miR-223-3p通過抑制VHL促進(jìn)牙髓干細(xì)胞成骨分化的研究

陸蓓蓓，朱友明

人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)是人牙髓組織中具有自我更新功能的多能細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。微小RNA(microRNA，miR) 是在真核生物中內(nèi)源性表達(dá)長度為18～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA。有研究表明，miR-223-3p上調(diào)堿性磷酸酶(ALP)活性，擴(kuò)增礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，上調(diào)牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 (DMP-1)的蛋白水平，促進(jìn)DPSCs成牙本質(zhì)分化。低氧誘導(dǎo)因子-1α ( hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α) 是HIF-1的活性單位，其調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)參與骨髓血管生成、血管反應(yīng)和動(dòng)脈血管生成的基因的轉(zhuǎn)錄活性。 HIF-1α和希佩爾林道(Von Hippel-Lindau，VHL)基因是腫瘤低氧反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤血管生成和腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道HIF-1α、VHL與miR-223-3p表達(dá)的關(guān)系。在這項(xiàng)研究中檢測miR-223-3p在低氧誘導(dǎo)DPSCs細(xì)胞中的表達(dá)，研究其對牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響，預(yù)測miR-223-3p的結(jié)合靶點(diǎn)，并研究其與miR-223-3p的關(guān)系，檢測VHL 及HIF-1α基因在DPSCs細(xì)胞中的表達(dá)，探究HIF-1α、VHL與miR-223-3p的表達(dá)在牙髓干細(xì)胞成骨分化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

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細(xì)胞來源 實(shí)驗(yàn)牙髓干細(xì)胞來源于臨床收集年輕因正畸需要拔除的健康前磨牙或阻生齒。

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主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，miR-223-3p模擬物(miR-223-3p mimics )、miR-223-3p抑制劑(miR-223-3p inhibitor)、亂序RNA(scrambled RNA)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，胎牛血清(美國HyClone公司)，RNA抽提試劑TRIzol(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription，RT)試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.2 方法

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細(xì)胞培養(yǎng) 在無菌條件下，劈開牙齒，取出牙髓并切成碎片。首先滴1滴培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中，用消過毒的鑷子把破碎的組織放入培養(yǎng)液。注意組織鋪平不要重疊。在蓋玻片的4角涂上無菌凡士林，輕輕地將蓋玻片蓋在組織上，使其貼壁生長；不要產(chǎn)生氣泡。將DPSCs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入鏈霉素和青霉素，在5% CO、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后，細(xì)胞爬出，待細(xì)胞長到匯合度90%～95%時(shí)進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)所用牙髓干細(xì)胞為第2～4代。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞傳代后，每3 d 換液1次。

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低氧處理DPSCs細(xì)胞 DPSCs細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，低氧處理DPSCs細(xì)胞24 h(O濃度1%，CO濃度5%)。

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MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期的DPSCs細(xì)胞，分為miR對照組和miR-223-3p mimics組，每孔1 800個(gè)細(xì)胞均勻接種于96孔板上，每孔加200 μl培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞。原則上細(xì)胞貼壁后，按時(shí)間梯度添加miR-223-3p mimics處理DPSCs細(xì)胞，加入20 μl MTT 溶液( MTT濃度為5 g/L) ，5% CO,37 ℃繼續(xù)孵育4 h 后吸走上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，搖床低速振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線圖。

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qRT-PCR法測定目的基因miR-223-3p、VHL和HIF-1α以及成骨相關(guān)因子(Runx2、BMP2) 的mRNA 的表達(dá) 總RNA提取及cDNA合成：TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，測濃度后，放在冰上待用。再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR法檢測miR-223-3p、VHL和HIF-1α以及成骨相關(guān)因子(Runx2、BMP2) 的mRNA的相對表達(dá)水平，設(shè)計(jì)合成經(jīng)GenBank檢索的miR-223-3p、VHL、HIF-1α、Runx2、BMP2的引物。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并在紫外燈下觀察電泳帶并拍照。

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Western blot 法檢測HIF-1α 蛋白以及VHL蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞RIPA冰上裂解40 min(加入蛋白酶抑制劑)，每隔5 min，搖勻1次。于4 ℃、12 000 r /min 離心15 min。取上清液到新管中，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，加入等體積2×SDS蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮15 min。使用12%的SDS-聚丙稀酰胺凝膠，用濕式電轉(zhuǎn)移法把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。TBST 沖洗5次，每次8 min，用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液孵育一抗，4 ℃過夜。一抗稀釋比例 β-actin 1 ∶500，HIF-1α 1 ∶200，VHL 1 ∶1 000。第2 天在室溫下孵育二抗1 h 后TBST 洗滌5次，每次8 min。二抗用TBST稀釋1 ∶5 000。配制新鮮HRP底物(A液和B液1 ∶1混合，避光)，在化學(xué)發(fā)光檢測儀上曝光檢測。β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 miR-223-3p在低氧誘導(dǎo)的DPSCs中的表達(dá)增多

低氧誘導(dǎo)DPSCs細(xì)胞24 h(O濃度1%，CO濃度5%)，并選擇常氧下培養(yǎng)24 h(O濃度21%，CO濃度5%)的DPSCs細(xì)胞作為Ctr組。24 h后提取細(xì)胞總RNA，收集蛋白。應(yīng)用qRT-PCR 以及Western blot 方法檢測低氧誘導(dǎo)組與Ctr組的miR-223-3p mRNA 相對表達(dá)水平以及HIF-1α 蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明低氧誘導(dǎo)組DPSCs細(xì)胞中miR-223-3p mRNA相對表達(dá)水平明顯高于Ctr組DPSCs細(xì)胞 (圖1A) ,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)。用Western blot 方法檢測2組DPSCs細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平。正常情況下，HIF-1α 蛋白在DPSCs細(xì)胞中的表達(dá)較低。低氧誘導(dǎo)DPSCs細(xì)胞24 h(O濃度1%，CO濃度5%)，HIF-1α 蛋白表達(dá)明顯增多(圖1B)。

圖1 miR-223-3p在低氧誘導(dǎo)的DPSCs中的表達(dá)

2.2 miR-223-3p靶向調(diào)控VHL

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篩選miR-223-3p靶向作用的基因 通過生物信息學(xué)的方法，在targetscan 上對miR-223-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，顯示miR-223-3p潛在靶向VHL 3′-UTR 146～152位之間的堿基(圖2) 。

圖2 miR-223-3p潛在靶向VHL 3′-UTR 146～152位之間的堿基

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熒光報(bào)告基因驗(yàn)證miR-223-3p靶向調(diào)控VHL 為進(jìn)一步證明上述觀點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)將野生型VHL(wt-VHL)與突變型VHL(mut-VHL)的3′UTR 區(qū)與雙熒光報(bào)道載體pmirGLO連接。將重組載體與miR-223-3p mimics或scramble RNA兩兩組合共轉(zhuǎn)染到hDPSCs細(xì)胞中，比較各組熒光信號的強(qiáng)弱。結(jié)果(圖3)顯示，mut- VHL和miR-223-3p mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞的熒光信號值與mut- VHL和scramble RNA共轉(zhuǎn)染組相比無明顯變化，而將wt- VHL和miR-223-3p mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的熒光信號值與wt- VHL和scramble RNA共轉(zhuǎn)染組比較顯著降低(

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<0.05)。即與miR對照組相比，miR-223-3p顯著抑制了野生型報(bào)告基因的相對活性，但沒有抑制突變型報(bào)告基因的相對活性。

圖3 luciferase 實(shí)驗(yàn)表明miR-223-3p靶向作用于VHL 與miR對照組比較：*P<0.05

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細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證miR-223-3p靶向調(diào)控VHL 將miR-223-3p mimics在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染至DPSCs細(xì)胞，并選擇表達(dá)scramble RNA的DPSCs細(xì)胞作為miR對照組。轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞總RNA和蛋白，用qRT-PCR檢測miR-223-3p mimics組及對照組DPSCs細(xì)胞中miR-223-3p、VHL的mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與miR對照組相比，表達(dá)miR-223-3p mimics的DPSCs細(xì)胞中miR-223-3p的mRNA 表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)(圖4A) ，VHL的mRNA 表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)(圖4B) (

P

<0.05)。通過Western blot 方法檢測HIF-1α、VHL蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與miR對照組相比，表達(dá)miR-223-3p mimics的DPSCs細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)上調(diào)，VHL蛋白的表達(dá)下調(diào)(圖4C)(

P

<0.05)。

圖4 轉(zhuǎn)染后2組miR-223-3p和VHL的mRNA 及HIF-1α、VHL蛋白表達(dá)水平變化

用miR-223-3p inhibitor反向驗(yàn)證miR-223-3p的作用，將miR-223-3p inhibitor在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染至DPSCs細(xì)胞，并選擇表達(dá)scramble RNA的DPSCs細(xì)胞作為miR對照組。轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞總RNA和蛋白，用qRT-PCR檢測miR-223-3p inhibitor組及對照組DPSCs細(xì)胞中miR-223-3p、VHL的mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與miR對照組相比，表達(dá)miR-223-3p inhibitor的DPSCs細(xì)胞中miR-223-3p的mRNA 表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)(圖5A) ，VHL的mRNA 表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)(圖5B) (

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<0.05)。通過Western blot 方法檢測HIF-1α、VHL蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與miR對照組相比，表達(dá)miR-223-3p inhibitor的存在顯著下調(diào)了HIF-1α蛋白的表達(dá)水平，顯著上調(diào)了VHL蛋白的表達(dá)(圖5C)(

P

<0.05)。

圖5 轉(zhuǎn)染后2組miR-223-3p和VHL的mRNA 及HIF-1α、VHL蛋白表達(dá)水平變化

2.3 miR-223-3p對細(xì)胞增殖的影響

將miR-223-3p mimics在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染至DPSCs細(xì)胞，并選擇表達(dá)scramble RNA的DPSCs細(xì)胞作為miR對照組。轉(zhuǎn)染0、12、24、48、72 h 后，通過MTT 實(shí)驗(yàn)檢測miR對照組和miR-223-3p mimics組DPSCs細(xì)胞增殖能力。在培養(yǎng)DPSCs細(xì)胞72 h后，miR-223-3p mimics組較miR對照組細(xì)胞增殖能力則明顯升高(圖6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05) 。研究結(jié)果表明miR-223-3p可能促進(jìn)DPSCs細(xì)胞增殖能力。

圖6 miR-223-3p對細(xì)胞增殖的影響與miR對照組比較：*P<0.05

2.4 miR-223-3p促進(jìn)成骨相關(guān)因子(Runx2、BMP2) 的mRNA的表達(dá)

將miR-223-3p mimics轉(zhuǎn)染至DPSCs細(xì)胞，并選擇表達(dá)scramble RNA的DPSCs細(xì)胞作為miR對照組。分別于轉(zhuǎn)染0、1、4、7、14、21 d后檢測miR-223-3p、VHL、HIF-1α和2個(gè)與成骨密切相關(guān)的基因。與miR對照組相比，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，自第4天起HIF-1α、Runx2和BMP2的mRNA表達(dá)顯著增高，至第21天仍維持高水平，而VHL mRNA的表達(dá)水平自第1天起顯著下降，之后一直維持著低水平(

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<0.05)。以上結(jié)果顯示，miR-223-3p、HIF-1α、Runx2、BMP2的mRNA表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染時(shí)間呈正相關(guān)，VHL的mRNA表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。miR-223-3p促進(jìn)成骨相關(guān)因子(HIF-1α、Runx2、BMP2) mRNA的表達(dá)。見圖7。

圖7 qRT-PCR分析目的基因轉(zhuǎn)染DPSCs后成骨相關(guān)基因和miR-223-3p、VHL、HIF-1α的表達(dá)

3 討論

HIF-1 是一種異源二聚體，由兩個(gè)亞基組成，即O調(diào)節(jié)的HIF-1α 亞基和組成性表達(dá)的HIF-1β 亞基。正常氧濃度下，HIF-1α合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡使HIF-1α保持在低濃度，而在低氧條件下，HIF-1α的降解被抑制并在細(xì)胞內(nèi)積累。HIF-1作為氧信號通路的核心，其生物活性可受到多種低氧誘導(dǎo)因子的調(diào)控，并影響其下游基因的轉(zhuǎn)錄?？梢栽谡麄€(gè)人類基因組的數(shù)千個(gè)位點(diǎn)形成活躍的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活適應(yīng)低氧的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄，包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)、VEGF 和糖酵解酶等，促進(jìn)機(jī)體對低氧環(huán)境的適應(yīng)。研究顯示在牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)中敲除VEGF可降低成骨相關(guān)基因RUNX2、堿性磷酸酶(ALP)和I型膠原(COL1)的表達(dá)，低氧可增強(qiáng)PDLSCs成骨早期ALP、COL1和骨鈣素(OCN)的表達(dá)。

VHL是一個(gè)編碼pVHL抑癌蛋白的抑癌基因，pVHL參與E3 泛素連接酶復(fù)合物(VCBC) 的組成，VCBC 由pVHL、延長蛋白B、C 和Cul2 蛋白等形成。常氧情況下，VCBC可直接和HIF-1α經(jīng)pVHL結(jié)合，泛素化修飾后被蛋白酶體降解。低氧環(huán)境中(或者細(xì)胞缺乏pVHL、)HIF-1α積聚在細(xì)胞核中并與HIF-1β形成HIF-1二聚體，HIF-1轉(zhuǎn)錄激活100～200個(gè)促進(jìn)適應(yīng)低氧環(huán)境的基因。有研究顯示，泛素偶聯(lián)酶E2S (ubiquitin-conjugating enzyme E2S，UBE2S)可通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和VHL/HIF-1α /STAT3途徑增強(qiáng)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。Frost et al首次揭示了一種有效的選擇性化合物，一種名為VH298的VHL抑制劑，它為HIF靶向治療增加了一個(gè)新的維度。研究表明VH298通過抑制羥基化HIF-1泛素化途徑有效地激活HIF-1信號通路，顯著增加成纖維細(xì)胞增殖、血管生成和I型膠原- a2l1 (Col1- a2l1)、血管內(nèi)皮生長因子A (VEGF-A)和胰島素樣生長因子1 (IGF-1)的基因表達(dá)。

有研究表明，miR-223-3p通過靶向SHOX2抑制口腔鱗癌的增殖和轉(zhuǎn)移。研究通過檢測50例口腔癌患者治療前后血清miR-223-3p的變化，顯示血清中miR-223-3p的相對表達(dá)水平在研究中低于對照組，治療后miR-223-3p表達(dá)明顯高于治療前。另有研究顯示，抑制miR-223-3p可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平顯著降低VEGFA的表達(dá)，過表達(dá)miR-223-3p可顯著提高VEGFR2的表達(dá)。

該實(shí)驗(yàn)通過低氧誘導(dǎo)DPSCs細(xì)胞顯示miR-223-3p的mRNA 相對表達(dá)水平明顯高于Ctr組，推測miR-223-3p可能與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)。通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測miR-223-3p的潛在結(jié)合靶點(diǎn)，顯示miR-223-3p可能靶向VHL 3′-UTR 146～152位的之間的堿基。且經(jīng)luciferase 實(shí)驗(yàn)表明，將miR-223-3p mimics轉(zhuǎn)染至DPSCs細(xì)胞中，顯示VHL的mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，HIF-1α蛋白表達(dá)水平上調(diào)，VHL蛋白表達(dá)水平下調(diào)；而將miR-223-3p inhibitor轉(zhuǎn)染至DPSCs細(xì)胞中，顯示VHL的mRNA 表達(dá)水平上調(diào)，HIF-1α蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)， VHL蛋白表達(dá)水平上調(diào)。該研究表明miR-223-3p靶向VHL 3′-UTR，抑制HIF-1α 的降解使HIF-1α 在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)。將miR-223-3p mimics成功轉(zhuǎn)染后檢測miR-223-3p、VHL、HIF-1α和2個(gè)與成骨密切相關(guān)基因的表達(dá)情況。初步證實(shí)了體外miR-223-3p通過抑制VHL基因促進(jìn)HIF-1α表達(dá)來促進(jìn)牙髓干細(xì)胞成骨分化，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果給體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究奠定了基礎(chǔ)。另有研究通過構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染DPSCs，結(jié)果顯示其中突變組可以在常氧條件下穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α。在體外，HIF-1α通過促進(jìn)VEGF的表達(dá)促進(jìn)DPSCs血管向分化。