sigma-1受體對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲影響的實(shí)驗(yàn)研究

張紅麗，徐小立，戴永錚，應(yīng)松成，蔣 勇,4

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)患者占所有口腔惡性腫瘤的90%以上，且容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。早期患者的5年生存率約為55%～60%，晚期患者的5年生存率僅為30%～40%。探索并識(shí)別新的診斷和治療分子，從而實(shí)現(xiàn)OSCC的早發(fā)現(xiàn)和早治療，改善預(yù)后，仍然是當(dāng)前OSCC研究的主要任務(wù)。研究表明sigma-1受體是一種具有伴侶活性的非阿片類獨(dú)立受體，包括sigma-1受體和sigma-2受體2種亞型。sigma-1受體(簡稱Sig1R，又稱σ1受體)分子量約26 ku，含223個(gè)氨基酸，其基因定位和蛋白結(jié)構(gòu)較sigma-2受體更清晰，具有更廣泛的特征。研究表明sigma-1受體在結(jié)直腸癌、前列腺癌、宮頸癌和乳腺癌等中呈高表達(dá)，并參與癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。研究表明，sigma-1受體的表達(dá)與乳腺癌患者的總生存率降低相關(guān)，且sigma-1受體在細(xì)胞水平上增強(qiáng)細(xì)胞增殖和遷移。在乳腺癌中的研究表明，sigma-1受體的表達(dá)增加了電壓門控鈉離子通道亞型Nav1.5的電流密度，提示sigma-1受體可能通過增加Nav1.5活性進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞侵襲。該研究擬檢測(cè)sigma-1受體在OSCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討sigma-1受體在OSCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用及sigma-1受體與Nav1.5之間可能的相互作用，為OSCC的治療提供新的診斷和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM 高糖培養(yǎng)基、PBS購自美國Hyclone 公司；胎牛血清(FBS)購自烏拉圭ExCell公司；胰酶細(xì)胞消化液、RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE配膠試劑盒、0.5% Trixton X-100、DAPI、DAB、CCK-8試劑盒、結(jié)晶紫均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；sigma-1受體和Nav1.5多克隆抗體購自美國Affinity公司；IgG標(biāo)記的山羊抗鼠、抗兔二級(jí)抗體購自北京中杉金橋公司；FITC標(biāo)記的熒光二抗購自成都正能生物公司；PVDF 膜購自美國Millipore公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自南京諾唯贊公司；Lipofectamine2000購自美國 Thermo Fisher 公司；Matrigel 膠、Transwell 小室購自美國 Corning公司；人OSCC細(xì)胞系(SCC-4、HSC-3、CAL-27和SCC-9)由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；人OSCC組織及鄰近正常組織取自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科。

1.2 方法

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細(xì)胞培養(yǎng) OSCC細(xì)胞系SCC-4、HSC-3、CAL-27和SCC-9在添加了10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液的高糖型DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞長至90%左右用胰酶細(xì)胞消化液消化傳代。

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免疫組織化學(xué)檢測(cè) 為了防止破壞組織抗原性，石蠟包埋的組織切片被放置在60 ℃恒溫箱中烘烤2 h，隨后用二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟和水化。用3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗后將切片放入裝有磷酸鹽緩沖液(PBS)的容器中，并在微波爐中加熱15 min以促進(jìn)抗原修復(fù)。將冷卻后的切片用山羊血清封閉15 min，然后加入抗sigma-1受體的一抗(1 ∶200)后4 ℃孵育過夜。將切片與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二級(jí)抗體(1 ∶1 000)室溫孵育90 min，并用DAB顯色，蘇木精復(fù)染。最后用中性樹脂封片后觀察切片，并使用Image J軟件進(jìn)行分析。

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細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將長好細(xì)胞的爬片用4%多聚甲醛固定15 min，然后在室溫下用0.5% Trixton X-100室溫通透20 min。隨后，在PBS浸洗后的爬片上滴加正常山羊血清封閉細(xì)胞30 min。加入稀釋好的抗sigma-1受體的一抗(1 ∶200)，并在4 ℃孵育過夜，第二天加入FITC標(biāo)記的熒光二抗(1 ∶200)在濕盒中37 ℃避光孵育2 h。然后用DAPI對(duì)細(xì)胞核染色5 min后，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

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4

Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞用RIPA裂解液處理以獲得總蛋白裂解物，蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定，隨后按比例加入蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物后-20 ℃保存。樣品用10%(sigma-1 受體)或6%(Nav1.5)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用5%奶粉室溫封閉2 h。將膜與稀釋好的一抗在4 ℃孵育過夜，隨后用相應(yīng)的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗孵育90 min。最后，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，蛋白質(zhì)印跡條帶通過密度分析定量。

1

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2

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qRT

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PCR實(shí)驗(yàn) 按照制造商的說明，用TRIzol試劑從OSCC細(xì)胞中提取總RNA。然后用引物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行基因合成，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。定量聚合酶鏈反應(yīng)在20 μl的反應(yīng)體積中進(jìn)行擴(kuò)增，每組3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件如下：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。所有引物均由上海生物工程公司進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

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6

siRNA轉(zhuǎn)染 根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine2000用Sig1R-siRNA或陰性對(duì)照的siRNA-NC轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，用添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基代替無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后在轉(zhuǎn)染后24 h或48 h收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。所有siRNAs均由上海吉瑪制藥有限公司合成。相關(guān)siRNA序列見表2。

表2 siRNA序列

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CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 根據(jù)制造商的說明，使用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖情況。對(duì)照組和經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后的CAL-27細(xì)胞重新接種在96孔板中(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔)并培養(yǎng)至24、48、72 h。在指定的時(shí)間加入CCK-8溶液(10 μl /孔)后37 ℃培養(yǎng)2 h，顯色反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度值(optical density，OD)。

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2

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Transwell實(shí)驗(yàn) Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)是將各組細(xì)胞血清饑餓過夜，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后取200 μl接種到Transwell小室的上室中，然后在下室中加入600 μl含有20% FBS作為化學(xué)引誘劑的DMEM培養(yǎng)基。在37 ℃孵育24 h后(侵襲48 h)，用棉簽輕輕擦去上室中剩余的細(xì)胞，然后將黏附在過濾器下表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min,并用結(jié)晶紫染色30 min。在倒置顯微鏡下觀察被侵入或遷移的細(xì)胞圖像，并進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)除需要在細(xì)胞接種前在上室中預(yù)先涂好基質(zhì)凝膠外，其余方法與遷移實(shí)驗(yàn)一致。

圖1 免疫組化法檢測(cè)sigma-1受體的表達(dá)

2 結(jié)果

2.1 sigma-1受體在人OSCC組織中的表達(dá)情況

免疫組化檢測(cè)臨床收集的OSCC組織及鄰近正常組織中sigma-1受體的表達(dá)。結(jié)果顯示OSCC組織中可見明顯的棕黃色染色，表明sigma-1受體呈陽性表達(dá)；相反，在正常組織中幾乎看不到棕黃染色，見圖1。結(jié)果表明，與正常組織比較，sigma-1受體在OSCC中呈高表達(dá)(

P

<0.05)。

2.2 sigma-1受體的表達(dá)水平與OSCC患者預(yù)后的相關(guān)性

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析sigma-1受體表達(dá)水平與OSCC患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果表明，sigma-1受體的表達(dá)水平與OSCC患者的總體生存率呈負(fù)相關(guān)，即sigma-1受體表達(dá)水平高的患者的總體生存率低于表達(dá)水平較低者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見圖2。提示sigma-1受體的高表達(dá)可能影響OSCC患者的生存和預(yù)后。

圖2 sigma-1受體表達(dá)水平與OSCC患者總生存率的相關(guān)性

2.3 sigma-1受體在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)情況及定位

Western blot檢測(cè)了sigma-1受體在4種OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平，包括SCC- 4、HSC-3、CAL-27和SCC-9。結(jié)果表明sigma-1受體在4種人OSCC細(xì)胞系中均有表達(dá)，且在CAL-27細(xì)胞中sigma-1受體的表達(dá)水平高于其他細(xì)胞，見圖3A，因此，選擇CAL-27細(xì)胞用于之后的研究。此外，還通過細(xì)胞免疫熒光分析檢測(cè)sigma-1受體在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)定位，激光共聚焦結(jié)果顯示sigma-1受體在CAL-27細(xì)胞中主要表達(dá)在質(zhì)膜上，見圖3B。

圖3 sigma-1受體在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)及定位

2.4 Sig1R-siRNA對(duì)CAL-27細(xì)胞中sigma-1受體表達(dá)水平的抑制作用

為了檢測(cè)Sig1R-siRNA在CAL-27細(xì)胞中的沉默效果，分別通過qRT -PCR和Western blot檢測(cè)了sigma-1受體在Control組、siRNA-NC組以及3種Sig1R-siRNA中的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。與Control組比較，Sig1R-siRNA 1組、Sig1R-siRNA 2組和Sig1R-siRNA 3組sigma-1受體的mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)。sigma-1受體的蛋白表達(dá)水平僅被Sig1R-siRNA 2和Sig1R-siRNA 3有效下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。與之相反，Control 組和 siRNA-NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。這些數(shù)據(jù)表明Sig1R-siRNA能有效地抑制CAL-27細(xì)胞中sigma-1受體的表達(dá)水平，接下來的實(shí)驗(yàn)均采用Sig1R-siRNA 3 轉(zhuǎn)染。

圖4 經(jīng) siRNA轉(zhuǎn)染后 sigma-1受體的表達(dá)水平

2.5 下調(diào)sigma-1受體表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

通過CCK-8和Transwell分析探究了sigma-1受體在OSCC細(xì)胞CAL-27發(fā)展中的作用。分別在轉(zhuǎn)染24、48、72 h后檢測(cè)細(xì)胞OD值，CCK-8測(cè)定結(jié)果顯示，與Control組和NC組相比，轉(zhuǎn)染24 h后，Sig1R-siRNA3組的細(xì)胞增殖能力顯著降低(

F

=3.04，

P

<0.05)。見圖5A。通過Transwell試驗(yàn)檢測(cè)了下調(diào)sigma-1受體表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。與Control組和NC組比較，Sig1R-siRNA3組明顯抑制CAL-27細(xì)胞的遷移和侵襲(

F

=0.145、0.009，

P

<0.01)。Control 組和 siRNA-NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5B、C。研究證明下調(diào)sigma-1受體可以顯著抑制CAL-27細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖5 經(jīng) siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.6 沉默sigma-1受體表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞中Nav1.5表達(dá)的影響

分別采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)了轉(zhuǎn)染Sig1R-siRNA 3后CAL-27細(xì)胞中Nav1.5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，與Control組和NC組相比，Sig1R-siRNA 3組沉默sigma-1受體表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)Nav1.5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平也明顯降低(

F

=1.28，

P

<0.05)。見圖6。結(jié)果表明sigma-1受體可能通過與Nav1.5的相互作用從而影響OSCC生物學(xué)行為的改變。

圖6 沉默sigma-1受體表達(dá)后CAL-27細(xì)胞內(nèi)Nav1.5的表達(dá)水平

3 討論

sigma受體最初被誤認(rèn)為是阿片受體亞型，隨后研究表明其是一種獨(dú)特的藥理學(xué)調(diào)控的伴侶或支架蛋白，獨(dú)立于任何其他已知的受體。sigma-1受體最初主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行研究，臨床研究表明sigma-1受體與許多疾病相關(guān)，如抑郁癥、神經(jīng)退行性疾病和藥物成癮等。研究表明，sigma-1受體在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和惡性黑色素瘤等多種人類癌細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)，sigma-1受體通過介導(dǎo)脂質(zhì)筏重構(gòu)影響乳腺癌細(xì)胞系的黏附和增殖。研究表明，siRNA沉默sigma-1受體以及sigma-1受體配體藥物可以抑制乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。因此，sigma-1受體作為癌癥潛在的新治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物，具有重要的研究價(jià)值。該研究表明sigma-1受體在OSCC組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，通過轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)sigma-1受體表達(dá)顯著抑制了OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲行為，表明sigma-1受體可作為OSCC治療靶點(diǎn)和預(yù)后生物標(biāo)志物的可能性，為OSCC的治療提供了新的方向。

研究表明Nav1.5參與OSCC的發(fā)生發(fā)展，在乳腺癌中的研究表明sigma-1受體通過與Nav1.5通道的功能性相互作用增加了乳腺癌細(xì)胞的侵襲和黏附能力，在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中sigma-1受體以4倍對(duì)稱性結(jié)合Nav1.5通道，增加Nav1.5電流密度，使細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。在MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中，sigma-1受體通過與幼稚型Nav1.5通道的功能作用增加了細(xì)胞對(duì)底物的黏附。電壓門控鈉離子通道(VGSCs)已被證明在多種癌癥組織和細(xì)胞中異常表達(dá)，并與腫瘤的惡性表型和侵襲轉(zhuǎn)移明確相關(guān)。課題組前期研究表明，低分化OSCC組織中Nav1.5的表達(dá)水平高于高分化OSCC組織，其表達(dá)水平與NLR、PLR、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA沉默Nav1.5基因可顯著抑制OSCC細(xì)胞的生物學(xué)行為。該研究表明轉(zhuǎn)染Sig1R-siRNA沉默sigma-1受體表達(dá)后，CAL-27細(xì)胞中Nav1.5的表達(dá)水平也隨之降低。因此，研究OSCC中sigma-1受體與Nav1.5可能的相互作用機(jī)制及其配體藥物對(duì)癌細(xì)胞功能的影響具有重要意義和價(jià)值。該研究通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明sigma-1受體可以分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，在靠近核周區(qū)有聚集分布，可能是在線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，這與之前文獻(xiàn)中的研究結(jié)果是一致的。綜上所述，該研究表明sigma-1受體參與OSCC的發(fā)生發(fā)展，并為OSCC的診斷和治療提供了新的思路。