肝細(xì)胞癌患者TIM-3+ TIGIT+CD4+ T細(xì)胞和TIM-3+TIGIT+CD8+ T細(xì)胞免疫耗竭及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系

袁潤(rùn)林,鄭美娟，陳正徐，徐元宏

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作為世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，臨床醫(yī)師對(duì)晚期肝癌的治療面臨著巨大挑戰(zhàn)。許多惡性腫瘤的治療選擇靶向免疫檢查點(diǎn)抑制劑。T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(TIGIT)是T細(xì)胞或NK細(xì)胞抑制性受體，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)是一種免疫負(fù)性調(diào)控因子，程序性死亡受體1(PD-1)是一種常見的免疫抑制受體。CD4和CD8調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞參與腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，在腫瘤微環(huán)境中,CD8和CD4T細(xì)胞等免疫細(xì)胞通常伴隨著細(xì)胞表面異常表達(dá)的抑制性受體譜系。而且，針對(duì)單個(gè)免疫檢查點(diǎn)的單克隆抗體在HCC患者的治療中應(yīng)答率較低。

該研究通過檢測(cè)HCC患者外周血CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞中PD-1、TIM-3、TIGIT和白介素(interleukin，IL)-10的表達(dá)，探討免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)狀態(tài)與HCC進(jìn)展、預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)而為逆轉(zhuǎn)免疫細(xì)胞耗竭及HCC的臨床治療提供目標(biāo)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

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1

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1

病例資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 2019年10月—2020年11月30例HCC患者臨床資料。健康對(duì)照組(health controls，HC) 根據(jù)患者的依從性和年齡選擇20例健康人；所有HCC患者診斷均符合《原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》，所有健康者排除患腫瘤、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎。

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2

試劑與儀器 抗體PE-PD-1、BV421-TIM-3、APC-H7-CD8、BV421-IL-10、BV510-CD3均購自美國(guó) BD 公司；抗體APC-TIGIT購自美國(guó)Biolegend公司；紅細(xì)胞裂解液、CBA Human Th1 / Th2 Cytokine Kit(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-gamma) 購自美國(guó)BD公司；細(xì)胞固定液和穿膜液購自美國(guó)賽默飛公司；Ficoll液購自天津TBD公司；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)、莫能霉素(MON) 購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；離子霉素(ION) 購自美國(guó)Merck Millipore公司。FACS CANTO Ⅱ PLUS 型流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司；DXH800全自動(dòng)血液分析儀購自美國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

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1

標(biāo)本采集 分別采集HCC患者和健康體檢者外周血，置于血清管和EDTA抗凝管；EDTA抗凝血用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-1CD4T細(xì)胞、TIM-3CD4T細(xì)胞、TIGITCD4T細(xì)胞、PD-1CD8T細(xì)胞、TIM-3CD8T細(xì)胞、TIGITCD8T細(xì)胞和IL-10CD4T細(xì)胞的比例，全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類；血清用于 Th1 / Th2細(xì)胞因子檢測(cè)。

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2

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2

分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) 準(zhǔn)備15 ml離心管1支，同時(shí)加入2 ml Ficoll液，將2 ml PBS加入患者和健康人2 ml抗凝全血中進(jìn)行1 ∶1稀釋。然后將稀釋后的全血緩慢加在Ficoll液面，注意沿管壁進(jìn)行緩慢加樣，保持兩液面清晰，不要讓血液混入至分層液內(nèi)。然后置于離心機(jī)中1 900 r/min配平離心30 min后，用吸管將白膜層細(xì)胞緩慢吸至流式試管中，即為外周血分離PBMC。

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2

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3

PD-1CD4T細(xì)胞、TIM-3CD4T細(xì)胞、TIGITCD4T細(xì)胞、PD-1CD8T細(xì)胞、TIM-3CD8T細(xì)胞、TIGITCD8T細(xì)胞的檢測(cè) 分離1×10PBMC后；在流式管中用加樣槍分別加入相應(yīng)抗體BV510-CD3、APC-H7-CD8、PE-PD-1、APC-TIGIT、BV421-TIM-3各10 μl并混勻，將流式管室溫及避光條件下孵育20 min，然后加入2 ml PBS 1 800 r/min 離心5 min，棄上清液，200 μl PBS重懸細(xì)胞沉淀，BD流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，采用Flowjo軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1

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2

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4

IL-10CD4T細(xì)胞的檢測(cè) 分離 PBMC后，將含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基、PMA，MON及ION按照比例配置成內(nèi)標(biāo)刺激液，在細(xì)胞中加入1 ml培養(yǎng)基，混勻之后放入溫箱內(nèi)孵育4 h，然后離心、棄上清液，PBS洗滌1次，分別加入相應(yīng)抗體BV510-CD3、APC-H7-CD8并混勻，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光孵育30 min，加入100 μl固定液4 ℃冰箱避光孵育40 min后加入1 ml穿膜液破膜，PBS洗滌棄上清液后分別加入BV421-IL-10抗體10 μl，混勻后放入4 ℃冰箱內(nèi)孵育60 min。然后加入1 ml PBS 1 800 r/min離心5 min，棄上清液，300 μl PBS重懸細(xì)胞沉淀， BD流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，采用Flowjo軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

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2

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5

CBA技術(shù)用于檢測(cè)Th1 /Th2 細(xì)胞因子 準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品，采用倍比稀釋方法，將9個(gè)試管分別標(biāo)記為原液，1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128和1 ∶256；除原液管外，每根管子內(nèi)加入50 μl稀釋液，再依次轉(zhuǎn)移50 μl至下一管內(nèi)，完成梯度稀釋；然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)的樣本和標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)量確定配置 Mixbeads所需量，配好的Mixbeads 3 500 r/min離心5 min，倒去上清液，并加入體積相同的Serum Enhancement Buffer液，混勻后避光孵育30 min；取新流式管編號(hào)，在每管中依次加入50 μl Mixbeads、50 μl抗體B液、50 μl標(biāo)本血清或配備的標(biāo)準(zhǔn)品，振蕩混勻，避光孵育3 h，然后每管中加1 ml PBS 1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μl PBS重懸，BD流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，細(xì)胞因子濃度采用DIVA 軟件和OriginPro軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 病例資料

30例HCC患者中男性20例，女性10例，年齡37～70(55.2±7.6)歲。20例健康對(duì)照組(HC組)中男性13例，女性7例，年齡35～66(51.8±7.1)歲。HCC組與健康對(duì)照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 HCC患者外周血中CD4

T細(xì)胞相關(guān)表型表達(dá)比例的檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血PBMC中CD4T細(xì)胞，HCC患者組外周血TIM-3CD4T細(xì)胞、TIGITCD4T細(xì)胞、PD-1CD4T細(xì)胞、TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001,

t

=4.042、3.533、3.867、4.327)，見圖1A、B、C。進(jìn)一步檢測(cè)PD-1在HCC患者組外周血TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞和TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞兩組中的表達(dá)，研究表明PD-1TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例高于PD-1TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001,

t

=5.106)，統(tǒng)計(jì)圖見圖1D。

圖1 HCC患者及健康對(duì)照者外周血CD4+ T細(xì)胞表型檢測(cè)

2.3 HCC患者外周血中CD8

T細(xì)胞相關(guān)表型表達(dá)比例的檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血PBMC中CD8T細(xì)胞，HCC患者組外周血TIM-3CD8T細(xì)胞、TIGITCD8T細(xì)胞、PD-1CD8T細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01,

t

=3.346、2.782、2.938)。此外，該研究進(jìn)一步檢測(cè)患者組TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001,

t

=3.852)。見圖2A、B、C。進(jìn)一步檢測(cè)PD-1在HCC患者組外周血TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞和TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞兩組中的表達(dá)，研究表明PD-1TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例高于PD-1TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001,

t

=4.642)，見圖2D。

圖2 HCC患者及健康對(duì)照者外周血CD8+ T細(xì)胞表型檢測(cè)

2.4 HCC患者外周血中TIM-3

TIGIT

CD8

T細(xì)胞比例與TIM-3

TIGIT

CD4

T細(xì)胞比例的ROC曲線分析

利用 ROC曲線分析外周血中TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例與TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例在HCC的診斷價(jià)值，該研究表明TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例在HCC的診斷效能(AUC=0.915,cutoff value=1.95%, 95%

CI

: 0.839～ 0.991)均大于TIM-3CD8T細(xì)胞比例(AUC=0.796)和TIGITCD8T細(xì)胞比例(AUC=0.772)，見圖3A。同時(shí)，TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例在HCC的診斷效能(AUC=0.950,cutoff value=1.05%, 95%

CI

: 0.897～1.004)均大于TIM-3CD4T細(xì)胞比例(AUC=0.835)和TIGITCD4T細(xì)胞比例(AUC=0.780)，見圖3B。

圖3 HCC患者外周血中CD8+ T細(xì)胞與 CD4+ T細(xì)胞高表達(dá)抑制性受體的ROC曲線分析

2.5 比較HCC患者及健康對(duì)照者外周血IL-10

CD4

T細(xì)胞表達(dá)的百分比及血清IL-10含量

HCC患者組外周血IL-10CD4T細(xì)胞在患者外周血中表達(dá)比例明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001,

t

=4.579)，見圖4A。此外，該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)患者組血清IL-10含量也高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05,

t

=2.046)，見圖4B。

圖4 HCC 患者及健康對(duì)照者外周血IL-10+ CD4+ T細(xì)胞的百分比及血清IL-10含量檢測(cè)

2.6 TIM-3

TIGIT

CD8

T細(xì)胞、TIM-3

TIGIT

CD4

T細(xì)胞比例高低兩組HCC患者中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(NLR)的比較

依據(jù)HCC中TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例cutoff value=1.95%，將HCC患者分為高TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例組和低TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例組，比較兩組患者NLR，高TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例組NLR結(jié)果高于低TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞比例組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05,

t

=2.593)，見圖5A。同時(shí)，依據(jù)HCC中TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例cutoff value=1.05%，將HCC患者分為高TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例組和低TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例組，比較兩組患者NLR，研究結(jié)果表明高TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例組NLR結(jié)果高于低TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05,

t

=2.054)，見圖5B。

圖5 比較TIM-3+ TIGIT+ CD8+ T細(xì)胞比例高低兩組以及TIM-3+ TIGIT+ CD4+ T細(xì)胞比例高低兩組HCC患者NLR

3 討論

淋巴細(xì)胞免疫耗竭現(xiàn)象普遍存在于腫瘤及慢性感染中，其不利于免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷以及病毒感染的清除。在腫瘤及慢性感染中，T細(xì)胞及NK細(xì)胞逐漸失去效應(yīng)功能，并且普遍高表達(dá)抑制性受體。已有研究表明免疫細(xì)胞表達(dá)多種共刺激、共抑制性受體和其相應(yīng)的配體相結(jié)合后，通過對(duì)細(xì)胞的刺激信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞活化，或抑制信號(hào)削弱免疫細(xì)胞的功能，抑制抗腫瘤反應(yīng)，通過阻礙腫瘤清除來促進(jìn)癌癥免疫逃逸。免疫耗竭的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)多種抑制性受體持續(xù)高表達(dá)，抑制性受體在慢性病毒感染和腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮其作用，如： PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3及 TIGIT等。TIGIT屬于脊髓灰質(zhì)炎病毒受體家族，在淋巴細(xì)胞表達(dá)，在效應(yīng)和調(diào)節(jié)性CD4T細(xì)胞、濾泡輔助CD4T細(xì)胞、效應(yīng)CD8T細(xì)胞和NK細(xì)胞中高表達(dá)。該研究TIGIT在HCC患者外周血中CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞表達(dá)比例均高于健康對(duì)照組，提示TIGIT與T細(xì)胞耗竭有關(guān)，阻斷TIGIT可防止T細(xì)胞衰竭并促進(jìn)T細(xì)胞依賴性腫瘤免疫。Zhou et al研究表明從HCC組織分離的CD8和CD4T細(xì)胞上的TIM3、LAG3和CTLA4的表達(dá)明顯高于無腫瘤組織或外周血。該研究表明HCC患者組外周血中TIM-3在CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞的表達(dá)比例也均高于健康對(duì)照組。

TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞和TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞在HCC患者外周血中的表達(dá)比例上調(diào)，這與Liu et al報(bào)道的結(jié)果相似，該研究進(jìn)一步表明PD-1在HCC患者組外周血TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞和TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞兩組中高表達(dá)，同時(shí)HCC的ROC效能分析顯示TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞、TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞比例曲線下面積均高于單一抑制性受體，可見，相較于單一抑制性受體，兩種抑制性受體共表達(dá)的水平對(duì)HCC的診斷更具有價(jià)值，此外，該研究表明HCC患者組外周血PD-1CD4T細(xì)胞、PD-1CD8T細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組；PD-1與HCC的發(fā)生及演進(jìn)有關(guān)，外周淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)可作為HCC監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志；提示免疫細(xì)胞衰竭的程度與抑制性受體在細(xì)胞上的表達(dá)有關(guān)，2個(gè)或2個(gè)以上抑制性受體的共同表達(dá)比單一抑制性受體的高表達(dá)更能代表免疫細(xì)胞衰竭的狀態(tài)。

病毒慢性感染和腫瘤發(fā)生時(shí)，抑炎因子IL-10 通過促進(jìn)T細(xì)胞耗竭與維持病毒長(zhǎng)期存活發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道IL-10在HCC組織中的表達(dá)增加，因?yàn)門h1類細(xì)胞因子在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮非常重要的作用，而IL-10升高抑制了Th1細(xì)胞功能，所以IL-10升高能夠促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。該研究顯示HCC患者組外周血中IL-10CD4T細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組，此外，患者組血清IL-10 含量也高于健康對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)IL-10在HCC免疫逃逸中起重要作用。

有研究表明NLR可以反映促進(jìn)腫瘤的炎癥反應(yīng)和抗腫瘤的炎癥反應(yīng)之間的平衡，NLR水平與HCC患者的預(yù)后有一定的相關(guān)性，NLR值越高，預(yù)后越差。該研究結(jié)果顯示高值組NLR均高于低值組，提示TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞、TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞與HCC疾病進(jìn)展加快和不良預(yù)后有關(guān)，這可能不僅對(duì)預(yù)后具有重要的臨床意義，而且還為免疫治療中的新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

綜上所述，免疫耗竭現(xiàn)象普遍存在于腫瘤微環(huán)境中，HCC患者外周血中普遍高表達(dá)抑制性受體，同時(shí)存在幾種抑制性受體共表達(dá)。而且，相較于單一抑制性受體，兩種抑制性受體共表達(dá)水平對(duì)HCC的診斷更具有價(jià)值，高TIM-3TIGITCD4T細(xì)胞表達(dá)及TIM-3TIGITCD8T細(xì)胞表達(dá)與HCC疾病進(jìn)展加快和不良預(yù)后有關(guān)。針對(duì)于單分子靶向治療較低反應(yīng)率、雙分子或多分子靶向治療可能會(huì)具有更大的臨床意義。該研究通過分析HCC患者外周血中T細(xì)胞表面高表達(dá)抑制性受體及其相關(guān)性研究可能為臨床治療提供了更多、更新穎的靶點(diǎn)，可能在腫瘤患者的免疫檢查點(diǎn)阻斷治療中發(fā)揮作用。