綠茶提取物EGCG預(yù)防齲病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

李 芳，劉亞軍，劉澤婷，陳永翔，王烈成，王一君，王元銀

齲病是一種細(xì)菌感染性疾病，由含有變形鏈球菌(

streptococcus

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，

S.

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)的口腔生物膜誘導(dǎo)下牙體硬組織發(fā)生的病變?，F(xiàn)有研究表明大量的致齲細(xì)菌是齲病的致病因素，而

S.

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是齲病的主要病原微生物。

S.

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黏附于牙面獲得性膜上，迅速繁殖、代謝碳水化合物產(chǎn)酸，溶解牙體硬組織進(jìn)而形成齲洞，這是其致齲特性。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯( epigallocatechin gallate，EGCG)在兒茶素中含量最多，具有廣泛的生物學(xué)和藥理活性。它還具有較高的抗齲功效，這一特性主要來(lái)源于它的抗菌活性，其作用機(jī)制與它的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。有研究表明，EGCG對(duì)口腔主要致齲細(xì)菌的產(chǎn)酸、耐酸以及黏附等致齲毒力因子有較好的抑制作用。且有學(xué)者證實(shí)EGCG在抑菌、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及抗氧化等方面起重要作用。該課題前期研究表明EGCG對(duì)

S.

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的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為 6.25 mg/L。該研究利用大鼠齲病模型對(duì)綠茶提取物EGCG在 MIC時(shí)的防齲效能進(jìn)行綜合評(píng)估，為綠茶提取物EGCG進(jìn)入臨床試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

EGCG、氨芐西林鈉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；氟化鈉、醋酸氯己定(洗必泰)、紫脲酸銨指示劑均購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；頭孢拉定膠囊購(gòu)自石家莊石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；蔗糖購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司； SYTO 9染料購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；NEST 801001 35 mm 玻底培養(yǎng)皿(玻底直徑20 mm)購(gòu)自無(wú)錫耐思生物科技有限公司；SYJ-160型低速金剛石切割機(jī)購(gòu)自沈陽(yáng)科晶自動(dòng)化設(shè)備有限公司；激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)卡爾·蔡司公司；熒光正置顯微鏡DMI6000B購(gòu)自德國(guó)徠卡儀器有限公司。

1.2 細(xì)菌與培養(yǎng)基

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)變異鏈球菌株 ATCC 25175 (血清型C型 ) ；牛腦心浸出液培養(yǎng)基(brain heart infu- sion，BHI) 購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；輕唾瓊脂培養(yǎng)基(MS 瓊脂)、桿菌肽(bacitracin)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠24只購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；2000# 致齲飼料購(gòu)自常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

1.4 細(xì)菌復(fù)蘇及培養(yǎng)

按照說(shuō)明書配制BHI瓊脂培養(yǎng)基和MS瓊脂培養(yǎng)基。將于-80 ℃凍存的

S.

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株室溫復(fù)蘇24 h后接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基和MS瓊脂培養(yǎng)基，取0.5 ml菌液和4.5 ml BHI液體培養(yǎng)基放入15 ml離心管中混勻，37 ℃厭氧環(huán)境 (10% CO、90% N) 培養(yǎng)48 h。BHI瓊脂培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)觀察為無(wú)特征性乳白色菌落；在超凈工作臺(tái)中用移液槍移取適量菌液涂片革蘭染色后顯微鏡觀察為藍(lán)色鏈球狀。確認(rèn)是純培養(yǎng)后接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,使用 BHI液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度備用，使其達(dá)到吸光度值OD=0.6。

1.5 EGCG混懸液的配制

將EGCG粉用滅菌蒸餾水配制成100 mg /L的母液，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存待用。使用前用滅菌蒸餾水按設(shè)定濃度稀釋后使用。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1

.

6

.

1

實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)菌接種 選擇均于出生后第21天斷乳的SD雄性大鼠24只，隨機(jī)分成4組(

n

=6)：EGCG、氟化鈉(NaF)、氯己定(CHX)及蒸餾水(對(duì)照)組，給大鼠打耳標(biāo)、記錄體質(zhì)量。給予大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，之后給予致齲飼料 2000# 和 5%蔗糖水溶液，直至整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。鼠齡22 d，異氟烷吸入麻醉，用無(wú)菌棉簽蘸取大鼠唾液，PBS稀釋后涂BHI瓊脂平板和MS瓊脂平板，觀察大鼠口腔內(nèi)固有菌群情況。在實(shí)驗(yàn)第3～6天期間給予廣譜抗生素抑制口腔菌群，即1 000 g致齲飼料添加1 g氨芐西林、1 L 5%蔗糖水溶液添加頭孢拉定1 g促進(jìn)

S.

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感染大鼠口腔。在實(shí)驗(yàn)第8～12天期間，給每只大鼠口腔內(nèi)接種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)變異鏈球菌株，菌液濃度為OD=0.6，每次接種1 ml/只，連續(xù)處理5 d。在大鼠圍術(shù)期每組隨機(jī)抽取3只大鼠，用消毒棉簽收集大鼠唾液檢測(cè)菌株接種情況。

1

.

6

.

2

大鼠口腔藥物處理 自實(shí)驗(yàn)第14天起分別用濃度為 MIC的 EGCG、250 mg/L NaF溶液、0.12% CHX溶液及蒸餾水沖洗大鼠口腔。取1 ml各藥液分裝至1.5 ml EP管 ，1鼠1支。每只鼠在用藥前放入裝有3～4個(gè)浸滿異氟烷棉球的誘導(dǎo)盒內(nèi)，隨即關(guān)閉盒蓋，等待大鼠完全麻醉 (此過(guò)程約需 2～3 min)?？赏ㄟ^(guò)輕輕搖動(dòng)誘導(dǎo)盒以檢查大鼠是否完全麻醉，若大鼠身體翻倒為側(cè)姿且沒(méi)有試著恢復(fù)其臥姿狀態(tài)，則表明該大鼠已經(jīng)完全麻醉。將大鼠從誘導(dǎo)盒中迅速拿出，左手持大鼠并用拇指和食指固定住其頭部，右手拿無(wú)菌棉簽蘸取藥液至飽和，對(duì)大鼠磨牙(牙合)面、頰面、舌/腭面及口腔黏膜各處依次清理，剩余藥液用鈍頭的1 ml注射器沖洗大鼠口腔，以確保藥液作用到位。每只鼠的藥物處理過(guò)程為 1 min，處理后將大鼠以側(cè)臥位放回鼠籠，所有大鼠蘇醒后禁食2 h，如此連續(xù)處理6周，早晚各1次。整個(gè)藥物處理過(guò)程始終由同一實(shí)驗(yàn)員操作完成。同時(shí)每天觀察并記錄大鼠健康狀況飲食情況，每周記錄1次大鼠體質(zhì)量。

1

.

6

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3

大鼠磨牙標(biāo)本的制取 實(shí)驗(yàn)第56天異氟烷窒息處死大鼠，稱重后用剪刀斷顱，將上下頜骨分開(kāi)，用組織剪剔除附在骨面的皮膚肌肉筋膜等軟組織獲取頜骨標(biāo)本。清洗干燥置于含有1%～2%氫氧化銨溶液的燒杯中浸泡30 min,薄膜封口。取出清洗用濾紙干燥，置于0.4% 紫脲酸胺溶液中避光染色12 h，染色液中加入一定量的10%中性甲醛可以防止頜骨腐爛。取出沖洗室溫下避光干燥，將大鼠頜骨用蠟固定在切割機(jī)虎鉗上，用低速金剛石切割機(jī)沿頜骨磨牙牙合面近遠(yuǎn)中向矢狀半切，清洗干燥后放入裝有苯的玻璃皿中增加確認(rèn)率，立即清潔標(biāo)本，在體視顯微鏡下根據(jù)Keyes評(píng)分法評(píng)估大鼠磨牙的齲損情況。

1

.

6

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4

齲齒Keyes評(píng)分法分級(jí)計(jì)分 Keyes評(píng)分法是一種評(píng)估大鼠磨牙齲損程度的傳統(tǒng)的計(jì)分系統(tǒng)，在下頜第一、第二和第三磨牙中檢查的窩溝數(shù)目分別為3、2和1。在上頜第一、第二和第三磨牙中分別為2、1和1。分配給每個(gè)磨牙窩溝的線性單位分別是：上頜分別為7、5和2；下頜分別為5、3和2。其中下頜第一磨牙的前溝被指定2個(gè)單位的值，并用作其他溝測(cè)量的指導(dǎo)或標(biāo)準(zhǔn)。使用4 種探診深度記錄方式[齲損局限于釉質(zhì)(E 級(jí))；齲損累及釉質(zhì)及牙本質(zhì)外層 1/4 以內(nèi)(Ds級(jí))，會(huì)出現(xiàn)牙本質(zhì)與上層牙釉質(zhì)略微分離；齲損累及牙本質(zhì)厚度1/4 ～ 3/4(Dm級(jí))；齲損累及深度超過(guò)牙本質(zhì)厚度的3/4，甚至穿透牙本質(zhì)全層(Dx級(jí))]評(píng)估大鼠磨牙的窩溝齲損情況。對(duì)大鼠磨牙的窩溝齲損進(jìn)行計(jì)分，以此來(lái)評(píng)定藥物抑制齲齒情況。其中鏡下呈粉紅色處是齲損部位，不著色或著色很淺處是正常牙體組織。

2 結(jié)果

2.1

的培養(yǎng)與鑒定

實(shí)驗(yàn)中分別在細(xì)菌復(fù)蘇后，接種前及接種后都對(duì)細(xì)菌進(jìn)行菌落的形態(tài)和革蘭染色，形態(tài)學(xué)觀察為無(wú)特征性乳白色菌落；革蘭染色后顯微鏡觀察顯示細(xì)菌呈藍(lán)色鏈狀結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明接種細(xì)菌為

S.

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，并在大鼠口腔成功定植。

2.2 大鼠的飲食與健康狀況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠的水和食物消耗進(jìn)行記錄，各組間未見(jiàn)較大差異?？谇凰幬锾幚砥陂g，大鼠的健康活動(dòng)狀況良好，口腔黏膜未見(jiàn)異常表現(xiàn)，各組大鼠的體質(zhì)量相對(duì)均勻增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠體質(zhì)量增加差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=1.83，

P

>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中大鼠的體質(zhì)量變化

2.3 大鼠上頜磨牙窩溝齲損的Keyes記分

觀察大鼠上頜磨牙牙合面，各組大鼠磨牙窩溝均出現(xiàn)不同程度的齲損。在E級(jí)齲齒計(jì)分中，與對(duì)照組相比，EGCG組計(jì)分降低(

F

=22.09，

P

<0.001)；在Ds、Dm級(jí)齲齒計(jì)分中，3組用藥組上頜磨牙Keyes計(jì)分分值均降低，但CHX組抑齲效果更好(

P

=0.001 5；

P

=0.000 1)；在Dx級(jí)齲齒計(jì)分中，與對(duì)照組比較，其余各組的齲齒計(jì)分均降低很多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=31.66，

P

<0.001)，顯示各用藥組都有一定的預(yù)防窩溝齲齒的作用(表2)，各用藥組間齲齒計(jì)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大鼠磨牙各種窩溝齲損模型見(jiàn)圖2。

表2 各組大鼠上頜磨牙窩溝齲齒的Keyes計(jì)分

圖1 變形鏈球菌鑒定

圖2 各種齲齒模型 紫脲酸銨染色×10

3 討論

齲齒是世界上最常見(jiàn)的口腔疾病之一，是一種細(xì)菌感染性疾病。

S.

mutans

被認(rèn)為是齲齒發(fā)病的主要病因，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸、耐酸性和檢出率高等特性。齲齒的發(fā)生幾乎與細(xì)菌對(duì)碳水化合物的代謝有關(guān)，特別是

S.

mutans

代謝碳水化合物后產(chǎn)生的酸，將降低口腔中的pH，反過(guò)來(lái)對(duì)口腔微生物群施加生理壓力。由于其耐酸的特性，

S.

mutans

比不耐酸的物種有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，當(dāng)環(huán)境條件不太有利時(shí)，

S.

mutans

在致齲菌斑數(shù)量上占主導(dǎo)地位。它能代謝多種碳水化合物，黏附在牙齒表面，形成生物膜。據(jù)報(bào)道，

S.

mutans

的高數(shù)量與齲齒率的增加有直接關(guān)系。EGCG是兒茶素的一種，具有廣泛的生物學(xué)和藥理活性。此外，它還具有較高的抗菌功效，其作用機(jī)制與它的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。此外它還具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可以減少酸性化合物的產(chǎn)生，并通過(guò)對(duì)細(xì)菌胞質(zhì)膜的不可逆性損傷，發(fā)揮對(duì)口腔鏈球菌的抗菌作用。有研究表明，EGCG對(duì)口腔主要致齲細(xì)菌的產(chǎn)酸、耐酸以及黏附等致齲毒力因子有明顯的抑制作用。除了已知的抑菌作用外，EGCG可能還抑制

S.mutans

對(duì)牙齒表面的黏附，從而破壞成熟生物膜形成的最初步驟，減少齲齒的發(fā)生。該課題組的前期體外研究表明:EGCG 對(duì)

S.mutans

的MIC為 6.25 mg/L，說(shuō)明當(dāng)藥物濃度≥6.25 mg/L就可以抑制

S.

mutans

的增殖。MIC的EGCG對(duì)

S.

mutans

的產(chǎn)酸、增殖及黏附有較好的抑制作用。由于細(xì)菌-食物-宿主間相互作用的復(fù)雜性，研究人員不得不使用動(dòng)物模型，在控制條件下研究齲齒病變。當(dāng)喂食致齲食物時(shí)，嚙齒動(dòng)物的牙齒可發(fā)展齲齒，盡管人類和嚙齒動(dòng)物的牙齒解剖結(jié)構(gòu)不同，但由于它們較易獲得且成本較低，開(kāi)始被應(yīng)用于齲病的研究。目前關(guān)于EGCG對(duì)

S.

mutans

作用的研究多集中于體外，尚缺乏EGCG對(duì)

S.

mutans

致齲能力影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。該研究的目的是利用大鼠齲病動(dòng)物模型研究最低抑菌濃度的EGCG在大鼠口腔內(nèi)對(duì)

S.

mutans

致齲能力的抑制作用。調(diào)查EGCG對(duì)

S.

mutans

的生長(zhǎng)及其體內(nèi)致齲潛力的影響。Keyes 齲齒計(jì)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，EGCG組窩溝面齲損程度少于對(duì)照組，且對(duì)牙本質(zhì)深齲有較好的防治作用。表明EGCG具有抑制齲病發(fā)生發(fā)展的作用。該研究結(jié)果發(fā)生的機(jī)制可能與前期體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致：EGCG可以抑制變鏈菌的生長(zhǎng)黏附、降低牙菌斑的聚集及抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)的活性。最后，對(duì)EGCG的防齲效能進(jìn)行了綜合評(píng)估：Keyes 計(jì)分表明MIC的EGCG能夠抑制大鼠窩溝齲損形成和嚴(yán)重程度。此外，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠一般健康狀況良好，體質(zhì)量均勻增長(zhǎng)，口腔黏膜未見(jiàn)異常表現(xiàn)，與對(duì)照組相比飲食的消耗差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)藥物經(jīng)口腔局部應(yīng)用具有良好的安全性。

該研究表明，MIC的EGCG可減少大鼠磨牙窩溝齲的發(fā)生并降低齲損嚴(yán)重程度，且對(duì)大鼠飲食和體質(zhì)量的變化無(wú)影響。同課題組前期體外研究結(jié)果，從多方面驗(yàn)證了EGCG對(duì)口腔致齲菌的抑制作用，表明天然藥物EGCG能抑制大鼠口腔變形鏈菌的生長(zhǎng)代謝，可有效預(yù)防齲齒的發(fā)生，為齲病的防治提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。推測(cè)EGCG可能作為一種天然、安全的防齲藥物，在防治齲病方面發(fā)揮重要作用。