ANXA1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義

營曉梅，陳 亮，吳晴晴，曹立宇，余宏鑄

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中常見腫瘤，占甲狀腺結(jié)節(jié)的5%～10%。甲狀腺癌約80%～85%的病理類型是甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，10年生存率可達(dá)90%以上。但有些特殊類型的PTC，具有明顯的侵襲性及轉(zhuǎn)移性。因此，PTC發(fā)病機(jī)制的深入研究以及尋找潛在的靶標(biāo)對臨床診斷具有重要的指導(dǎo)意義。

膜聯(lián)蛋白 A1( annexin-A1，ANXA1)是與細(xì)胞膜上的磷脂結(jié)合的一類蛋白質(zhì),包含N末端、 C末端，其中C端高度保守，基本不參與細(xì)胞相關(guān)活動，而 N端參與多種組織的生理病理過程，從而影響細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等過程。目前關(guān)于ANXA1與PTC的聯(lián)系鮮有報(bào)道，為了更好的了解和檢測PTC發(fā)生的分子機(jī)制，該研究驗(yàn)證ANXA1在PTC中表達(dá)，并比較其臨床病理特征，探討ANXA1是否可以成為PTC潛在生物標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1

.

1

.

1

病例資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院2019年1月—2020年3月石蠟組織標(biāo)本，其中56例PTC、26例NT、33例NG；并收集甲狀腺結(jié)節(jié)組織和鄰近的甲狀腺正常組織或?qū)?cè)甲狀腺腺葉組織，在手術(shù)室中切除后用液氮進(jìn)行速凍，在病理學(xué)的診斷下，確診為PTC、NT、NG；剩余組織放入-80 ℃冰箱中儲存。該研究由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院倫理委員會授權(quán)。上述所有患者均已簽署知情同意書。

1

.

1

.

2

主要試劑 ANXA1抗體(ab214486)購自英國Abcam公司 ；DAB染色液(增強(qiáng)聚合物法)試劑盒、EDTA抗原修復(fù)液、PBS緩沖液均購自福州邁新有限公司；TRIzol購自上海Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)和qRT-PCR試劑盒(RR0820)購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1

.

2

.

1

生物信息學(xué)分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫中，對獲得的58例正常甲狀腺組織(normal thyroid,NT)和508例甲狀腺癌組織數(shù)據(jù)，進(jìn)行ANXA1的差異表達(dá)分析；并對其中配對的58例NT與甲狀腺癌組織進(jìn)行比較；對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，獲得ANXA1的表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系。

1

.

2

.

2

免疫組化 將收集的石蠟標(biāo)本，制成3 μm厚度切片，烤干后，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，PBS緩沖液沖洗，EDTA修復(fù)抗原，按照DAB染色液(增強(qiáng)聚合物法)試劑盒說明書，依次添加過氧化物酶阻斷劑、ANXA1一抗(工作濃度1 ∶28 000)、反應(yīng)增強(qiáng)液、酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB顯色、復(fù)染、二甲苯透明、封片。最后的成片，分別由3位病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行相應(yīng)讀片，記錄讀片結(jié)果。

1

.

2

.

3

免疫組化結(jié)果判讀 免疫組化觀察標(biāo)準(zhǔn)為染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積，染色深淺：明顯沒有染色為0分，淺黃色1分，黃棕色2分，棕褐色3分。陽性細(xì)胞百分比≤5%記為0分，≤25%記為1分，≤50%為2分，≤75%為3分，75%以上可記為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比所得的數(shù)值相乘<4分為低表達(dá)，分值≥4分為高表達(dá)。

1

.

2

.

4

qRT

-

PCR法檢測 對收集到的PTC、NT及NG組織按照TRIzol試劑說明提取總RNA，并進(jìn)行濃度測定，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明獲得cDNA，PCR擴(kuò)增的條件為第一步預(yù)變性95 ℃、5 min，第二步循環(huán)40次，95 ℃、15 s，60 ℃、31 s，GAPDH作為內(nèi)參，采用2法計(jì)算上述3組中ANXA1 mRNA的相對表達(dá)量。Human-ANXA1的引物(F：5′-TGTGAAGTCATCCAAAGGTGG-3′；R：5′-GCTGTGCATTGTTTCGCTTA-3′)；Human-GAPDH引物(F：5′-ACTTTGGTATCGTGGAAGGAC-3′；R：5′-AGTAGAGGCAGGGATGATGTT-3′)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對NT、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(nodular goiter,NG)和PTC中免疫組化結(jié)果進(jìn)行χ檢驗(yàn)，對ANXA1 mRNA的表達(dá)結(jié)果應(yīng)用方差分析，對ANXA1與臨床病理參數(shù)分析應(yīng)用χ檢驗(yàn)

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺癌中ANXA1的表達(dá)情況

在TCGA網(wǎng)站下載的數(shù)據(jù)信息中，包含了58例NT和508例甲狀腺癌組織，ANXA1在甲狀腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)(

P

<0.05)，見圖1。其中配對的58例癌旁NT與甲狀腺癌組織中ANXA1在甲狀腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)(

P

<0.05)，見圖2。對ANXA1的表達(dá)與患者總生存期的數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)分析后，結(jié)果顯示ANXA1低表達(dá)患者的預(yù)后更差[

HR

=0.09(0.02～0.38)，

P

<0.05]，見圖3。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中ANXA1在甲狀腺癌中表達(dá)情況與正常組織組比較：*P<0.05

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中58例配對甲狀腺正常組織與甲狀腺癌中AXNA1的表達(dá)情況與正常組織組比較：*P<0.05

圖3 TCGA數(shù)據(jù)中ANXA1表達(dá)與甲狀腺癌患者生存期關(guān)系 與ANXA1低表達(dá)組比較：*P<0.05

2.2 ANXA1蛋白在組織中表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，ANXA1在PTC中主要定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，相比于另兩組，ANXA1蛋白在PTC中呈現(xiàn)高表達(dá)，見圖4。比較三者陽性百分率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=54.336，

P

<0.01)，見表1。ANXA1蛋白在PTC組中為0.910 7 ，分別高于癌旁正常組織0.153 8(χ=46.056，

P

<0.01 ) 和NG組 0.303 0(χ=35.560，

P

<0.01)。NT和NG陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=1.788，

P

=0.181)。

圖4 ANXA1在PTC、NG、NT中的表達(dá)情況

表1 不同甲狀腺組織中ANXA1的表達(dá)情況[n(%)]

2.3 ANXA1 mRNA在PTC中相對表達(dá)情況

應(yīng)用qRT-PCR比較上述3組ANXA1 mRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示ANXA1 mRNA在三者比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=8.315，

P

<0.05)，且相比于NT組，ANXA1 mRNA在PTC中相對低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，NG組未見明顯差異，見圖5。

圖5 ANXA1 mRNA在NT、NG、PTC中相對表達(dá)情況

2.4 ANXA1在PTC中的表達(dá)與臨床病理信息的關(guān)系

整理實(shí)驗(yàn)中PTC患者的臨床病理信息，得出ANXA1與PTC患者的性別、年齡及臨床分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與腫瘤部位、直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，見表2。

表2 ANXA1表達(dá)與PTC臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性(n)

3 討論

從TCGA官網(wǎng)中獲得58例NT和508例甲狀腺癌的數(shù)據(jù)信息，分析ANXA1在兩者中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ANXA1在甲狀腺癌中的表達(dá)高于NT；其中配對的58例樣本中，結(jié)果同樣如前所述；對ANXA1的表達(dá)水平與甲狀腺癌患者總生存期的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果提示ANXA1高表達(dá)患者的生存期長于低表達(dá)患者的生存期。因此，ANXA1表達(dá)可能與甲狀腺惡性腫瘤診斷及其臨床預(yù)后相關(guān)。甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升。其中，PTC又是甲狀腺癌中最多見的一種分型。為進(jìn)一步研究PTC與ANXA1的相關(guān)情況，從安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院收集NT、NG、PTC 3種組織的石蠟標(biāo)本及新鮮組織樣本分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和qRT-PCR技術(shù)，在ANXA1蛋白、mRNA水平進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，相較于另兩組組織，ANXA1蛋白在PTC中呈高表達(dá)水平，ANXA1 mRNA水平相較于另兩組表達(dá)量呈下降趨勢；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行PTC患者臨床病理特征與ANXA1的相關(guān)性研究，結(jié)果顯示AXNA1的表達(dá)與患者的性別、年齡、臨床分期無關(guān)，與其腫瘤部位、直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

ANXA1是一種磷脂結(jié)合蛋白，其特有的生理結(jié)構(gòu)使得ANXA1在炎癥與腫瘤中發(fā)揮不一樣的作用。在炎癥中，ANXA1可以通過與FPR2/ALX結(jié)合，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞凋亡并抑制炎癥細(xì)胞聚集，從而起到抗炎的作用。在腫瘤中，ANXA1的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)趨勢，如在胰腺癌、胃癌、肺腺癌中的 ANXA1 表達(dá)上調(diào)；而在食管鱗癌、前列腺癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，因此，ANXA1可以被用于疾病診斷或成為預(yù)后標(biāo)志物。在ANXA1相關(guān)機(jī)制的研究報(bào)道中，有些報(bào)道顯示了ANXA1在食管鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌中，增強(qiáng)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力；而在胰腺導(dǎo)管腺癌中，ANXA1降低細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長停滯。因此，ANXA1在不同腫瘤中有不同的表達(dá)且其相關(guān)機(jī)制具有腫瘤特異性，可以作為潛在腫瘤標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)。