ATF4通過調(diào)控HKDC1對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響

張 黎，崔 杰，王安琪，孫國平

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率分別位居世界第6和第3，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌中最常見的類型，占所有肝癌病例的75%～85%。目前，系統(tǒng)性化療是肝癌患者的重要治療手段，但由于治療耐藥性，晚期HCC患者在很大程度上仍無法緩解。因此，探索肝癌發(fā)生分子機(jī)制，尋找肝癌治療新靶點(diǎn)，對肝癌患者的治療有著極其重要的臨床意義。

細(xì)胞內(nèi)外各種因素如低氧、營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、Ca濃度改變等刺激，可使未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和隨后的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的激活，研究表明ERS能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來影響腫瘤進(jìn)展和治療。轉(zhuǎn)錄活化因子4 (activating transcription factor 4, ATF4)是參與UPR的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(proteinkinase R-like ERkinase, PERK)途徑的重要組成部分，ATF4及其靶基因與腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移有關(guān)，ATF4是治療癌癥的潛在靶點(diǎn)。相關(guān)研究表明己糖激酶結(jié)構(gòu)域成分1(hexokinase domain component 1，HKDC1)可能是ATF4轉(zhuǎn)錄識別的靶點(diǎn)之一，HKDC1是近年發(fā)現(xiàn)的第五種己糖激酶，現(xiàn)已有研究表明HKDC1可能在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌及淋巴瘤中發(fā)揮致癌作用，但目前HKDC1在肝癌中的研究機(jī)制甚少。該研究通過觀察敲低ATF4及HKDC1對HCC增殖、遷移及凋亡的影響，探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

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1

細(xì)胞株及培養(yǎng) 人HCC細(xì)胞株HepG2、Huh7(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；在含1%鏈霉素、1%青霉素和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞置于含5% CO的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)及時(shí)換液和傳代。

1

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1

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2

主要試劑 胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(以色列BI公司)；青-鏈霉素(美國Gibco公司)；胰蛋白酶、RIPA細(xì)胞裂解緩沖液、PMSF蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)公司)；通用型ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒(美國 ThermoFisher公司)；抗Bcl-2(BS1511)、Bax抗體(BS2538)(美國Bioword公司)；抗GAPDH抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(美國Biolegeng公司)；抗ATF4抗體(美國Proteintech公司)；抗HKDC1抗體(北京Bioss公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、CCK-8試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine2000(美國Millipore公司)；ATF4小干擾RNA及其對照siRNA(上海吉瑪公司)；結(jié)晶紫染色液(杭州吳鑫公司)；高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(北京Biomed公司)。

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1

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3

主要儀器 酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)、流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)、化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國GE公司)。

1.2 方法

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1

質(zhì)粒提取 取200 μl菌液(shNC、shHKDC1)于10 ml含有氨芐抗生素的液體LB培養(yǎng)基中,200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒按步驟提取質(zhì)粒后上機(jī)檢測濃度。

1

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2

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2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 預(yù)先將HepG2和Huh7接種于6孔板中，待細(xì)胞生長融合率達(dá)50%～60%開始轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分組設(shè)置為陰性組(si-NC、shNC)、轉(zhuǎn)染組(si-ATF4、shHKDC1)，按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后將無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基更換為含10%血清的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。序列信息如下：si-NC:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(F)，5′-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3′(R);siATF4:5′-CCUGAA AGAUUUGAUAGAATT-3′(F),5′-UUCUAUCAAAUC UUUCAGGTT-3′(R);shNC:5′-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3′;shHKDC1:gcCTTGCTAATACAAGAGA GA。

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2

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3

CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將HepG2和Huh7以每孔100 μl的接種量(細(xì)胞密度為3×10個(gè)/ml)接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h加入CCK-8檢測試劑(10 μl/孔)，繼續(xù)孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光度(optical density,OD)。

1

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2

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4

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按500個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)1～2 周，直至肉眼可見克隆形成結(jié)束培養(yǎng)，用PBS輕輕清洗3次后，用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.5%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下觀察對照組和轉(zhuǎn)染組克隆數(shù)目(細(xì)胞數(shù)>50個(gè)計(jì)為一個(gè)克隆)。

1

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2

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5

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)消化，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，離心收集細(xì)胞后用400 μl膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)結(jié)合緩沖液重懸，加入5 μl異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)室溫下避光孵育15 min，再加入5 μl碘化丙啶(propidium,PI)室溫下避光孵育5 min后上機(jī)檢測，獲取數(shù)據(jù)后使用CytExpert軟件進(jìn)行分析。

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2

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6

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按5×10個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞生長融合率達(dá)90%，用Marker筆在6孔板背面劃3條直線，用200 μl槍頭垂直板面勻速劃痕，使劃痕線垂直于3條標(biāo)記線，用PBS洗去脫落細(xì)胞后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、24 h后在4倍光學(xué)顯微鏡下拍照(選取標(biāo)記線與劃痕相交處拍照，保證2個(gè)時(shí)間點(diǎn)拍照視野一致)用Image J軟件分析并計(jì)算劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1

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2

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7

Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后加入含PMSF的RIPA裂解液置于冰上裂解30 min后刮取細(xì)胞裂解物，4 ℃，14 000 r/min離心15 min后收集上清液；使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量；在蛋白上清液中加入4×Loading buffer后在100 ℃條件下加熱10 min制備蛋白樣品；用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，用特異性一抗在4 ℃下孵育過夜，包括ATF4(1 ∶1 000)、HKDC1(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶2 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000),再用相應(yīng)的二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育2 h，最后用ECL發(fā)光顯影檢測蛋白；用Image J軟件進(jìn)行條帶分析并計(jì)算其灰度值。

2 結(jié)果

2.1 敲低ATF4對肝癌細(xì)胞增殖的影響

用CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測si-NC組和si-ATF4組肝癌細(xì)胞的增殖情況。CCK-8結(jié)果顯示,與si-NC組相比，敲低ATF4抑制肝癌細(xì)胞增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=3.408,

t

=6.261,

t

=7.393;

t

=5.271,

t

=9.135,

t

=9.853;均

P

<0.01)(圖1A)；克隆形成結(jié)果顯示，與si-NC組相比，敲低ATF4抑制肝癌細(xì)胞克隆形成能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=17.270,

t

=16.280;均

P

<0.01)(圖1B)。

圖1 敲低ATF4對HepG、Huh7細(xì)胞增殖和克隆形成的影響

2.2 敲低ATF4對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h后si-ATF4劃痕組愈合率較si-NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=17.420,

t

=19.310;均

P

<0.01)(圖2)。結(jié)果表明抑制ATF4基因的表達(dá)可能抑制肝癌細(xì)胞的遷移潛能。

圖2 敲低ATF4對HepG2、Huh7細(xì)胞遷移的影響 ×4與si-NC組比較：**P<0.01

2.3 敲低ATF4對肝癌細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與si-NC組比較，抑制ATF4基因的表達(dá)后，HepG2和Huh7細(xì)胞凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=8.786,

t

=6.872;均

P

<0.01)(圖3A)；為了進(jìn)一步探究敲低ATF4誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，用Western blot檢測肝癌細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示,敲除ATF4可上調(diào)肝癌細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)而下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，相較于si-NC組，si-ATF4組Bcl-2/Bax的比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=22.710,

t

=37.950;均

P

<0.01)(圖3B)。

圖3 敲低ATF4誘導(dǎo)HepG2、Huh7細(xì)胞凋亡

2.4 ATF4通過調(diào)控HKDC1對肝癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響

為了探究ATF4在肝癌細(xì)胞中對HKDC1的調(diào)控作用，該研究在HepG2和Huh7細(xì)胞系中敲除ATF4后，用Western blot檢測HKDC1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示沉默ATF4可以下調(diào)肝癌細(xì)胞中HKDC1蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=12.340,

t

=5.586;

t

=13.850,

t

=14.850;均

P

<0.01)(圖4A)；為了進(jìn)一步探究HKDC1在肝癌細(xì)胞中的作用，在HepG2和Huh7細(xì)胞系中敲除HKDC1后，進(jìn)行細(xì)胞增殖和凋亡檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除HKDC1后，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞系的增殖均受到抑制(

t

=4.393,

t

=9.673,

t

=6.747;

t

=5.677,

t

=9.960,

t

=10.750;均

P

<0.01)；另外，流式細(xì)胞凋亡術(shù)結(jié)果顯示，與shNC組對比，抑制HKDC1的表達(dá)后，HepG2和Huh7細(xì)胞凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=7.836,

t

=9.016;均

P

<0.01)(圖4B、C);劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與shNC組相比，shHKDC1組肝癌細(xì)胞遷移能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

t

=14.830,

t

=20.420;均

P

<0.01)(圖4D)。

圖4 ATF4可能通過靶向HKDC1促進(jìn)HepG2、Huh7細(xì)胞增殖遷移 ×4

3 討論

在低氧、營養(yǎng)缺乏的腫瘤微環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞仍可生存下來，這可能與導(dǎo)致細(xì)胞存活的壓力相關(guān)信號通路的激活有關(guān)，ATF4是其中的關(guān)鍵介質(zhì)，其通過參與氧化還原穩(wěn)態(tài)、自噬和血管生成的基因轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，維持腫瘤代謝的平衡，目前已有關(guān)于在肝癌治療中靶向ATF4途徑增強(qiáng)細(xì)胞藥物敏感性的相關(guān)研究的報(bào)道。與正常組織相比，ATF4在腫瘤組織中表達(dá)增高，其在腫瘤進(jìn)展中的作用已被證實(shí)。為了研究ATF4在肝癌細(xì)胞生長中的作用，該研究使用ATF4特異性的siRNA有效抑制ATF4在肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7中的表達(dá)后，觀察肝癌細(xì)胞體外增殖遷移能力和凋亡的變化，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，肝癌細(xì)胞凋亡增加且增殖遷移受到抑制。為進(jìn)一步觀測其長期效應(yīng)，采用相同的方法研究其對肝癌細(xì)胞克隆形成的影響，發(fā)現(xiàn)沉默ATF4的表達(dá)后成功抑制了肝癌細(xì)胞的克隆形成。

ATF4是由各種應(yīng)激和病理誘導(dǎo)的適應(yīng)性綜合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，相關(guān)研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)ATF4介導(dǎo)的HKDC1基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，HKDC1基因是ISR的一個(gè)新的候選成分，ISR期間HKDC1的上調(diào)通過刺激葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)聚集，并將其驅(qū)動(dòng)至糖酵解過程中，有助于克服應(yīng)激期間能量的缺乏。該研究假設(shè)ATF4通過上調(diào)HKDC1的表達(dá)來增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖及遷移能力，研究顯示抑制ATF4在肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7中的表達(dá)后，蛋白表達(dá)下調(diào)，證實(shí)了在HCC中ATF4對HKDC1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，腫瘤細(xì)胞能量代謝方式發(fā)生改變，即使在氧氣充足的情況下，腫瘤細(xì)胞仍主要利用糖酵解而不是氧化磷酸化來產(chǎn)生能量，這種現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”，這種腫瘤細(xì)胞中的有氧糖酵解反應(yīng)能產(chǎn)生大量三磷酸腺苷(ATP)和生物合成所需的代謝中間體，以滿足腫瘤生長和惡性進(jìn)展中大量的生物合成和能量需求，是腫瘤細(xì)胞生長、增殖及轉(zhuǎn)移的重要因素之一。己糖激酶(HKs)是糖酵解第一步的關(guān)鍵代謝酶，其中，HKDC1是一種新的HK亞型，據(jù)相關(guān)研究表明，HKDC1在腫瘤組織中表達(dá)增多，是一種新的潛在的肺癌治療靶點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)通過抑制HKDC1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)來觀察其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示敲低HKDC1的表達(dá)對HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞株有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。該研究進(jìn)一步證實(shí)ATF4可能作用于HKDC1并增強(qiáng)其表達(dá)，從而在肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。綜上所述，該研究證實(shí)了ATF4和HKDC1在HCC進(jìn)展中的作用，是肝癌治療的候選靶點(diǎn)。