慢性阻塞性肺疾病病證結(jié)合動(dòng)物模型研究進(jìn)展*

張 婷 林 也 陳小娟 唐 琳 陸曉珊劉樂平 宋厚盼 廖 菁1， 陳 聰 蔡 雄△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長沙 410208）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種以持續(xù)氣流受限為特征，嚴(yán)重威脅人類健康的疾病[1]。據(jù)2018年流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國COPD患者人數(shù)高達(dá)9 990萬，約占全球COPD患者的25%[2]。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為COPD的發(fā)生主要與氣道炎癥、蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激、微生物病原體、自身免疫及細(xì)胞凋亡[3]等有關(guān)。中醫(yī)學(xué)則根據(jù)咳嗽、咳痰、喘息等臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“咳嗽”“喘證”“肺脹”“肺痿”等范疇[4]，并認(rèn)為本病的發(fā)生與久病肺虛、感受外邪及年老體虛等有關(guān)，且涉及肺、脾、腎、心、肝等多臟。

COPD作為一種世界性的常見疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。構(gòu)建病證結(jié)合的動(dòng)物模型是探討其發(fā)病機(jī)制及研發(fā)相應(yīng)藥物的一種有效途徑。筆者梳理當(dāng)前文獻(xiàn)資料，從COPD動(dòng)物模型和COPD病證結(jié)合動(dòng)物模型兩類進(jìn)行探討。

1 常見COPD動(dòng)物模型

COPD具有多種建模方法，目前主要由外源蛋白酶、脂多糖、煙霧刺激以及基因調(diào)控誘導(dǎo)。模型復(fù)制的思路主要是誘使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生組織病理學(xué)改變，從而使其具有與人類COPD相似的特征。

1.1 蛋白酶誘導(dǎo)型 研究表明，蛋白酶∕抗蛋白酶系統(tǒng)的失衡是引起彈性蛋白過度破壞分解，外周氣道擴(kuò)張，從而產(chǎn)生肺氣腫的主要原因[5]。常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等。Paul等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)，反復(fù)氣管內(nèi)注射木瓜蛋白酶，可使大鼠出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性的肺氣腫。毛旻等[7]測定支氣管內(nèi)注入木瓜蛋白酶建立豬肺氣腫模型的可靠性，取小型豬，支氣管鏡下左肺葉內(nèi)注入木瓜蛋白酶，測得其PO2降低，PCO2及氣道阻力升高，動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性下降，周邊肺組織肺紋理減少，肺野透光度增強(qiáng)，呈典型的肺氣腫表現(xiàn)。Lynn等[8]研究表明中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)和調(diào)節(jié)炎癥的方式參與COPD的病理生理學(xué)過程。

α-1抗胰蛋白酶是一種重要的蛋白酶抑制劑，在預(yù)防COPD方面具有重要作用。Kolarich等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)α-1抗胰蛋白酶能中和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，保護(hù)肺結(jié)締組織免受傷害。

1.2 煙霧誘導(dǎo)型 吸煙是導(dǎo)致COPD的主要原因，煙霧中含有許多氧化劑和自由基，會(huì)破壞細(xì)胞功能，引發(fā)白細(xì)胞聚集，從而形成氣道炎癥[8]。曹君等[10]為探討單純煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型，將C57BL∕6J小鼠暴露于煙霧90 d，結(jié)果顯示小鼠氣道阻力增加，動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性降低，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，且出現(xiàn)肺特征性的病理改變。Anna等[11]研究香煙煙霧對小鼠銅綠假單胞菌感染后細(xì)菌清除率和免疫炎癥參數(shù)的影響。鼻飼銅綠假單胞菌及煙霧熏吸誘導(dǎo)COPD模型，結(jié)果顯示，小鼠細(xì)菌清除速率有所延遲，炎癥反應(yīng)加強(qiáng)。

煙霧誘導(dǎo)的COPD模型在研究中應(yīng)用廣泛，其較急性傷害性模型能更好地模擬人長期吸煙引發(fā)的慢性發(fā)病過程。然而煙霧誘導(dǎo)也存在其局限，如無論這些動(dòng)物暴露多長時(shí)間，由此產(chǎn)生的病理改變都是輕微的，相當(dāng)于COPD的早期，并不會(huì)像COPD晚期那樣功能喪失。

1.3 脂多糖誘導(dǎo)型 脂多糖（LPS）是一種重要的致炎因子，主要存在于革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁。通過對模型動(dòng)物氣道內(nèi)反復(fù)滴注LPS，可誘發(fā)氣道炎癥，形成COPD。宋小蓮等[12]取Wistar大鼠，通過吸煙和氣道內(nèi)滴加脂多糖建立COPD大鼠模型。結(jié)果顯示，大鼠體重減輕，間歇性咳嗽，呼吸急促，外周血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分比增加，肺組織HE染色有慢性支氣管炎和典型的肺氣腫病變。王瑋等[13]取雄性Wistar大鼠，通過吸煙和氣道內(nèi)輸注LPS復(fù)制COPD模型。結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)攝食、飲水減少，舌下靜脈曲張，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，咳嗽，噴嚏，口鼻分泌物增加等癥狀及體征。血清中腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、干擾素-γ等炎性因子均明顯升高。

1.4 基因調(diào)控型 COPD的發(fā)病也受到基因調(diào)控的影響，不少研究者應(yīng)用基因敲除、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等復(fù)制COPD動(dòng)物模型。Florie等[14]通過敲除小鼠近親基因SERPINA1，可使其自發(fā)形成肺氣腫。Iizuka等[15]研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Nrf2基因，能加速中性粒細(xì)胞性肺炎和通透性肺損傷，誘導(dǎo)形成肺氣腫。Witusik等[16]研究表明髓過氧化物酶編碼基因-463位點(diǎn)的AA基因型能增加COPD的患病風(fēng)險(xiǎn)?；蛘{(diào)控是誘發(fā)COPD的一種新型方式，將是未來研究的重點(diǎn)。

2 常見的COPD病證結(jié)合動(dòng)物模型

單純的疾病模型不能很好地模擬COPD和中醫(yī)證候之間的關(guān)系。因此，在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，許多學(xué)者在疾病模型的基礎(chǔ)上增加中醫(yī)的致病因素，以復(fù)制COPD中醫(yī)證候。

使其既具備西醫(yī)的病理特征，又滿足中醫(yī)的證型。目前常見的病證結(jié)合動(dòng)物模型有肺氣虛證動(dòng)物模型、肺脾氣虛證動(dòng)物模型、肺腎兩虛證動(dòng)物模型、寒飲蘊(yùn)肺證動(dòng)物模型、痰熱壅肺證動(dòng)物模型、痰瘀阻肺證動(dòng)物模型等。

2.1 肺氣虛證動(dòng)物模型 見表1。肺氣虛證是指以咳嗽乏力、氣短而喘、衛(wèi)外不固為臨床表現(xiàn)的一種證候。其病情較為單一，造模方式多樣，是肺病證候模型中研制最早、最為完善的一種動(dòng)物模型。

表1 常見肺氣虛證COPD動(dòng)物模型

2.2 肺脾氣虛證動(dòng)物模型 見表2。脾在五行屬土肺屬金，土能生金，故脾為肺之母，肺病日久，則子病及母，形成肺脾氣虛之證。目前肺脾氣虛證動(dòng)物模型主要采用煙熏聯(lián)合脂多糖，并輔以苦寒瀉下類中藥進(jìn)行造模。

表2 常見肺脾氣虛證COPD動(dòng)物模型

2.3 肺腎兩虛證動(dòng)物模型 見表3。COPD發(fā)展到后期也可影響及腎，形成肺腎兩虛之證。楊士瀛在《仁齋直指方論·咳嗽》指出“肺為氣之主，腎為氣之藏。凡咳嗽暴重，動(dòng)引百骸，自覺氣從臍下逆奔而上者，此腎虛不能收氣歸元也”。肺腎兩虛證病情復(fù)雜，目前擁有的造模方式有限。

表3 常見肺腎兩虛證COPD動(dòng)物模型

這些模型均能在一定程度上模擬肺腎兩虛證，然則與臨床實(shí)際仍存在一定差距。如臨床COPD的肺腎兩虛證多呈進(jìn)行性發(fā)展，一般先累及肺，日久及腎。而在造模之時(shí)，腎虛證模型與肺氣虛證模型多同時(shí)進(jìn)行復(fù)制，因而有待進(jìn)一步完善。

2.4 寒飲蘊(yùn)肺證動(dòng)物模型 見表4。寒飲蘊(yùn)肺證是COPD的一個(gè)常見證型，多由肺陽氣虛衰，脾失轉(zhuǎn)輸，飲邪上犯所致。目前多采用煙熏聯(lián)合脂多糖或滴加肺炎克雷白桿菌的方法復(fù)制COPD模型，再輔以寒涼食物或風(fēng)寒濕刺激，所謂形寒飲冷皆可傷肺。

表4 常見寒飲蘊(yùn)肺證COPD動(dòng)物模型

2.5 痰熱阻肺證動(dòng)物模型 見表5。痰熱壅肺證多出現(xiàn)在COPD的急性加重期，具有“痰”和“熱”的雙重病機(jī)[30]，二者互為因果，正如宋·楊士瀛《仁齋直指方論·病機(jī)賦》中所道“痰因火動(dòng)，有因火而生痰，有因痰而生火”。其臨床可見咳嗽、黃痰、發(fā)熱、口干、便干便秘、舌紅苔黃等證候表現(xiàn)。

表5 常見痰熱阻肺證COPD動(dòng)物模型

2.6 痰瘀阻肺證動(dòng)物模型 痰瘀阻肺證多由肺氣受損，脾失健運(yùn)，氣血運(yùn)行失司，阻滯于肺所致。氣虛、痰凝、血瘀是其發(fā)病的關(guān)鍵，早在《丹溪心法》中便有提及“肺脹而咳，或左或右不得眠，此痰挾瘀血礙氣而病”。痰瘀阻肺證臨床表現(xiàn)為氣喘、胸悶、肢冷面青、舌暗、舌下絡(luò)脈曲張、脈沉或澀等[34]。目前擁有的造模方法較為單一，主要通過煙熏配合勞累、缺氧等方式。李澤庚等[35]每天強(qiáng)迫大鼠游泳30 min，使其勞傷肺氣，而后將其置于熏煙箱內(nèi)煙熏1 h，最后置入常壓低氧裝置內(nèi)以建立COPD痰瘀阻肺證模型。王傳博等[34，36-37]參照李澤庚的造模方法構(gòu)建COPD痰瘀阻肺證大鼠模型，觀察到大鼠肺小動(dòng)脈管壁變薄、管腔變大，管壁面積占血管總面積的百分比明顯減少，Rock-1、Rock-2蛋白表達(dá)及炎癥因子等明顯降低。

3 思考與展望

COPD動(dòng)物模型造模方式多樣，是探索其發(fā)病機(jī)制的一種有效途徑。病證結(jié)合COPD動(dòng)物模型更是結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“病”和中醫(yī)“證”的優(yōu)勢，在單純疾病模型基礎(chǔ)上模擬氣虛、寒飲、痰熱、痰瘀、腎虛等多種不同的證候，具有較高的可信度與重復(fù)性，大大推動(dòng)了COPD的研究進(jìn)展，為探討其發(fā)病機(jī)制及開發(fā)相應(yīng)的中醫(yī)藥提供了良好的平臺(tái)。然而目前還存在些許不足，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

3.1 動(dòng)物選取品類 目前常用的COPD模型動(dòng)物有豚鼠、大小鼠、狗、豬、兔、羊等，其中大鼠由于基因組與人類基因組非常相近，且飼養(yǎng)成本低，性情溫順，繁殖較快，因而在COPD動(dòng)物模型中應(yīng)用普遍。但也存在一些不足，如大鼠的支氣管分支較少，左肺葉僅1片，且電鏡下無法觀察到氣管黏膜下的杯狀細(xì)胞，這均與人類不符[38]。

3.2 造模方法 COPD動(dòng)物模型制作方法多樣，優(yōu)劣各異。如采用煙熏法時(shí)經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，且能很好地模擬人的吸煙過程，但它所造成的病程是輕微的，相當(dāng)于疾病的早期；采用氣管內(nèi)滴加脂多糖時(shí)往往急性起?。徊捎没蚯贸齽t價(jià)格高昂，技術(shù)尚未完全成熟。

不僅如此，在制作COPD各證候之時(shí)，也存在諸多問題。首先，造證方式不統(tǒng)一，如同為COPD肺氣虛證，有采用煙熏聯(lián)合脂多糖，有采用滴菌配合寒冷疲勞刺激，也有采用煙熏配合木瓜蛋白酶霧化吸入。這些方法均能對肺產(chǎn)生明確、特異的病理損害，然而究竟何種更符合臨床實(shí)際，尚有待考究。其次，煙熏時(shí)所使用材料各異，有香煙，有硫磺粉，有鋸末，有刨花，且同一個(gè)模型，不同的研究者進(jìn)行煙熏的時(shí)間不一致。再者，在造證之時(shí)，往往通過改變外在環(huán)境使動(dòng)物具有與患者相同或相似的表現(xiàn)，以達(dá)到模擬“證”的目的。然而，這些單純的致病因素在實(shí)際施加過程中存在著一定程度的不可控性，如在強(qiáng)迫大鼠游泳時(shí)，由于大鼠先天個(gè)體差異，其游泳所能耐受的強(qiáng)度不一致，最終達(dá)到的效果也不一致，因而導(dǎo)致模型的代表性和穩(wěn)定性均較弱[39]。

3.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 在COPD病證結(jié)合動(dòng)物模型的判定中，有通過觀察大鼠的癥狀、體征，有通過檢測相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，也有通過光鏡、電鏡等考察肺特征性的病理改變，然而這些均只能說明模型“造病”成功，卻無法判斷其“造證”成功與否。而模型的“證”主要通過對動(dòng)物一般癥狀、體征的觀察得到，由人的主觀意識(shí)進(jìn)行判定，缺乏一定的科學(xué)性。如在肺脾兩虛證動(dòng)物模型制造中，對模型動(dòng)物灌以苦寒瀉下類中藥，大鼠出現(xiàn)納呆，便溏，甚則泄瀉，因而判定有脾虛證形成，然而究竟一天飲食多少才算納呆，大便一天幾次才算泄瀉，糞質(zhì)溏稀到何種程度才算便溏，尚沒有一個(gè)數(shù)字化的診斷標(biāo)準(zhǔn)。且不同證之間也會(huì)出現(xiàn)相似癥候的兼夾，在造模后期更有可能由于疾病的自然演化而形成其他證候，導(dǎo)致模型動(dòng)物偏離原來的造模證候，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。

總之，COPD病證結(jié)合動(dòng)物模型仍處于發(fā)展中，尚有待繼續(xù)完善，建立一種經(jīng)濟(jì)方便、科學(xué)全面且符合人類COPD病證表現(xiàn)的造模方法及建立一個(gè)完善的病證結(jié)合動(dòng)物模型的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是未來研究工作的方向所在。