調(diào)控ABCG2對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的機(jī)制研究

于 超，王亦高，楊 天，徐 龍，張 震

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族G2(ABCG2)是編碼人類腫瘤多藥耐藥的ABC運(yùn)輸超家族成員之一，ABCG2蛋白最初是在乳腺癌耐藥細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的，故又稱為乳腺癌耐藥蛋白，ABCG2自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直是研究的熱點(diǎn)，最新研究表明ABCG2蛋白與多種腫瘤包括胃癌的耐藥性相關(guān)。研究表明ABCG2的表達(dá)上調(diào)可以使藥物外排增加導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。盡管Wang et al研究表明，在多發(fā)性骨髓瘤中，PI3K/Akt信號(hào)通路可以調(diào)控ABCG2活性,但具體機(jī)制不明。PI3K/Akt信號(hào)通路在促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移等周期方面具有重要作用，也對(duì)細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生影響。人類表皮生長(zhǎng)因子2(HER2)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要因子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能。前期研究表明干擾胃癌細(xì)胞HER2表達(dá)后,可以增加胃癌對(duì)一線化療藥物奧沙利鉑的敏感性，干擾HER2后， PI3K、Akt和ABCG2表達(dá)下降。該研究旨在探討是否存在HER2-PI3K/Akt-ABCG2信號(hào)通路，調(diào)節(jié)ABCG2的表達(dá)，對(duì)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生影響，進(jìn)而為下一步對(duì)胃癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

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1 病例資料

收集該院普外科八病區(qū)2018年1月—2019年12月行胃癌根治手術(shù)并經(jīng)免疫組化病理證實(shí)HER2陽(yáng)性及未在術(shù)前使用化療藥物的組織樣本84例。從醫(yī)院病歷系統(tǒng)檢索臨床資料，回顧性分析，所有患者都經(jīng)過(guò)電話隨訪，均知情同意，且該研究已經(jīng)通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可。

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2 主要試劑

人胃癌細(xì)胞株NCI-N87和MKN-7細(xì)胞(武漢普諾賽公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)，慢病毒(上海吉瑪公司)，ABCG2抗體(美國(guó)Abcam公司)，PV6000免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒(北京中杉金橋公司)，TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司)。

1

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3 主要儀器

無(wú)菌細(xì)胞操作臺(tái)(蘇州安泰公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀1510(美國(guó)Thermo Scientific公司)，低速離心機(jī)(湖南湘儀公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，倒置、正置熒光顯微鏡(型號(hào)：DM3000B、DM4000，德國(guó)Leica公司)，全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiQ4600，上海歐翔公司)。

1

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4 方法

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4

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1

免疫組織化學(xué) 石蠟包埋標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，具體步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作。顯微鏡下觀察HER2陽(yáng)性胃癌組織中ABCG2蛋白表達(dá)情況。

1

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4

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2

細(xì)胞培養(yǎng) NCI-N87和MKN-7細(xì)胞用含15%的胎牛血清、100 U/ml青霉素鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞生長(zhǎng)約80%融合度時(shí)，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1

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4

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3

慢病毒設(shè)計(jì)包裝 根據(jù)人ABCG2基因編碼序列，遵循設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒及相關(guān)陰性對(duì)照。

1

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4

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4

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及免疫熒光測(cè)定 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-N87和MKN-7細(xì)胞，胰酶消化，分別種于6孔板中，貼壁后參照慢病毒包裝手冊(cè)進(jìn)行操作，以感染復(fù)數(shù)(MOI)等于10的指數(shù)轉(zhuǎn)染6孔板中細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，加入2 μl終濃度為5 μg/ml的 polybrene篩選1～2周，37 ℃培養(yǎng)，8～12 h根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)換液1次。轉(zhuǎn)染72～96 h后，通過(guò)GFP熒光計(jì)數(shù)法在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光的表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)間來(lái)確定轉(zhuǎn)染情況。將轉(zhuǎn)染成功各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶中繼續(xù)培養(yǎng),得到穩(wěn)定的細(xì)胞。細(xì)胞分組為：未處理的細(xì)胞組為Cell組；過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組為L(zhǎng)V5NC組；過(guò)表達(dá)組為L(zhǎng)V5-homo組；干擾陰性對(duì)照組為L(zhǎng)V3NC組，3種干擾組為L(zhǎng)V3-609組、LV3-1158組、LV3-1988組。

1

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4

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5

RT-PCR檢測(cè)ABCG2的表達(dá)情況 按試劑盒說(shuō)明提取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)引物序列，將含有擴(kuò)增序列的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后記錄各組結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參，比較分析各組ABCG2的表達(dá)，見表1。

表1 引物序列

1

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4

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6

Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 上述方法分組處理好的細(xì)胞，細(xì)胞裂解液冰上裂解轉(zhuǎn)染好的NCI-N87和MKN-7細(xì)胞，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford蛋白濃度測(cè)定。依次選用12%的濃縮膠和分離膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗搖床孵育過(guò)夜，TBST清洗，相應(yīng)二抗搖床孵育2 h，TBST和TBS洗膜，ECL發(fā)光顯色對(duì)蛋白進(jìn)行顯色處理，分析結(jié)果。

1

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4

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7

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移能力 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)ABCG2對(duì)細(xì)胞遷移的影響。將NCI-N87細(xì)胞和MKN-7細(xì)胞胰酶消化平鋪于6孔板中，加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)至80%～90%狀態(tài)。用100 μl無(wú)菌槍頭在孔板細(xì)胞中央劃痕(劃痕呈十字型)，再用PBS洗去懸浮細(xì)胞，加入5% FBS完全培養(yǎng)基。劃痕后分別于0、24、48、72 h，在相同位置用倒置顯微鏡拍照，評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移速度。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)胃癌細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)情況

通過(guò)對(duì)臨床標(biāo)本免疫組化檢測(cè)表明，在HER2陽(yáng)性的84例病理標(biāo)本中，ABCG2陽(yáng)性表達(dá)有60例(棕色)，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

2.2 ABCG2的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

收集HER2陽(yáng)性的84例臨床患者的病理結(jié)果，經(jīng)χ檢驗(yàn)ABCG2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，ABCG2陽(yáng)性與年齡性別不相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ABCG2在胃癌組織中的差異表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)和TNM分期存在相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 ABCG2表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2

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3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

經(jīng)熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染的NCI-N87細(xì)胞(圖1)和MKN-7細(xì)胞(圖2)內(nèi)可見綠色熒光。各組慢病毒轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%以上，后以嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞系。

圖1 熒光顯微鏡觀察NCI-N87細(xì)胞各組轉(zhuǎn)染效果 ×100A: LV5NC組; B: LV5- homo組; C: LV3NC組; D: LV3- 609組; E: LV3- 1158組; F: LV3- 1988組

圖2 熒光顯微鏡觀察MKN-7細(xì)胞各組轉(zhuǎn)染效果 ×100A: LV5NC組; B: LV5- homo組; C: LV3NC組; D: LV3- 609組; E: LV3- 1158組; F: LV3- 1988組

2.4 RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中ABCG2的表達(dá)情況

該研究采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后的胃癌NCI-N87和MKN-7細(xì)胞株中ABCG2 mRNA表達(dá)水平變化情況，結(jié)果顯示：LV5-homo組ABCG2 mRNA表達(dá)水平明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=64.390、142.812，

P

<0.01)；LV3-609、LV3-1158、LV3-1988干擾組中ABCG2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=130.916、58.467，

P

<0.05)，其中LV3-1988干擾效果最明顯(

P

<0.01)，效率最高，見圖3、4。

圖3 NCI-N87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后ABCG2 mRNA的表達(dá)量

圖4 MKN-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后ABCG2 mRNA的表達(dá)量

2.5 Western blot檢測(cè)ABCG2蛋白的表達(dá)情況

該研究采用Western blot實(shí)驗(yàn)觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后的胃癌NCI-N87和MKN-7細(xì)胞株中ABCG2蛋白表達(dá)水平變化情況，結(jié)果顯示：LV5-homo組中ABCG2蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=137.137、164.394；

P

<0.01)； LV3-609、LV3-1158、LV3-1988干擾組中ABCG2蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=122.657、555.982；

P

<0.01)，其中LV3-1988組干擾效率最高，見圖5、6。

圖5 Western blot檢測(cè)人胃癌NCI-N87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后ABCG2蛋白表達(dá)

圖6 Western blot檢測(cè)人胃癌MKN-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后ABCG2蛋白表達(dá)

2.6 調(diào)控ABCG2對(duì)HER2-PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

該研究采用Western blot實(shí)驗(yàn)觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后的胃癌NCI-N87和MKN-7細(xì)胞株中的HER2和PI3K/Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的變化情況。結(jié)果顯示：LV5-homo組中HER2、PI3K和P-Akt蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=144.618、351.626、284.821，

P

<0.05)；LV3-1988組中HER2、PI3K和P-Akt蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=426.022、153.050、339.490，

P

<0.05)，見圖7、8。

圖7 Western blot檢測(cè)人胃癌NCI-N87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通路蛋白表達(dá)

圖8 Western blot檢測(cè)人胃癌MKN-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通路蛋白表達(dá)

2.7 調(diào)控ABCG2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

該研究經(jīng)劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株后調(diào)控ABCG2表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移能力的影響，結(jié)果顯示：LV5-homo組在培養(yǎng)24、48和72 h后遷移能力明顯增強(qiáng)，與LV5NC組、Cell組和LV3-1988組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[

F

=(2

.

649

vs

42

.

402)、(2

.

938

vs

56.217)、(33.420

vs

29

.

886)，

P

<0.05]，表明增強(qiáng)ABCG2基因的表達(dá)后，能明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移，見圖9、10和表3、4。

圖9 ABCG2表達(dá)對(duì)胃癌NCI-N87細(xì)胞遷移的影響 ×100與Cell組、LV5NC組和LV3-1988組比較：*P<0.05、**P<0.01；與Cell組和LV3NC組比較：#P<0.05

圖10 ABCG2表達(dá)對(duì)胃癌MKN-7細(xì)胞遷移的影響 ×100與Cell組、LV5NC組和LV3-1988組比較：*P<0.05；與Cell組、LV3NC組和LV5-homo組比較：△△P<0.01

表3 NCI-N87各組細(xì)胞遷移距離的比較

表4 MKN-7各組細(xì)胞遷移距離的比較

3 討論

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)全國(guó)腫瘤登記中心發(fā)布的《2015中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》顯示，胃癌發(fā)病率與病死率居所有癌癥前三。胃癌的治療方案是以手術(shù)為主，結(jié)合放化療的綜合治療。許多患者雖然接受了胃癌根治性切除術(shù)和規(guī)范的術(shù)后治療，但仍出現(xiàn)腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

ABCG2是一種結(jié)合盒式運(yùn)輸機(jī)，其主要通過(guò)水解ATP產(chǎn)生運(yùn)輸功能。典型的ABCG2由兩個(gè)高度保守的 ATP 綁定域和兩個(gè)跨膜域組成，并能識(shí)別多種抗癌藥物，其自身也是生物體內(nèi)自我保護(hù)機(jī)制的重要組成部分。有研究表明，在多種類型的細(xì)胞中，ABCG2對(duì)細(xì)胞自噬產(chǎn)生重要作用，在表達(dá)ABCG2的細(xì)胞中，觀察到更高的自噬率。研究表明通過(guò)下調(diào)ABCG2基因的表達(dá)，有抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)也存在防止凋亡的作用。

該研究表明在HER2陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞中ABCG2高表達(dá)，ABCG2與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)。課題組前期發(fā)現(xiàn)HER2可以間接調(diào)控ABCG2，產(chǎn)生耐藥作用。為了明確ABCG2對(duì)胃癌的影響，該研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌NCI-N87和MKN-7細(xì)胞，調(diào)控ABCG2以探究對(duì)胃癌細(xì)胞的影響。通過(guò)轉(zhuǎn)染后PCR和Western blot檢測(cè)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是成功的，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明調(diào)控ABCG2基因表達(dá)后，在ABCG2過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞中遷移明顯增快，結(jié)果顯示ABCG2參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移活動(dòng)。另外PI3K/Akt信號(hào)通路可以調(diào)控ABCG2活性，而干擾HER2后，PI3K、P-Akt和ABCG2表達(dá)下降，所以該研究進(jìn)一步通過(guò)Western blot分析HER2和PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示ABCG2與HER2、PI3K、Akt和P-Akt呈現(xiàn)正反饋聯(lián)系。綜上所述，ABCG2可能對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等產(chǎn)生重要作用，且通過(guò)向上調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路，在HER2陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞中產(chǎn)生重要影響，這可能作為胃癌耐藥機(jī)制研究的一個(gè)新思路。