lncRNA PWAR5通過(guò)靶向miR-30a-5p/SOCS3分子軸降低心肌炎心肌細(xì)胞的損傷

盧英紅，遲偉峰，譚玉婷，王春筱，紀(jì)文巖，吳 賽

心肌炎是指心肌受累導(dǎo)致心肌細(xì)胞病變的炎癥性疾病，由多種病因如免疫損傷、細(xì)菌感染、病毒感染等引起。心肌炎可引起心律失常，導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙。心肌炎臨床表現(xiàn)為胸悶、心悸、心律不齊甚至心力衰竭等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者心源性猝死。心肌炎的病理過(guò)程尚不完全明確，臨床治療主要是對(duì)癥治療。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)大于200個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以表觀遺傳的方式調(diào)控基因的表達(dá)，影響細(xì)胞分化、增殖、凋亡等功能。研究表明，lncRNA的異常表達(dá)與各種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。近年來(lái)PWAR5是lncRNA研究的熱點(diǎn)，其在甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤中發(fā)揮的抑癌基因作用。PWAR5在心臟疾病特別是心肌炎中的功能及作用機(jī)制尚不明確。該研究旨在觀察PWAR5在脂多糖誘導(dǎo)心肌炎時(shí)對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

空載慢病毒(含綠色熒光蛋白GFP)、載有PWAR5序列的慢病毒(含綠色熒光蛋白GFP)、miR-30a-5p、miR-NC、PWAR5熒光報(bào)告載體(野生型WT和突變型MT)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。用于解離原代心肌細(xì)胞的3 d新生SD大鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。MTS試劑盒、ELISA試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司。膠原酶Ⅰ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。一抗和二抗購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞解離、培養(yǎng)及分組

采用膠原酶Ⅰ將大鼠心臟組織解離成單細(xì)胞懸液，在37 ℃、5% CO條件下，采用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別載有PWAR5序列的慢病毒和空載慢病毒，定義為PWAR5組和Control組，24 h后在熒光顯微鏡下拍照。每組分別滴加100 μl脂多糖(濃度為10 μmol/L)，孵育24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)PWAR5、miR-30a-5p和SOCS3 mRNA的表達(dá)

每組細(xì)胞加入TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，配制qRT-PCR反應(yīng)體系。PWAR5和SOCS3 mRNA的相對(duì)表達(dá)以α-Tubulin為內(nèi)參，miR-30a-5p的相對(duì)表達(dá)以U6為內(nèi)參。引物序列如下，miR-30a-5p正向引物：ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC，反向引物：CAGTGCGTGTCGTGGAGT；U6正向引物：CGCGCTTCGGCAGCACATATACT，反向引物：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC。α-Tubulin正向引物：CCAAGCTGGAGTTCTCTA，反向引物：CAATCAGAGTGCTCCAGG；PWAR5正向引物：TGATGTGGGTGTTGATAC，反向引物：ACTCAAAGGCAAGAACTA；SOCS3正向引物：CCTGCGCCTCAAGACCTTC，反向引物：GTCACTGCGCTCCAGTAGAA。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性6 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)，采用2法計(jì)算PWAR5、miR-30a-5p和SOCS3 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.4 MTS法檢測(cè)大鼠原代心肌細(xì)胞活力

將脂多糖處理的大鼠原代心肌細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×10個(gè)細(xì)胞。24 h后，避光條件下加20 μl/孔 MTS溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，代表各組大鼠原代心肌細(xì)胞的活力。

1.5 ELISA法檢測(cè)上清液中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors，TNF)-α的含量

收集脂多糖處理后的各組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，比較各組上清液中IL-1β和TNF-α的含量。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例

消化、離心收集脂多糖處理后的大鼠原代心肌細(xì)胞，采用緩沖液進(jìn)行重懸。每組取100 μl細(xì)胞懸液至流式管，分別加Annexin V-FITC溶液和PI溶液各5 μl，充分混勻后在冰箱內(nèi)靜置20 min。上機(jī)前，每管加100 μl緩沖液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞的凋亡比例。

1.7 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證PWAR5的靶基因

采用starBase V 3.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)PWAR5結(jié)合的微小(miRNA)。將PWAR5-WT和PWAR5-MT熒光報(bào)告載體分別與miR-NC或miR-30a-5p共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶活性和海參螢光素酶活性，相對(duì)螢光素酶活性=螢火蟲(chóng)螢光素酶活性值/海參螢光素酶活性值。

1.8 Western blot法檢測(cè)SOCS3蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

胰酶消化各組大鼠原代心肌細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心提取總蛋白。加入上樣緩沖液，100 ℃水浴8 min，進(jìn)行十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。采用5%脫脂牛奶封閉3 h，與一抗在4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。加入二抗孵育3 h，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠原代心肌細(xì)胞中PWAR5的相對(duì)表達(dá)水平

熒光顯微鏡顯示，Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光蛋白，表明細(xì)胞慢病毒感染成功。見(jiàn)圖1。

圖1 Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá) ×100

qRT-PCR結(jié)果顯示，Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細(xì)胞中PWAR5相對(duì)表達(dá)分別為(1.03 ± 0.15)和(9.71 ± 1.20)，PWAR5組PWAR5相對(duì)表達(dá)高于Control組(

t

=7.199，

P

<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細(xì)胞中PWAR5的相對(duì)表達(dá)與Control組比較：**P<0.01

2.2 高表達(dá)PWAR5對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞活力的影響

MTS法結(jié)果顯示，脂多糖處理后的Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細(xì)胞活力分別為(1.02 ± 0.10)和(5.35 ± 0.48)，與Control組相比，PWAR5組大鼠原代心肌細(xì)胞的活力增加(

t

=8.795，

P

<0.01)。

2.3 高表達(dá)PWAR5對(duì)上清液IL-1β和TNF-α含量的影響

ELISA法結(jié)果顯示，脂多糖處理后的Control組和PWAR5組上清液中IL-1β含量分別為(25.13 ± 2.03)pg/ml和(10.28 ± 1.68)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=5.631，

P

<0.01)；Control組和PWAR5組上清液中TNF-α含量分別為(32.26 ± 3.71)pg/ml和(14.26 ± 1.95)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=4.297，

P

<0.01)；與Control組相比，PWAR5組上清液中IL-1β和TNF-α含量均下降。

2.4 高表達(dá)PWAR5對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡比例的影響

流式細(xì)胞術(shù)顯示(圖3)，脂多糖處理24 h后，PWAR5組和Control組大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡比例分別為(12.61 ± 2.05)%和(29.25 ± 2.46)%，與Control組相比，高表達(dá)PWAR5抑制大鼠原代心肌細(xì)胞的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=5.191，

P

<0.01)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PWAR5對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡比例的影響與Control組比較：**P<0.01

2.5 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)PWAR5的靶基因

采用生物信息學(xué)軟件starBase V 3.0預(yù)測(cè)PWAR5可靶向結(jié)合miR-30a-5p。見(jiàn)圖4。

圖4 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)PWAR5的靶基因

2.6 PWAR5與miR-30a-5p的靶向關(guān)系

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，PWAR5-WT/miR-NC組、PWAR5-WT/miR-30a-5p組、PWAR5-MT/miR-NC組和PWAR5-MT/miR-30a-5p組的相對(duì)熒光素酶活性分別為(1.03 ± 0.12)、(0.33 ± 0.05)、(0.96 ± 0.04)和(0.99 ± 0.10)，PWAR5-WT/miR-30a-5p組較PWAR5-WT/miR-NC組降低(

t

=5.350，

P

<0.01)。結(jié)果顯示PWAR5與miR-30a-5p之間可靶向結(jié)合。見(jiàn)圖5。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證PWAR5與miR-30a-5p的靶向關(guān)系與miR-NC組比較：**P<0.01

2.7 高表達(dá)PWAR5對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞中miR-30a-5p和SOCS3 mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，PWAR5組和Control組大鼠原代心肌細(xì)胞miR-30a-5p的表達(dá)分別為(0.29 ± 0.05)和(1.02 ± 0.12)，高表達(dá)PWAR5可抑制miR-30a-5p的表達(dá)(

t

=5.80，

P

<0.01)。PWAR5組和Control組大鼠原代心肌細(xì)胞SOCS3 mRNA的表達(dá)分別為(5.82 ± 0.79)和(1.05 ± 0.08)，高表達(dá)PWAR5可促進(jìn)SOCS3 mRNA的表達(dá)(

t

=6.081，

P

<0.01)。

2.8 高表達(dá)PWAR5對(duì)SOCS3蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，PWAR5組大鼠原代心肌細(xì)胞中SOCS3蛋白的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上升，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)降低。見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot法檢測(cè)SOCS3蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

心肌炎誘發(fā)炎性滲出，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的耗氧量增加，心肌細(xì)胞的活力下降，心肌細(xì)胞凋亡比例增加。心肌炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)是目前心肌炎的主要診斷方式。尋找新的分子靶點(diǎn)對(duì)心肌炎的診斷、治療及預(yù)后具有重要臨床意義。lncRNA廣泛參與調(diào)控各種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。Cao et al報(bào)道，lncRNA HIF1A-AS1在柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的心肌炎中表達(dá)上升，下調(diào)lncRNA HIF1A-AS1表達(dá)可有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡，miR-138是lncRNA HIF1A-AS1的靶基因。Zhang et al報(bào)道，lncRNA ROR通過(guò)影響C-Myc蛋白的表達(dá)，促進(jìn)病毒性心肌炎大鼠心肌的纖維化。研究表明，PWAR5在膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，可抑制腫瘤的增殖和進(jìn)展，與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。PWAR5對(duì)心肌炎時(shí)心肌細(xì)胞的作用及分子機(jī)制并不明確。

該研究結(jié)果顯示，脂多糖處理后，過(guò)表達(dá)PWAR5可抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α的滲出，降低炎癥反應(yīng)。同時(shí)，PWAR5可增強(qiáng)大鼠原代心肌細(xì)胞的活力，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，降低心肌細(xì)胞的損傷。lncRNA發(fā)揮作用的主要方式是“海綿作用”，即互補(bǔ)結(jié)合miRNA，降低miRNA對(duì)其下游靶基因的干擾作用，從而上調(diào)miRNA下游靶基因的表達(dá)。該研究通過(guò)starBase V 3.0預(yù)測(cè)顯示，PWAR5可能互補(bǔ)結(jié)合的miRNA是miR-30a-5p。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步表明，PWAR5可互補(bǔ)結(jié)合miR-30a-5p。研究顯示，急性病毒性心肌炎患者血清外泌體中miR-30a-5p的含量增加，miR-30a-5p通過(guò)靶向干擾細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)促進(jìn)心肌炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的不可逆損傷。SOCS3基因位于染色體17q25.3，SOCS3蛋白在細(xì)胞因子信號(hào)通路中發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控作用，可抑制心肌炎的進(jìn)展。該研究結(jié)果顯示，上調(diào)PWAR5表達(dá)后，大鼠原代心肌細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)下降，SOCS3 mRNA表達(dá)增加，表明PWAR5可通過(guò)靶向結(jié)合miR-30a-5p上調(diào)SOCS3 mRNA的表達(dá)。Western blot檢測(cè)進(jìn)一步顯示，與Control組相比，高表達(dá)PWAR5后，SOCS3、Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，表明PWAR5可抑制大鼠原代心肌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，PWAR5可有效降低脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)大鼠原代心肌細(xì)胞的活力并抑制其凋亡，其分子機(jī)制是PWAR5通過(guò)靶向結(jié)合miR-30a-5p上調(diào)SOCS3基因的表達(dá)。該研究表明PWAR5在心肌炎心肌細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用，可能為心肌炎的靶向治療提供了新的思路。