠心肌collagenⅠ、collagenⅢ的表達(dá)水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌中collagenⅠ、collagenⅢ的含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，生脈散組、厄貝沙坦組大鼠心肌中collagenⅠ、collagenⅢ的含量顯著減少（P＜0.01）

表2 各組大鼠collagenⅠ、collagenⅢ表達(dá)水平比較（ng∕mg，±s）

表2 各組大鼠collagenⅠ、collagenⅢ表達(dá)水平比較（ng∕mg，±s）

組別對(duì)照組模型組生脈散低劑量組生脈散高劑量組厄貝沙坦組n 10 10 10 10 10 collagenⅠ0.33±0.15 1.22±0.25△0.80±0.14**0.63±0.04*0.60±0.02*collagenⅢ0.19±0.02 0.80±0.03△0.45±0.05*0.32±0.06*0.30±0.04*

2.6 各組大鼠心肌TGF-β1、Smads3和p-Smad3蛋白表達(dá)比較 見圖4。模型組大鼠心肌組織中TGF-β1和p-Smad3蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（均P＜0.01）；與模型組比較，生脈散高劑量組和厄貝沙坦組大鼠心肌組織中TGF-β1和p-Smad3蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)（均P＜0.05）。

圖4 各組大鼠TGF-β1、Smads3的蛋白表達(dá)

3 討 論

心力衰竭是一組復(fù)雜的臨床綜合征，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及特征，可歸屬中醫(yī)學(xué)“喘證”“痰飲”“心悸”“心脹”等范疇?！鹅`樞·脹論》言“心脹者、煩心、短氣、臥不安”。心脹日久則耗傷心氣、心陰，出現(xiàn)短氣、煩心，嚴(yán)重者則不得安臥。當(dāng)代諸多醫(yī)家認(rèn)為其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，本虛為心氣虛，標(biāo)實(shí)為瘀血、水飲停留。心氣虧損是心陰不足和瘀血內(nèi)生的根源。氣虛則無(wú)以行血、陰虛則脈絡(luò)不利，心氣不足無(wú)以推動(dòng)血行，陰虛筋脈失養(yǎng)，血行瘀滯，不榮則痛。故當(dāng)益氣養(yǎng)陰。生脈散始于金代張?jiān)氐摹夺t(yī)學(xué)啟源》，由人參、麥冬、五味子組成。方中人參味甘微寒，益元?dú)?，補(bǔ)肺氣，生津液，用以為君；麥冬甘寒，養(yǎng)陰清熱，潤(rùn)肺生津，是為臣藥。人參、麥冬合用，增強(qiáng)益氣養(yǎng)陰之用，佐以五味子味酸，性甘微溫，收斂心氣而生津。三藥合用，補(bǔ)、潤(rùn)、斂同調(diào)，使氣復(fù)津生，汗止陰存，氣充脈復(fù)，故曰“生脈”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，生脈散有多重藥理活性，包括增強(qiáng)心肌收縮力、防止心室重構(gòu)等，常用于心律失常、心力衰竭等心血管疾病的防治[10]。厄貝沙坦作為血管緊張素受體拮抗劑類的降壓藥物，臨床試驗(yàn)表明厄貝沙坦能夠減輕心臟負(fù)擔(dān)，減少心肌耗氧量，改善心室重塑，促進(jìn)心功能的恢復(fù)[11]。故選用厄貝沙坦為陽(yáng)性對(duì)照藥。

各種病理性刺激引起的壓力負(fù)荷（如高血壓、主動(dòng)脈狹窄）通過(guò)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠引起心肌細(xì)胞的肥大，表現(xiàn)為心室壁的增厚和心室收縮功能的增強(qiáng)[12]。胸主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)致心力衰竭模型是通過(guò)增加心臟的壓力負(fù)荷從而產(chǎn)生明顯的心室肥厚和心室重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)采用主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)建立大鼠心力衰竭模型，與對(duì)照組相比，TAC術(shù)后8周超聲觀察模型組大鼠心功能指標(biāo)LVIDd、LVIDs明顯升高；LVEF、LVFS明顯降低。與對(duì)照組比較，HE染色見心肌細(xì)胞肥大，提示TAC術(shù)后4周即已形成心肌纖維化和心力衰竭，動(dòng)物模型造模成功。同時(shí)生脈散可以減輕模型組大鼠心力衰竭的程度，降低LVIDd、LVIDS，升高LVEF、LVFS的比值。表明心力衰竭時(shí)心肌纖維化程度與心功能存在明顯的相關(guān)性。

現(xiàn)代研究表明，以神經(jīng)內(nèi)分泌為主多種因素參與的心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的主要病理生理機(jī)制，而心肌纖維化是其重要的病理學(xué)基礎(chǔ)[13]。心肌纖維化是指心肌間質(zhì)中出現(xiàn)膠原纖維過(guò)度沉積、纖維蛋白增生等為特征的心肌間質(zhì)重構(gòu)，是心室重構(gòu)的重要表現(xiàn)形式之一[14]。在心衰過(guò)程中，模型組心肌纖維肥大、排列不規(guī)整、大量膠原沉積，引起心肌順應(yīng)性下降、僵硬度增加，心臟的收縮及舒張功能減退，生脈散干預(yù)能夠改善心衰大鼠心肌細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的膠原異常沉積，進(jìn)而能夠改善心肌重塑。Col-Ⅰ和Col-Ⅲ是心肌細(xì)胞外基質(zhì)中主要的兩種膠原蛋白，心衰大鼠心肌中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量明顯增加，而生脈散干預(yù)后Col-Ⅰ、Col-Ⅲ膠原含量均明顯減少。結(jié)果表明心力衰竭病程中存在明顯的心肌纖維化。

TGF-β1∕Smads信號(hào)通路是參與心肌纖維化的關(guān)鍵通路，可通過(guò)調(diào)節(jié)Smads蛋白家族成員相互作用介導(dǎo)心肌纖維化發(fā)生[15]。Smad3是TGF-β1下游受體的作用靶點(diǎn)，刺激TGF-β1可誘導(dǎo)Smad3活化，進(jìn)而調(diào)控促纖維化基因的表達(dá)[16]。本研究中模型組可見TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)升高，提示TGF-β1∕Smad3通路蛋白的表達(dá)可能與心肌纖維化相關(guān)。經(jīng)過(guò)生脈散治療后兩者均明顯降低，提示生脈散可能通過(guò)抑制TGF-β1∕Smad3信號(hào)通路活化，進(jìn)而抑制肌成纖維細(xì)胞增殖，達(dá)到抑制心肌纖維化、心臟重構(gòu)的目的。

綜上所述，生脈散能夠改善心衰大鼠的心功能，減輕心肌纖維化，從而防治心衰后心肌重塑的發(fā)生，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1∕Smads通路有關(guān)。