去乙酰化酶SIRT6通過激活PI3K-AKT通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖、遷移

李天宇，汪 鑫，張 森，畢良寬，王德光

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是腎臟中最常見的惡性腫瘤。在過去的10年中，RCC的發(fā)生率以每年2%的速度增長(zhǎng)。轉(zhuǎn)移和化療耐藥性是RCC的特征。由于缺乏有效的治療方法，RCC患者的中位生存時(shí)間僅為6～12個(gè)月，而5年生存率不到20%。最近的研究表明，超過90%的腎癌相關(guān)死亡與RCC的轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，迫切需要確定新的治療靶點(diǎn)。

SIRT6是NAD依賴的去乙酰化酶Sirtuins家族成員之一，在染色質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)和基因組維持中已確定作用。通過這些功能，SIRT6可以預(yù)防與衰老相關(guān)的疾病，包括代謝性疾病和癌癥，并可以延長(zhǎng)小鼠的壽命。在RCC發(fā)展過程中，SIRT6的表達(dá)是否發(fā)生變化及其對(duì)RCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控尚不清楚。該研究通過RCC患者組織及細(xì)胞系，觀察SIRT6在RCC發(fā)展中的表達(dá)及其對(duì)RCC細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hycolne公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME transfection reagent(法國(guó)Polyplus-transfection公司)，RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，小干擾RNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，Western blot SIRT6抗體(英國(guó)Abcam公司)，免疫組化SIRT6抗體(美國(guó)Proteintech公司)，兔二步法試劑盒(北京中杉金橋公司)，兔源H3、H3K9ac、GAPDH、Akt、p-Akt抗體和山羊抗兔二抗(美國(guó)Affinity公司)，兔源β-Tubulin(美國(guó)Cell signaling technology公司)，二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)，OSS_128167粉末(美國(guó)MCE公司)。

1.2 病例資料

從安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科調(diào)取術(shù)后17例患者的腎癌組織和癌旁組織切片，腎癌組織類型皆為透明細(xì)胞癌，同時(shí)患者已簽署知情同意書。人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、786-O細(xì)胞購(gòu)自ATCC，使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染選擇在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照說明書將SIRT6-siRNA轉(zhuǎn)染到ACHN、786-O細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染48 h后用于劃痕實(shí)驗(yàn)或收集細(xì)胞蛋白等。

1.4 細(xì)胞加藥處理

將OSS_128167粉末離心后溶于DMSO中，并配制成用藥濃度為50、100、200 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h后進(jìn)行MTT及劃痕實(shí)驗(yàn)，并收集細(xì)胞蛋白。

1.5 Western blot免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)

RIPA法提取處理后的細(xì)胞總蛋白，通過SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，隨之ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光圖像系統(tǒng)分析系統(tǒng)進(jìn)行圖片拍照，Image J對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，待貼壁后用1 ml槍頭從上到下用力劃出一條痕跡，拍照記錄，后續(xù)每隔6 h進(jìn)行1次拍照，直至24 h最后1次拍照，測(cè)量劃痕兩側(cè)細(xì)胞之間的面積用來計(jì)算24 h細(xì)胞愈合率。

1.7 四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

將細(xì)胞種于96孔板中，每孔含有細(xì)胞2 000個(gè)，并加入藥物OSS_128167進(jìn)行24 h刺激，濃度分別為50、100、200 μmol/L，每組做10個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔再加入10 μl Formazan溶解液并適當(dāng)混勻放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，3～4 h后顯微鏡下觀察到紫色Formazan結(jié)晶全部溶解則移至酶標(biāo)儀處測(cè)570 nm處吸光度。

1.8 免疫組織化學(xué)染色

將切片放置在枸櫞酸鹽緩沖液中，加熱至沸騰使溫度維持在90～100 ℃、7 min，再沸騰1次，PBS緩沖液沖洗3次(每次5 min)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑封閉10 min，PBS沖洗3次(每次5 min)，4 ℃一抗孵育過夜，PBS沖洗3次(每次5 min)，顯色增強(qiáng)劑孵育30 min，PBS沖洗3次(每次5 min)，酶標(biāo)山羊抗兔IgG二抗孵育30 min，PBS沖洗3次(每次5 min)，DAB顯色。

1.9 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞消化后接種在含200 μl無血清培養(yǎng)基的小室中，24孔板里放入800 μl含30%小牛血清的培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱24 h，取出并加入4%多聚甲醛固定30 min，再加入0.1%結(jié)晶紫染色8 min，PBS清洗3次后用棉簽輕擦小室上部，放于顯微鏡下拍照。用Image J計(jì)算穿過小室的細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)采用Brown-Forsythe校正，兩獨(dú)立樣本之間采用

t

檢驗(yàn)。以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Transwell的細(xì)胞數(shù)計(jì)算和劃痕實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞愈合率采用Image J進(jìn)行定量或半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 SIRT6在人腎癌組織和腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)

從17例病人中隨機(jī)選取了3例腎透明細(xì)胞癌患者癌組織和癌旁組織，免疫組化結(jié)果顯示：腎癌組織中SIRT6的表達(dá)明顯升高，而癌旁組織中SIRT6幾乎不表達(dá)，見圖1A。同時(shí)選取人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、786-O和正常人腎小管上皮細(xì)胞HK-2檢測(cè)SIRT6的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，與HK-2細(xì)胞比較，SIRT6在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、786-O中表達(dá)分別升高1.43倍(

t

=8.409，

P

<0.01)和1.22倍(

t

=4.122，

P

<0.05)，見圖1B。

圖1 SIRT6在腎癌中的表達(dá)變化

2.2 干擾SIRT6對(duì)ACHN細(xì)胞遷移能力的影響

使用SIRT6-RNAi干擾ACHN細(xì)胞。合成的3條siRNA片段用于進(jìn)行SIRT6的干擾，Western blot結(jié)果顯示，與Vector組比較，SIRT6-siRNA1能夠顯著降低ACHN細(xì)胞中SIRT6的表達(dá)(

F

=72.01，

P

<0.01)，故選用siRNA1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2A。ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT6-siRNA后，與Vector組比較，SIRT6下游蛋白H3K9乙酰化水平顯著升高(

F

=10.89，

P

<0.001)，而H3總蛋白表達(dá)沒有明顯變化，見圖2B。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Vector組比較，SIRT6-siRNA轉(zhuǎn)染后ACHN細(xì)胞劃痕愈合面積較小，提示其遷移能力明顯減弱(

F

=149.4，

P

<0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Vector組比較，轉(zhuǎn)染SIRT6-siRNA轉(zhuǎn)染后ACHN穿過小室的細(xì)胞數(shù)較少(

F

=59.27，

P

<0.01)，遷移能力明顯降低，見圖2C、D。

圖2 SIRT6-siRNA對(duì)ACHN的影響

2.3 SIRT6特異性抑制劑OSS_128167對(duì)腎癌細(xì)胞增殖能力的影響

Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，隨著OSS_128167(50、100、200 μmol/L)濃度的增加(

F

=96.27，

P

<0.001)，在ACHN細(xì)胞中乙?；疕3K9蛋白表達(dá)逐漸升高，而對(duì)SIRT6蛋白和H3總蛋白表達(dá)無影響(圖3A)。MTT結(jié)果顯示，不同濃度的OSS_128167(50、100、200 μmol/L)處理24 h后，與DMSO組比較，ACHN的增殖活力隨著用藥濃度提高而顯著降低(

F

=43.39，

P

<0.001)(圖3B)。

圖3 OSS_128167對(duì)ACHN細(xì)胞SIRT6、H3K9ac表達(dá)和增殖活力的影響

2.4 SIRT6特異性抑制劑OSS_128167對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN中PI3K、AKT表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，不同濃度OSS_128167(50、100、200 μmol/L)處理ACHN細(xì)胞后，隨著濃度的升高，p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)逐漸降低(

F

=84.66，

P

<0.001；

F

=23.39，

P

<0.001)，而PI3K、Akt蛋白的表達(dá)沒有明顯變化，見圖4。

圖4 OSS_128167對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

3 討論

腎癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，尚未能完全明確，且面臨治療方法敏感性較差，腫瘤耐藥等問題，因此，確定新的腎癌治療靶點(diǎn)和藥物是當(dāng)前腎癌研究的關(guān)鍵。

Sirtuins家族包含7個(gè)NAD依賴性酶(SIRTs1-7)，它們涉及衰老、代謝和癌癥等多種途徑，因此，其被認(rèn)為是細(xì)胞活動(dòng)的主要調(diào)節(jié)劑。SIRT6作為家族成員之一，對(duì)SIRT6的研究從最初的衰老和長(zhǎng)壽的調(diào)控到近幾年在腫瘤，多樣化的功能使其能夠參與基因組的穩(wěn)定性、DNA修復(fù)、癌癥及代謝的調(diào)節(jié)，由于這些過程與癌癥的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系，因此，SIRT6也被認(rèn)為是癌癥研究中較有吸引力的靶標(biāo)。

SIRT6在各種癌癥中失調(diào)，SIRT6在腫瘤發(fā)生中的作用取決于腫瘤的類型和背景。在胰腺癌、乳腺癌、原發(fā)性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌中，SIRT6在這些表達(dá)升高的癌癥中可能代表了一種對(duì)抗腫瘤進(jìn)展的補(bǔ)償機(jī)制，在多發(fā)性骨髓瘤中SIRT6表達(dá)的增加，可以增強(qiáng)H3K9的脫乙酰基作用并抑制MAPK/ERK的轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這些研究表明，細(xì)胞中SIRT6活性的調(diào)節(jié)隨腫瘤類型和癌癥分期而變化，反映SIRT6在癌細(xì)胞生物學(xué)中的復(fù)雜機(jī)制和多效作用。

在以往的研究中，腎癌中SIRT6表達(dá)水平尚有爭(zhēng)議：腎癌的免疫組化顯示SIRT6表達(dá)升高，且SIRT6抑制通過阻滯腎癌細(xì)胞786-O的G/S期來抑制腫瘤生長(zhǎng)，而在另外的研究中，腎癌組織的免疫組化提示SIRT6的表達(dá)顯著低于正常組織。在該研究中，結(jié)果顯示SIRT6在腎癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，提示SIRT6的異常表達(dá)可能在腎癌進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)控作用。SIRT6-siRNA干擾ACHN細(xì)胞后，隨后通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明了SIRT6蛋白的下降能抑制腎癌細(xì)胞遷移。由于藥物的毒性和耐藥性，治療腎癌的手段選擇有限。

OSS_128167作為SIRT6的特異性抑制劑已經(jīng)被以往的研究證明，SIRT6作為NAD依賴性去乙酰化酶，OSS_128167與NAD的煙酰胺(NAM)部分的結(jié)合位點(diǎn)非常接近。抑制劑部分占據(jù)了肽底物結(jié)合位點(diǎn)，隨后阻止了活性組氨酸朝向NAD定向以進(jìn)行反應(yīng)。OSS_128167可以通過抑制SIRT6的活性而不影響SIRT6蛋白表達(dá)而提高SIRT6的特異性下游靶標(biāo)H3K9的乙?；?。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)所示，SIRT6的活性可被OSS_128167所抑制并且降低腎癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究仍有必要，以確定OSS_12816單獨(dú)使用或與其他藥物聯(lián)合使用的劑量和不良反應(yīng)。

PI3K/AKT是一種眾所周知的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著不可或缺的作用。PI3K/AKT作為經(jīng)常被激活的癌癥驅(qū)動(dòng)因子在遺傳上比其他生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑靶向更多的途徑組成成分和更多的腫瘤類型。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中報(bào)道SIRT6在PI3K/AKT信號(hào)通路中富集，shSIRT6可抑制PI3K/AKT通路的磷酸化激活，該研究中SIRT6活性被OSS_128167抑制后出現(xiàn)PI3K/AKT磷酸化的抑制，說明SIRT6誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可能是腎癌發(fā)展的重要分子機(jī)制，但需要進(jìn)一步研究來證明SIRT6調(diào)控該通路的生物學(xué)機(jī)制和信號(hào)串?dāng)_。