牡蠣蛋白源鈣離子螯合肽的制備與性質(zhì)分析

郭利娜，宮 強(qiáng)，張 彬，陳艷楠

（河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽471023）

牡蠣是全世界分布和養(yǎng)殖范圍最廣的海洋生物之一，其含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，以及海洋生物特有的多種活性物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值豐富[1]。我國是牡蠣養(yǎng)殖大國，其年產(chǎn)量可達(dá)487.9萬t，分別占全國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量和貝類產(chǎn)量的24.4%和34.0%[2]。目前，我國牡蠣產(chǎn)品主要以鮮食或肉干產(chǎn)品為主，高附加值加工技術(shù)仍有待開發(fā)。

牡蠣中蛋白質(zhì)含量較高，通常占牡蠣肉干的45%～57%[3]，其水解后所產(chǎn)生的多肽顯示出多種生物活性，其中已報(bào)道的牡蠣蛋白源活性肽包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽[4]、抗菌肽[5]、抗癌肽[6]、Zn-螯合肽[7]等。因此，使用牡蠣蛋白開發(fā)具有良好生物活性的多肽產(chǎn)品為提高牡蠣附加值利用提供了重要思路。

鈣是人體中重要的微量元素，鈣缺乏將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，甚至誘發(fā)高血壓、腎結(jié)石和結(jié)腸癌等疾病[8]。目前，鈣缺乏的治療依賴于鈣補(bǔ)充劑，特別是有機(jī)鈣補(bǔ)充劑的使用。作為有機(jī)鈣補(bǔ)充劑中的一種，肽-鈣螯合物的研究越來越受到重視。當(dāng)作為鈣的遞送載體使用時(shí)，肽具有運(yùn)輸速度快、能量消耗少等優(yōu)勢(shì)[9]。近年來，已從多種來源的蛋白，包括鵝骨膠原蛋白[10]、大豆蛋白[11]、酪蛋白[12]和小麥胚芽蛋白[13]制備獲得了鈣-肽螯合物。然而，目前針對(duì)牡蠣蛋白源鈣離子螯合肽的研究較少。因此，基于實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)牡蠣肽活性的篩選，通過酶解法從牡蠣蛋白制備了鈣離子螯合肽并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行了性質(zhì)分析，從而為牡蠣蛋白的高附加值利用提供了重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

牡蠣蛋白，陜西一諾生物科技有限公司提供；風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme）、堿性蛋白酶（Alcalase 2.4l）、復(fù)合蛋白酶（Protamex）、中性蛋白酶（Neutrase），諾維信公司提供；胃蛋白酶、胰蛋白酶和鄰甲酚酞絡(luò)合酮，Sigma-Aldrich公司提供；木瓜蛋白酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、亮抑酶肽、丙谷二肽，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；色譜純乙腈，賽默飛世爾科技有限公司提供；其他試劑均為分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器

L5S型紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Eclassical 3100型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 蛋白酶的篩選

蛋白酶的最適溫度和pH值見表1。

表1 蛋白酶的最適溫度和pH值

使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶，對(duì)牡蠣蛋白進(jìn)行水解研究。具體試驗(yàn)條件如下：在各個(gè)蛋白酶的最適溫度和最適pH值條件下，以5%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，1/50的酶/底物比（E/S），在恒溫水浴振蕩器上水解4 h。水解結(jié)束后，加熱煮沸反應(yīng)混合物5 min以終止反應(yīng)，并將混合物以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定水解度和鈣螯合率。綜合考慮水解度和鈣螯合率兩者，選擇風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化研究。

1.4 風(fēng)味蛋白酶水解牡蠣蛋白的單因素試驗(yàn)

按照1.3中所述的方法，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解牡蠣蛋白的過程，具體方法如下：使用特定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%，4%，6%，8%，10%）和E/S（1∶100，1∶66.7，1∶50，1∶40，1∶33.3），在一定溫度（35，40，45，50，55，60℃）和pH值（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）條件，水解一定時(shí)間（1，2，3，4，5，6 h）。水解結(jié)束后，加熱煮沸反應(yīng)混合物5 min以終止反應(yīng)，并將混合物以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定水解度和鈣螯合率。

1.5 水解度的測(cè)定

采用OPA法測(cè)定蛋白水解度[14]，具體方法如下：將100 mmol/L的四硼酸鈉溶液25 mL、5% SDS溶液10 mL、水13.9 mL，OPA溶液1 mL、0.1 mL β-巰基乙醇混合以制備OPA測(cè)定溶液。取50 μL測(cè)試樣品與2 mL OPA測(cè)定溶液混合并在室溫下反應(yīng)8 min。反應(yīng)結(jié)束后，于波長(zhǎng)340 nm處測(cè)定反應(yīng)物的吸光度。以甘氨酸-甘氨酸二肽作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定水解前（C1）和水解后（C2）反應(yīng)混合物中的氨基含量?；诠剑?）測(cè)定蛋白水解度DH：

式中：C1——水解前蛋白中的游離氨基含量，mol/L；

C2——水解后反應(yīng)混合物中的游離氨基濃度，mol/L；

C0——總氨基含量（根據(jù)凱氏定氮法測(cè)定）。

1.6 鈣螯合率的測(cè)定

參考Zhao L等人[15]的方法測(cè)定鈣螯合率，具體步驟如下：將5 mmol/L的氯化鈣溶液1 mL和0.2 mol/L pH值8.0的磷酸鹽緩沖液2 mL混合，然后向其中加入多肽樣品1 mL。將混合物在空氣浴振蕩器中，在37℃下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，將混合物以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min。離心結(jié)束后，以標(biāo)準(zhǔn)鈣離子溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用鄰甲酚酞絡(luò)合比色法測(cè)定上清液中的鈣離子含量，并根據(jù)公式（2）計(jì)算鈣離子螯合率：

1.7 多肽的分子量分布

通過高效液相色譜法[16]測(cè)定水解多肽的分子量分布，具體方法如下：使用配備有紫外檢測(cè)器的依利特Eclassical 3100型高效液相色譜，使用TSKgel 2000 SWXL型凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm），以乙腈∶水∶三氟乙酸（體積比為45∶55∶0.1）作為流動(dòng)相，在進(jìn)樣量20 μL，流速0.5 mL/min，柱溫37℃的條件下，于波長(zhǎng)214 nm處測(cè)定吸光度。使用細(xì)胞色素C（12 362 Da）、抑肽酶（6 511.4 Da）、桿菌肽（1 423 Da）、亮抑酶肽（475.59 Da）、丙谷二肽（146.145 Da）作為標(biāo)準(zhǔn)品，以分子量對(duì)數(shù)（lg MW）為縱坐標(biāo)，以樣品保留時(shí)間為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品分子量分布。

1.8 DPPH自由基清除活性

參考劉龍等人[17]的方法，如下所述進(jìn)行DPPH自由基清除活性的測(cè)定：將DPPH溶解于無水乙醇，使其最終濃度為0.1 mmol/L（現(xiàn)用現(xiàn)配）。將0.5 mL牡蠣肽-鈣離子螯合物和牡蠣肽溶液與2.5 mL DPPH溶液混合，避光靜置30 min，以無水乙醇為參比，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度A1。同時(shí)，測(cè)定0.5 mL無水乙醇與2.5 mL DPPH溶液混合后的吸光度A2，和0.5 mL樣品溶液與2.5 mL無水乙醇混合后的吸光度A3。則DPPH自由基清除率按公式（3）計(jì)算為：

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

首先比較了不同蛋白酶對(duì)牡蠣蛋白的水解度和水解產(chǎn)物的鈣離子螯合率的影響。使用風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解后所獲得的牡蠣多肽的鈣離子螯合率較高，均在25%以上；使用復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶時(shí)，牡蠣蛋白的水解度較高，均大于30%。從水解度角度考慮，水解度越高則所產(chǎn)生的多肽片段數(shù)越多，同時(shí)所產(chǎn)生的多肽長(zhǎng)度則越短，因此越利于吸收；而從鈣離子螯合率角度來看，由于不同蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，因此水解產(chǎn)物顯示出不同的氨基或羧基末端，因而具有不同的高級(jí)結(jié)構(gòu)并顯示出不同的螯合率。由于研究的目的在于篩選高鈣離子螯合肽，因此在優(yōu)先考慮鈣離子螯合率并兼顧水解度的情況下，選擇風(fēng)味蛋白酶用于后續(xù)研究。

蛋白酶種類對(duì)水解度和螯合率的影響見圖1。

圖1 蛋白酶種類對(duì)水解度和螯合率的影響

2.2 風(fēng)味蛋白酶水解牡蠣蛋白的單因素試驗(yàn)

2.2.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度和螯合率的影響見圖2。

圖2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度和螯合率的影響

隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，牡蠣蛋白的水解度逐漸降低，而鈣離子螯合率則呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時(shí)，蛋白質(zhì)的水解度較高，因此水解片段中存在較多氨基酸，不利于鈣離子螯合；而在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，水解度顯著降低，所產(chǎn)生的水解片段長(zhǎng)度加大，甚至一些鈣離子結(jié)合位點(diǎn)可能未充分暴露，導(dǎo)致鈣離子螯合率降低。因此，選擇6%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 E/S的影響

E/S對(duì)水解度和螯合率的影響見圖3。

圖3 E/S對(duì)水解度和螯合率的影響

隨著E/S升高，用于反應(yīng)的蛋白酶逐漸增加，反應(yīng)速度加快，水解度升高。從鈣離子螯合率來看，當(dāng)E/S=1∶66.7時(shí)，鈣離子螯合率最大，顯示出水解度的變化導(dǎo)致了水解產(chǎn)物組成的顯著改變，從而對(duì)鈣離子螯合率有較大影響。因此，選擇E/S=1∶66.7進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 水解時(shí)間的影響

水解時(shí)間對(duì)水解度和螯合率的影響見圖4。

圖4 水解時(shí)間對(duì)水解度和螯合率的影響

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸升高，而鈣離子螯合率在前4 h逐漸升高，隨后輕微降低。張文婷[18]和龐忠莉[19]分別在研究藍(lán)圓鲹和牡蠣水解產(chǎn)物對(duì)二價(jià)鐵離子的結(jié)合中發(fā)現(xiàn)隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸升高，而金屬離子螯合率則隨水解時(shí)間先升高并隨后保持基本不變，該趨勢(shì)與研究結(jié)論類似。因此，選擇水解4 h作為最優(yōu)條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.4 水解溫度的影響

水解溫度對(duì)水解度和螯合率的影響見圖5。

圖5 水解溫度對(duì)水解度和螯合率的影響

由圖5可以看出，水解度在50℃時(shí)達(dá)到最大，這與風(fēng)味蛋白酶的最適水解溫度一致。在該溫度下，鈣離子螯合率也達(dá)到最大。因此，選擇50℃作為最優(yōu)條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.5 pH值的影響

pH值對(duì)水解度和螯合率的影響見圖6。

圖6 pH值對(duì)水解度和螯合率的影響

由圖6可以看出，水解度在pH值7.0時(shí)達(dá)到最大，這與風(fēng)味蛋白酶的最適水解pH值（6.0）有所偏差，表明以牡蠣蛋白作為底物時(shí)，風(fēng)味蛋白酶的最適pH值為7.0。同時(shí)，鈣離子螯合率在pH值7.0時(shí)也達(dá)到最大。通過單因素優(yōu)化試驗(yàn)，確定當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，E/S=1∶66.7時(shí)，在溫度50℃，pH值7.0條件下水解4 h，此時(shí)鈣離子螯合率達(dá)到38.98%，水解度達(dá)到43.6%。

2.3 牡蠣肽的分子量分布

牡蠣肽的分子量分布圖見圖7。

圖7 牡蠣肽的分子量分布圖

通過高效液相排阻色譜法測(cè)定了牡蠣肽的分子量分布。根據(jù)液相色譜結(jié)果，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算曲線下面積得到了牡蠣肽的具體分子量分布范圍（見表2），結(jié)果表明絕大部分的牡蠣肽的分子量小于1 kDa，從而表明水解后的多肽以約八肽或更小的多肽為主。研究表明，分子量分布與鈣離子結(jié)合能力有關(guān)，具有鈣離子結(jié)合能力的肽的分子量通常小于2 kDa，這從一個(gè)方面解釋了試驗(yàn)中所獲得的牡蠣肽的高鈣離子結(jié)合能力[20]。

牡蠣肽的分子量分布見表2。

表2 牡蠣肽的分子量分布

2.4 DPPH自由基清除活性

鈣離子螯合肽的DPPH自由基清除能力見圖8。

圖8 鈣離子螯合肽的DPPH自由基清除能力

由圖8可以看出，所制備的牡蠣肽除能夠與鈣離子螯合外，其還具有一定的抗氧化能力，在1.0 mg/mL條件下，其DPPH自由基清除率達(dá)到33.5%，因此具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

（1）以水解度和螯合率為指標(biāo)，通過水解試驗(yàn)，篩選出風(fēng)味蛋白酶作為最適于制備牡蠣蛋白源鈣離子螯合肽的蛋白酶。

（2）通過單因素試驗(yàn)研究了使用風(fēng)味蛋白酶從牡蠣蛋白制備鈣離子螯合肽的方法，結(jié)果表明當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，酶∶底物（E/S）比為1∶66.7時(shí)，在溫度50℃，pH值7.0條件下水解4 h，鈣離子螯合率達(dá)到38.98%，水解度達(dá)到43.6%。

（3）通過高效液相排阻色譜法測(cè)定了鈣離子螯合肽的分子量分布，結(jié)果顯示絕大部分牡蠣肽的分子量分布范圍在1 kDa以下，表明水解后所獲得的多肽以八肽或更小的多肽為主。

（4）通過DPPH自由基清除試驗(yàn)顯示，1 mg/mL的鈣離子螯合肽的DPPH自由基清除率達(dá)到33.5%，表明試驗(yàn)所制備的牡蠣蛋白源鈣離子螯合肽不僅可以作為鈣補(bǔ)充劑使用，同時(shí)還具有一定的抗氧化作用。