NAC/RvD1抑制H2O2誘導(dǎo)的COPD患者氣道上皮細(xì)胞炎癥性黏液高分泌的作用及機(jī)制研究

吳 旭, 季 爽 , 郭 燕 , 費(fèi)廣鶴,2

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種慢性氣道炎癥性疾病，目前研究表明炎癥、氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡都是COPD發(fā)生的可能機(jī)制。原代氣道上皮細(xì)胞(primary airway epithelial cells，DHBE)是COPD患者細(xì)胞和組織學(xué)改變的主要部位，各種入侵呼吸道的應(yīng)激源構(gòu)成復(fù)雜的胞外信號(hào)，可以通過對(duì)IκB激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK)的直接激活作用，使核因子κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)泛素化，進(jìn)而核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化，導(dǎo)致DHBE釋放大量炎癥細(xì)胞因子，同時(shí)促進(jìn)氣道黏液高分泌，而抑制NF-κB的活化可能會(huì)緩解各種氧化應(yīng)激造成的損傷。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)可使COPD患者的痰黏液癥狀緩解、肺功能改善。消退素D1(resolvin-D1, RvD1)是具有強(qiáng)效抗炎作用的分子，它可以抑制NF-κB的活性，強(qiáng)效抗炎的同時(shí)，不損害機(jī)體的防御反應(yīng)。該文旨在探討HO作為氧化應(yīng)激源對(duì)COPD患者的炎癥性黏液高分泌的影響以及NAC和RvD1的保護(hù)作用，為COPD患者的臨床防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人氣管組織標(biāo)本來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科行肺葉切除的COPD合并肺癌(原位癌)患者，組織取樣的樣本距離腫瘤邊緣>3 cm，且病理學(xué)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞學(xué)均為陰性。分離提取COPD患者的DHBE。BEGM培養(yǎng)基(美國(guó)Lonza公司)；胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) (美國(guó)賽默飛公司)；兔源性抗體IKKβ和MUC5AC(美國(guó)Abcam公司)；兔源性抗體p-IKKβ、NF-κB、p-NF-κB、β-actin(美國(guó)CST公司)；HRP-IgG 山羊抗兔的二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；30% HO(合肥英博生物科技有限公司)；NAC(美國(guó)Sigma公司)；RvD1(美國(guó)Cayman Chemical公司)；NF-κB抑制劑(ammonium pyrrolidinedithio-carbamat, PDTC)、MTT、活性氧檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；qRT-PCR試劑盒(日本Takara公司)；TNF-α、IL-8的ELISA試劑盒(上海愛必信生物科技有限公司)。

1.2 方法

1

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2

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1

細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將DHBE細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，添加BEGM培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的80%～90%時(shí)，棄去上層培養(yǎng)基，PBS清洗后，取2 ml的胰酶放入培養(yǎng)皿中消化，收集細(xì)胞后離心機(jī)離心，再加入BEGM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按1 ∶2比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1

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2

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2

MTT實(shí)驗(yàn) 將DHBE細(xì)胞以5 000個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，將細(xì)胞與不同濃度梯度(0～500 μmol/L)的HO共孵育24 h。棄去上層培養(yǎng)基，添加MTT (5 mg/ml) 孵育4 h，棄去培養(yǎng)孔內(nèi)混合液體，向每個(gè)孔中加入100 μl的DMSO，然后在室溫下振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1

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2

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3

ROS水平的檢測(cè) 將DHBE細(xì)胞均勻接種于6孔板中，根據(jù)各孔中添加HO(300 μmol/L)和(或)NAC(10 mmol/L)不同，分為對(duì)照組、HO組、NAC+HO組和NAC組，隨后向各組細(xì)胞中添加活性氧檢測(cè)的 DCFH-DA (10 μmol/L) 探針，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，收集各組細(xì)胞，采用免疫熒光或流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS的表達(dá)水平。

1

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2

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4

Western blot實(shí)驗(yàn) 將DHBE細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)板中，根據(jù)各孔中添的 HO(300 μmol/L)和(或)NAC(10 mmol/L)不同，分為對(duì)照組、HO組、NAC+HO組和NAC組。根據(jù)添加的治療藥物消退素RvD1(100 nmol/L)和陽(yáng)性對(duì)照PDTC(10 μmol/L)不同，分為對(duì)照組、HO組、RvD1+HO組、RvD1組、PDTC+HO組和PDTC組。PBS洗滌后，收集細(xì)胞提取總蛋白，將總蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜后，在4 ℃孵育一抗IKKβ(1 ∶1 000)、p-IKKβ(1 ∶1 000)、NF-κB(1 ∶1 000)、p-NF-κB(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)過夜。次日，一抗復(fù)溫后，采用TBST洗膜，室溫下孵育羊抗兔二抗(1 ∶5 000)2 h，再次TBST洗膜后，ECL顯色曝光，記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1

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2

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5

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 細(xì)胞分組及處理同1.2.4，以提取的RNA樣品為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用SYBR Green法對(duì)cDNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min后進(jìn)入循環(huán)；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；采用2法分析相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 基因引物列表

1

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2

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6

細(xì)胞免疫熒光染色 將細(xì)胞爬片培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至60%左右，細(xì)胞分組及處理同1.2.4，室溫下用免疫熒光固定液固定15 min，PBS洗3次。免疫染色封閉液封閉60 min，在4 ℃孵育一抗MUC5AC(1 ∶200)過夜，PBS清洗細(xì)胞3次，室溫下孵育羊抗兔二抗(1 ∶200)作用細(xì)胞90 min，DAPI細(xì)胞核染色4 min，熒光顯微鏡下拍照。

1

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2

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7

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 收集上述HO、NAC、RvD1和PDTC處理后的細(xì)胞上清液，離心后采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)上清液中的TNF-α、IL-8含量水平。

2 結(jié)果

2.1 H

O

合適的作用濃度及其對(duì)IKKβ/NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響

不同濃度梯度(0～500 μmol/L)的HO處理DHBE細(xì)胞24 h后，采用MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。結(jié)果表明HO的濃度在0～400 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力無毒性作用，而500 μmol/L組較對(duì)照組細(xì)胞活力下降27.05%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001)。見圖1。采用Western blot檢測(cè)炎癥信號(hào)通路IKKβ/NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果提示不同濃度HO刺激后, 從200 μmol/L開始，與對(duì)照組相比，IKKβ和NF-κB磷酸化水平升高(

F

=37.23，

P

<0.05；

F

=22.47，

P

<0.05)，且呈劑量依賴關(guān)系。見圖2。從相對(duì)灰度值的結(jié)果可以觀察到自300 μmol/L開始實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異最為明顯，因此，選擇300 μmol/L的HO進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 MTT法檢測(cè)0～500 μmol/L H2O2處理DHBE細(xì)胞后細(xì)胞活力變化

圖2 Western blot法檢測(cè)0～500 μmol/L H2O2處理DHBE細(xì)胞后p-IKKβ/IKKβ、p-NF-κB/NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)變化

2.2 NAC降低DHBE細(xì)胞中H

O

刺激后產(chǎn)生的ROS含量

免疫熒光探針檢測(cè)ROS含量的變化。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明：HO組細(xì)胞中ROS表達(dá)水平高于對(duì)照組，而NAC作用后則降低，ROS表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=10.63,

P

<0.05)。見圖3。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)4組間ROS的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)與免疫熒光結(jié)果一致(

F

=8.199,

P

<0.05)。見表2、圖4。

圖3 免疫熒光法檢測(cè)H2O2和(或)NAC作用后的DHBE細(xì)胞中的ROS含量 ×100

表2 各組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度的表達(dá)

圖4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)H2O2和(或)NAC作用后的DHBE細(xì)胞中的ROS含量

2.3 NAC抑制DHBE細(xì)胞中H

O

激活的IKKβ/

NF-κB炎癥信號(hào)通路表達(dá)水平

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IKKβ和NF-κB的磷酸化蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，HO組的DHBE細(xì)胞中p-IKKβ和p-NF-κB的蛋白表達(dá)水平升高；與HO組相比，NAC+HO組DHBE細(xì)胞中的p-IKKβ和p-NF-κB的蛋白表達(dá)水平降低，IKKβ和NF-κB的磷酸化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=24.74,

P

<0.001；

F

=14.69,

P

<0.01)。見表3、圖5。

表3 各組細(xì)胞內(nèi)p-IKKβ/IKKβ、p-NF-κB/NF-κB的蛋白相對(duì)表達(dá)

圖5 Western blot 法檢測(cè)H2O2刺激DHBE細(xì)胞后p-IKKβ/IKKβ、p-NF-κB/NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)變化

2.4 NAC減少DHBE細(xì)胞中H

O

誘發(fā)的炎癥因子和黏蛋白MUC5AC表達(dá)

采用qRT-PCR檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8及MUC5AC的mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，HO組DHBE細(xì)胞中的TNF-α、IL-8、MUC5AC的表達(dá)水平升高，而NAC處理后則降低。TNF-α、IL-8和MUC5AC蛋白相對(duì)表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=33.14,

P

<0.001；

F

=31.83，

P

<0.01；

F

=31.83，

P

<0.01)。見表4，圖6A～C。收集上述4組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，采用ELISA法檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-8的含量，結(jié)果與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致(

F

=46.69，

P

<0.001；

F

=83.06，

P

<0.001)。見圖6D、E。與此同時(shí)，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)MUC5AC的表達(dá)水平，也提示NAC處理后可以降低MUC5AC的表達(dá)(

F

=29.16，

P

<0.001)。見圖7。

表4 qRT-PCR檢測(cè)的各組細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-8、MUC5AC蛋白相對(duì)表達(dá)

2.5 RvD1抑制DHBE細(xì)胞中H

O

激活的NF-κB炎癥信號(hào)通路表達(dá)水平

PDTC為NF-κB一種明確的抑制劑，作為該實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB的磷酸化蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，HO組p-NF-κB蛋白表達(dá)水平升高；與HO組相比，RvD1+HO組p-NF-κB蛋白表達(dá)水平降低，NF-κB的磷酸化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=41.14,

P

<0.001)。見表5、圖8。

表5 各組細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB/NF-κB的蛋白相對(duì)表達(dá)

2.6 RvD1降低DHBE細(xì)胞中H

O

誘發(fā)的炎癥因子和黏蛋白MUC5AC的表達(dá)

采用qRT-PCR檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8及MUC5AC的mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，HO組DHBE細(xì)胞中的TNF-α、IL-8、MUC5AC的表達(dá)水平升高，而RvD1處理后則降低。TNF-α、IL-8和MUC5AC的mRNA相對(duì)表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=81.67，

P

<0.001；

F

=37.31，

P

<0.001；

F

=22.59，

P

<0.001)。見表6、圖9A～C。收集上述4組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子TNF-α和IL-8的含量，結(jié)果與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致(

F

=32.25，

P

<0.001；

F

=72.89，

P

<0.001)。見圖9D、E。與此同時(shí)，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)MUC5AC的表達(dá)水平，也提示NAC處理后可以降低MUC5AC的表達(dá)(

F

=17.76，

P

<0.001)。見圖10。

圖6 qRT-PCR法和ELISA法檢測(cè)H2O2刺激DHBE細(xì)胞后TNF-α、IL-8及MUC5AC的表達(dá)

圖7 免疫熒光法檢測(cè)H2O2和(或)NAC作用后的DHBE細(xì)胞中的MUC5AC ×400

圖8 Western blot 法檢測(cè)H2O2刺激DHBE細(xì)胞后p-NF-κB/NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)變化

表6 qRT-PCR檢測(cè)的各組細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-8、MUC5AC蛋白相對(duì)表達(dá)

圖9 qRT-PCR法和ELISA法檢測(cè)H2O2刺激DHBE細(xì)胞后TNF-α、IL-8及MUC5AC的表達(dá)

圖10 免疫熒光法檢測(cè)H2O2和(或)RvD1作用后的DHBE細(xì)胞中MUC5AC ×400

3 討論

國(guó)內(nèi)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，40歲以上成人慢阻肺的患病率為13.7%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而氧化應(yīng)激是COPD患者疾病進(jìn)展的重要誘發(fā)因素，氧化應(yīng)激啟動(dòng)和加重了炎癥反應(yīng)，同時(shí)參與氣道黏液高分泌。

該研究中主要采用HO刺激DHBE細(xì)胞制備體外氧化應(yīng)激模型，HO刺激后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，p-IKKβ和p-NF-κB表達(dá)增加；同時(shí)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8和MUC5AC的表達(dá)升高，而NAC處理細(xì)胞后能降低上述表達(dá)。以上研究結(jié)果表明氧化應(yīng)激可增強(qiáng)DHBE細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和黏液高分泌，而NAC抑制了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平并且通過IKKβ/NF-κB信號(hào)通路減少炎癥性黏液高分泌。既往研究也支持氧化應(yīng)激可以通過NF-κB的胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥物質(zhì)釋放和黏蛋白的表達(dá)。

IKKβ/NF-κB是一種廣泛存在的炎癥信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的炎癥、免疫、增殖和凋亡等多種基因的表達(dá)，因此，抑制IKKβ/NF-κB信號(hào)通路在一定程度上可以起到治療COPD患者的作用。同時(shí)，IKKβ/NF-κB信號(hào)通路也是連接炎癥因子和胰島素抵抗的最主要信號(hào)通路，NF-κB介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的放大和持續(xù)，抑制胰島素信號(hào)通路，導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生，對(duì)COPD患者的合并癥也有很大影響。

進(jìn)一步研究表明，消退素RvD1抑制了p-NF-κB的表達(dá)，減少了炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-8的表達(dá)及MUC5AC的分泌。既往研究也表明，RvD1在炎癥性疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，對(duì)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的人小支氣管上皮細(xì)胞、IL-6、IL-8等多種炎癥因子的表達(dá)有抑制作用。但是，RvD1在抑制黏蛋白表達(dá)的作用上尚不是十分明確。研究表明，RvD1治療慢性過敏性眼病模型中的杯狀細(xì)胞黏蛋白分泌。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RvD1可通過NF-κB信號(hào)通路抑制HO介導(dǎo)的DHBE炎癥反應(yīng)及黏液高分泌。