等離子體激活液對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖與凋亡作用及相關(guān)機制

張晨晨，楊興宇，高 靜，王儷昀，趙 軍，夏傳開，呂永梅，楊春俊

嬰兒血管瘤(infantile hemangioma，IH)是嬰兒常見的良性腫瘤，由胚胎期血管組織增生形成的，以血管內(nèi)皮細胞異常增生為特點，發(fā)生于皮膚及軟組織的良性腫瘤。常用的治療方法有冷凍、激光、口服普萘洛爾、局部注射抗細胞增生性藥物等，但是這些療效并不滿意，且存在嚴重不良反應(yīng)，尋找新的安全高效的治療手段仍是IH治療中需要解決的問題。

等離子體是除固體、液體和氣體外物質(zhì)的第4種狀態(tài)，是由氣體在高電壓環(huán)境下被離子化后產(chǎn)生的包含分子、原子、離子、電子、光子和活性物質(zhì)等組成的一種混合存在形式。低溫等離子體(cold atmospheric plasma, CAP)因其溫度接近正常人體溫度，有效殺滅病原微生物、促進傷口愈合和抑制體內(nèi)外癌細胞而受到越來越多的關(guān)注。尤其是等離子體激活液(plasma-activated solution, PAS)可以選擇性抑制癌細胞增生，使得人們對PAS未來應(yīng)用于惡性腫瘤的治療充滿了期待。該研究探討PAS對體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細胞(hemangioma endothelial cells, HemECs)的抑制效應(yīng)及機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

HemECs細胞(上海青旗公司)。磷酸鹽緩沖液(PBS)、高糖DMEM 培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(澳大利亞Gibco公司)，AKT抗體、PI3K抗體、p-AKT抗體、p-PI3K抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(美國Affinity公司)，NO試劑盒、O試劑盒、HO試劑盒(德國MERCK公司)，胰蛋白酶、CCK-8試劑盒、細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博公司)。流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)，熒光酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 HemECs細胞培養(yǎng)

將HemECs細胞置于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在含有5% CO、溫度為37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長至70%～80%時傳代，用0.25%胰蛋白酶消化，按1 ∶3的比例傳代。

1.3 PAS的制備

該研究中使用的DBD等離子體發(fā)生裝置由中國科學(xué)院等離子體物理研究所開發(fā)和設(shè)計。該DBD裝置主要包括3部分：交流電源，面式正極和接地負極。吸取4.0 ml PBS于小培養(yǎng)皿(? 35 mm)中，水平放置在正負極中間。調(diào)整正極高度，距液面5 mm。開啟DBD裝置電源，調(diào)整輸入電壓電流參數(shù)(45.0 V，2.0 A)，進行輻照處理，同時使用計時器記錄暴露時間。使用CAP設(shè)備對PBS分別進行 10、20、30、40、50 s的處理。等離子體活化液的劑量定義為在相同的放電參數(shù)下不同的處理時間。將制備好的活化溶液放入冰水浴或在4 ℃存放。

1.4 PAS中pH值及ROS和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)物質(zhì)濃度的測定

1

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4

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1

pH值 取制備好的PAS溶液2 ml置于試管中，將校準好的電子pH計探針完全浸入液面以下，靜置10 min后，待屏幕讀數(shù)穩(wěn)定后讀取并記錄。重復(fù)3次取均值。

1

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4

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2

NO濃度 按照說明書，從NO檢測試劑盒中，取4.0 ml的1號液放入試管中。然后吸取0.50 ml制備好的PAS加入試管中，不混勻。再吸取試劑盒中的2號液0.50 ml加入試管中，混勻?；靹蚝箪o置10 min，取混合液于檢測管中，于分光光度計中檢測，讀取結(jié)果并記錄。重復(fù)3次取均值。

1

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4

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3

HO濃度 按照說明書，從HO檢測試劑盒中取0.50 ml的1號液加入試管中，然后吸取8.0 ml制備好的PAS加入試管中，混勻。再加入2號液0.50 ml，混勻后靜置10 min。取混合液于檢測管中，于分光光度計中檢測，讀取結(jié)果并記錄。重復(fù)3次取均值。

1

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4

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4

O濃度 按照說明書，取10 ml制備好的PAS加入試管中，向試管中加入2滴O檢測試劑盒的1號液，混勻。加入2號粉末試劑1勺(試劑盒自帶小勺)。搖勻后靜置3 min。取混合液于檢測管中，于分光光度計中檢測，讀取結(jié)果并記錄。重復(fù)3次取均值。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力

將HemECs細胞以每孔8 000個細胞的密度接種于96孔微量培養(yǎng)板中，并在含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至貼壁，PAS處理HemECs細胞1 h后，棄去PAS。加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，1 h后分光光度計在450 nm處測定吸光度(optical density, OD)值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將HemECs細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至貼壁，PAS孵育1 h。棄去PAS，替換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞用于染色。將細胞懸浮在Annexin V結(jié)合液中。隨后，加入5 μl Annexin V-FITC染色液，混勻后避光孵育15 min，然后加入10 μl PI染色液,28 ℃避光孵育5 min。流式細胞儀上機檢測，使用FlowJo-V10軟件用于數(shù)據(jù)的分析及作圖。

1.7 DCFH-DA熒光標記細胞內(nèi)ROS水平

將處于對數(shù)生長期的HemECs細胞接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔10 000個細胞，培養(yǎng)至貼壁。將細胞裝載熒光探針DCFH-DA，PAS孵育1 h后，熒光酶標儀在激發(fā)波長為488 nm和發(fā)射波長為525 nm下檢測熒光，計算細胞內(nèi)ROS水平。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測凋亡蛋白

收集細胞，加入RIPA裂解液提取細胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測提取的蛋白濃度。選擇8%分離膠和5%濃縮膠進行電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5 h后，TBST溶液洗膜，與AKT(1 ∶1 000)、PI3K(1 ∶1 000)、p-Akt(1 ∶1 000)和p-PI3K(1 ∶1 000)單克隆抗體4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG溶液(1 ∶5 000)室溫孵育60 min，底物化學(xué)發(fā)光法顯影。

2 結(jié)果

2.1 PBS在DBD的作用下pH值以及主要活性物質(zhì)的變化

CAP分別處理PBS 10、20、30、40、50 s后，與對照組相比，PAS的pH值呈下降趨勢，具有劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=29.79，

P

<0.05)。在實驗選擇的處理時間內(nèi)，pH值均在6以上，見圖1。隨著DBD處理時間的增加，PBS中NO、HO和O這3種主要活性物質(zhì)濃度均呈劑量依賴性上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=130.7、153.4、26.77，

P

<0.05)，其中，當(dāng)DBD處理時間為50 s時，溶液中NO、HO和O的濃度最高，分別為(12.13±0.40)、(13.50±1.21)、(0.21±0.02)mg/L。見圖2～4。

圖1 PAS中pH值的變化

圖2 PAS中NO3-的濃度變化

圖3 PAS中H2O2的濃度變化

圖4 PAS中O3的濃度變化

2.2 PAS抑制HemECs細胞增殖

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，不同DBD處理時間的PAS溶液對HemECs細胞均具有一定細胞毒性作用。CAP處理10 s時HemECs細胞的抑制率僅為(92.08±0.15)%，CAP處理50 s時HemECs細胞的抑制率為(50.10±0.04)%。隨著CAP處理時間的增加，對HemECs細胞增殖的抑制作用逐漸增強，并且具有劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=25.41，

P

<0.05)。見圖5。

圖5 PAS對HemECs細胞增殖的影響

2.3 PAS促進HemECs細胞凋亡

流式細胞儀分析每組細胞凋亡率，結(jié)果顯示，DBD處理時間為10、20、30、40、50 s的PAS對HemECs細胞的凋亡率分別為(9.28±2.75)%、(28.79±6.88)%、(64.67±10.44)%、(72.53±4.69)%和(86.93±3.23)%，而對照組凋亡率為(4.56±2.52)%。與對照組相比，CAP處理時間為10 s時，對HemECs細胞有促進凋亡作用，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

=0.911 2)；其余實驗組對HemECs細胞均具有促進凋亡的作用，且具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見圖6。

圖6 PAS對HemECs細胞總凋亡率的影響

2.4 PAS以劑量依賴的方式升高細胞內(nèi)ROS水平

與對照組相比，不同DBD處理時間的PAS均能提升HemECs細胞中ROS水平，且具有劑量依賴性。CAP處理10 s時HemECs細胞的ROS相對表達水平變化不大，僅為(136.9±1.3)%(

P

=0.76)；CAP處理時間從20 s提升至50 s時，HemECs細胞中ROS相對表達水平提升明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見圖7。

圖7 PAS對HemECs細胞中相對ROS水平影響

2.5 PAS對HemECs細胞中PI3K/AKT通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，CAP處理10 s時,HemECs細胞中AKT的磷酸化水平變化不明顯，處理時間增加至20、30、40、50 s后，AKT的磷酸化水平迅速降低；另一方面，PI3K的磷酸化水平變化則不顯著。見圖8。

圖8 PAS處理后HemECs細胞中AKT、p-AKT、PI3K和p-PI3K的相對表達量

3 討論

近年來由于CAP強大的抑制惡性腫瘤細胞增殖能力而受到廣泛重視，已經(jīng)在體外對包括骨肉瘤、胰腺癌和惡性黑素瘤等多種腫瘤細胞進行了研究，均提示有良好的抑制效果。該團隊早期對皮膚基底細胞癌和鱗狀細胞癌進行了直接CAP和PAS的體外處理，也顯示出良好的抑制效應(yīng)。增殖期血管瘤內(nèi)皮細胞與腫瘤細胞有類似的生物學(xué)活性，因此，猜測PAS對增殖期血管瘤內(nèi)皮細胞具有同樣的抑制效果。

該研究選擇PBS作為底物，采用DBD裝置處理PBS獲得不同處理時間的PAS作為不同的劑量，在體外進行HemECs細胞作用研究。結(jié)果提示PBS中的pH值隨著CAP處理時間的增加不斷下降，50 s時，pH值下降至6左右，而此時的pH值仍然是可接受的變化。隨著CAP處理時間的增加，溶液中NO、HO和O活性介質(zhì)的濃度也在提高，對細胞的抑制作用也在增強，這可能與溶液中ROS和RNS的濃度有關(guān)。有研究表明，等離子體激活的長壽命活性物質(zhì)HO、NO和NO等是發(fā)揮抑制效應(yīng)的主要物質(zhì)，可以破壞細胞膜和線粒體等。ROS是正常生理條件下重要的細胞內(nèi)次級信使，但在病理條件下，當(dāng)細胞內(nèi)ROS積累過多或細胞內(nèi)ROS清除系統(tǒng)受損，可能導(dǎo)致氧化或硝化應(yīng)激以及細胞成分的損傷，包括核酸、膜脂和蛋白質(zhì)，繼而可影響各種生理和病理過程，包括代謝、炎癥、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和凋亡。

磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路在細胞生長、發(fā)育、凋亡等生理過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。該信號通路中，P13K激活的結(jié)果是在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，當(dāng)PI3K被磷酸化激活后，其合成的PIP3與細胞中AKT和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1 (PDK1) 結(jié)合，促使 PDK1磷酸化 AKT蛋白的Ser308導(dǎo)致AKT活化。研究顯示激活的PI3K磷酸化AKT，p-AKT移動到胞質(zhì)及胞核，結(jié)合其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、Bcl-2和mTOR等，調(diào)控炎癥細胞活化和炎癥介質(zhì)釋放，故p-AKT可作為PI3K/AKT信號通路活化的標志物。

該研究在體外采用PAS處理HemECs細胞，以觀察PAS對HemECs細胞增殖及凋亡水平的作用。結(jié)果顯示，CAP輻照時間10、20、30、40、50 s的PBS處理HemECs細胞，與對照組相比，PAS可顯著抑制HemECs細胞的增殖，也能顯著促進其凋亡，且具有劑量依賴性。并且，這種作用效果與細胞內(nèi)ROS水平的上升具有相關(guān)性。初步對PI3K/AKT信號通路在CAP影響HemECs細胞增殖和凋亡中的作用研究表明，CAP處理10 s以上的激活液可以顯著抑制HemECs細胞的磷酸化AKT水平，但對PI3K的磷酸化水平?jīng)]有明顯抑制作用。因此，CAP來源的活性氧類物質(zhì)通過直接影響細胞內(nèi)ROS水平，下調(diào)AKT磷酸化的表達，進一步表現(xiàn)出對HemECs細胞的增殖抑制及促進凋亡的效果。

綜上所述，該研究從細胞和蛋白水平上表明了CAP激活液對HemECs細胞的增殖具有抑制作用，并通過細胞內(nèi)ROS下調(diào)p-AKT表達促進凋亡，為今后嬰兒血管瘤的靶向治療研究提供了方向。