糖尿病腎病患者腎臟巨噬細(xì)胞Bruton酪氨酸激酶激活與腎功能的相關(guān)性研究

聶振勇，趙 晶，孫璇君，吳永貴

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，并已成為全世界終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因，目前缺乏有效的治療手段。DN的病理學(xué)改變主要包括系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的累積，基底膜的增厚，腎小管及間質(zhì)的損傷和纖維化。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥在DN中起著至關(guān)重要的作用。在DN的高血糖微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞可以分泌多種促炎介質(zhì)，其中包括白介素(interleukin, IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemotactic protein, MCP)-1，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟內(nèi)的炎癥和纖維化，加速疾病的進(jìn)展。Bruton酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosine kinase,BTK)是一種非受體酪氨酸激酶，是多種免疫受體下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的關(guān)鍵蛋白。已有大量研究表明BTK可以參與體內(nèi)的多種炎癥免疫反應(yīng)，并參與了多種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。課題組前期研究表明，高糖可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)BTK激活，引起巨噬細(xì)胞促炎介質(zhì)的釋放，并且BTK敲除可以減輕炎癥，緩解糖尿病小鼠的腎臟損害。在此基礎(chǔ)上，該實(shí)驗(yàn)旨在研究BTK激活在DN腎臟中的重要作用，為臨床的干預(yù)治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 病例資料

對(duì)照組：收集體檢正常志愿者血清18例及癌旁正常腎組織18例作為對(duì)照組。DN組：收集2016年1月—2020年1月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院治療的DN患者腎組織為DN組，共49例。入組標(biāo)準(zhǔn)：18～60歲、診斷符合《糖尿病腎病防治專家共識(shí)(2014年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)、腎臟穿刺活檢確診為DN的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠或哺乳期婦女、合并其他繼發(fā)性腎病、入組前應(yīng)用激素或免疫抑制劑、近1月有泌尿系或其他系統(tǒng)感染病史、有其他器官嚴(yán)重的功能不全、惡性腫瘤患者。臨床資料包括性別、年齡、糖化血紅蛋白、體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)、平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)、24 h尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮、估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、血尿酸。所有入組者均簽署知情同意書，該研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 試劑與儀器

人IL-1β、TNF-α和MCP-1 ELISA試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物有限公司；TNF-α、CD68單克隆抗體購(gòu)自臺(tái)灣Arigo Biolaboratories公司；BTK、Phospho-BTK單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；iNOS單克隆抗體購(gòu)自英國(guó) Abcam公司；免疫組化試劑盒( PV-9000)購(gòu)自北京中杉金橋公司；免疫熒光二抗鼠Alexa Fluor 594 和兔 Alexa Fluor 488購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；激光共聚焦顯微鏡LSM880購(gòu)自德國(guó)Leica公司。病理切片標(biāo)準(zhǔn)：腎小球數(shù)目≥8個(gè)，經(jīng)2位病理專家獨(dú)立診斷確診為DN。病理評(píng)級(jí)參考腎臟病理學(xué)會(huì)(RPS)2010年發(fā)表的糖尿病腎病的病理分類。

1.3 方法

1

.

3

.

1

ELISA實(shí)驗(yàn) 收集各組血清，并通過(guò)ELISA檢測(cè)各組血清中IL-1β，TNF-α和MCP-1表達(dá)，檢測(cè)步驟參考說(shuō)明書進(jìn)行。

1

.

3

.

2

免疫組化實(shí)驗(yàn) 腎組織切片常規(guī)脫蠟至水化，依次經(jīng)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉，高壓法修復(fù)抗原，10%山羊血清封閉，滴加一抗TNF-α(1 ∶200)、CD68(1 ∶200)、BTK(1 ∶400)，4 ℃孵育過(guò)夜(大于8 h)，沖洗后滴加二抗(辣根酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物)，37 ℃孵育30 min，沖洗后進(jìn)行DAB顯色。所有切片在顯微鏡下隨機(jī)拍攝10個(gè)視野，通過(guò)Image J軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算棕色陽(yáng)性位點(diǎn)或棕色陽(yáng)性面積占比，最后計(jì)算出各組平均值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1

.

3

.

3

免疫熒光實(shí)驗(yàn) 腎組織切片常規(guī)脫蠟至水化，依次經(jīng)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉，高壓法修復(fù)抗原，10%山羊血清封閉，滴加一抗CD68(1 ∶200)、iNOS(1 ∶200)、BTK(1 ∶400)、p-BTK(1 ∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，沖洗后滴加二抗(抗小鼠 Alexa Fluor 594 和抗兔 Alexa Fluor 488)，室溫下避光孵育2 h，DAPI染核10 min，甘油封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床指標(biāo)

與對(duì)照組相比，DN組糖化血紅蛋白、SBP、DBP、MAP、24 h尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮、血尿酸明顯升高，eGFR明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=7.726，

t

=2.959，

t

=2.219，

t

=2.828，

Z

=-6.083，

Z

=-5.333，

t

=4.894，

t

=4.240，

t

=6.394，均

P

<0.05)；年齡、性別及BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組及DN組的一般臨床指標(biāo)比較

2.2 各組血清及腎臟中炎癥變化

ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DN組血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=3.868，

t

=3.088，

t

=13.690，均

P

<0.05)，提示DN患者血清中炎癥介質(zhì)增加。見(jiàn)圖1A。免疫組化結(jié)果顯示，DN組腎臟中TNF-α表達(dá)高于對(duì)照組(

t

=3.418，

P

<0.05)，提示DN患者腎組織中炎癥同樣增加。見(jiàn)圖1B。

圖1 各組血清中IL-1β、TNF-α和MCP-1表達(dá)及腎臟中TNF-α表達(dá)差異

2.3 各組腎組織CD68、BTK、p-BTK表達(dá)變化

免疫組化結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，DN組腎小球和腎小管中的CD68、BTK和p-BTK表達(dá)均明顯增加(

t

=5.774，

t

=6.119，

t

=4.542，

t

=7.315，

t

=6.760，

t

=7.610，均

P

<0.05)，提示DN患者腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，并伴有BTK表達(dá)與激活增加。見(jiàn)圖2。

圖2 各組腎組織中CD68、BTK及p-BTK表達(dá)變化 ×400免疫組化檢測(cè)各組腎小球及腎小管間質(zhì)中CD68、BTK及p-BTK表達(dá)變化；與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.4 各組腎組織CD68與iNOS、p-BTK共表達(dá)

激光共聚焦結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DN組腎臟內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，并且巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS與p-BTK表達(dá)增加，提示DN腎臟中巨噬細(xì)胞激活，并且BTK磷酸化參與了該過(guò)程。見(jiàn)圖3。

圖3 DN組腎組織中CD68與iNOS、p-BTK共表達(dá) ×400

2.5 DN組腎臟BTK表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

該實(shí)驗(yàn)將年齡、性別、糖化血紅蛋白、SBP、DBP、MAP及血尿酸作為控制因素，分別對(duì)腎小球及腎小管間質(zhì)內(nèi)BTK表達(dá)與24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐及血尿素氮進(jìn)行線性相關(guān)分析。結(jié)果顯示，DN組腎小球BTK表達(dá)與24 h尿蛋白(

R

=0.511,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.339,

P

=0.026)呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(

R

=-0.386,

P

=0.011)，腎小球內(nèi)BTK表達(dá)與血尿素氮無(wú)明顯相關(guān)性(

R

=0.191,

P

=0.220)；同時(shí)，腎小管間質(zhì)內(nèi)BTK表達(dá)與24 h尿蛋白(

R

=0.550,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.453,

P

=0.002)及血尿素氮(

R

=0.355,

P

=0.019)也呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(

R

=-0.451,

P

=0.002)，提示腎臟內(nèi)BTK的表達(dá)與DN患者的臨床指標(biāo)具有顯著的相關(guān)性。見(jiàn)圖4。

圖4 DN組腎小球及腎小管間質(zhì)中BTK表達(dá)與24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐、血尿素氮相關(guān)性分析

2.6 DN組腎臟p-BTK表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

該實(shí)驗(yàn)對(duì)腎小球及腎小管間質(zhì)內(nèi)p-BTK的表達(dá)與24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐及血尿素氮進(jìn)行線性相關(guān)分析。結(jié)果顯示，DN組腎小球p-BTK表達(dá)與24 h尿蛋白(

R

=0.671,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.482,

P

=0.001)及血清尿素氮(

R

=0.421,

P

=0.004)均呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(

R

=-0.458,

P

=0.002)；同時(shí)，腎小管間質(zhì)內(nèi)p-BTK表達(dá)與24 h尿蛋白(

R

=0.552,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.455,

P

=0.002)及血尿素氮(

R

=0.359,

P

=0.017)也呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(

R

=-0.454,

P

=0.002)，提示腎臟內(nèi)BTK的磷酸化激活與DN患者的臨床指標(biāo)同樣具有很強(qiáng)的相關(guān)性。見(jiàn)圖5。

圖5 DN組腎小球及腎小管間質(zhì)中p-BTK表達(dá)與24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐、血尿素氮相關(guān)性分析

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，糖尿病的患病率呈逐年上升的趨勢(shì)。目前全球有4.15億人患有糖尿病，估計(jì)有1.93億人未診斷出糖尿病。2型糖尿病占糖尿病患者的90%以上，并且大約30%～40%的糖尿病患者會(huì)發(fā)展為腎病。DN給患者及社會(huì)都帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，其預(yù)防與治療成為目前亟需解決的難題。

DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前大多認(rèn)為是由于機(jī)體的高血糖微環(huán)境導(dǎo)致代謝及血流動(dòng)力學(xué)的紊亂引起了腎臟疾病，但隨著研究的深入，大量研究表明炎癥在DN的整個(gè)病程期間均起著重要作用，并決定著疾病的發(fā)展方向。高糖環(huán)境下可誘導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞)浸潤(rùn)，其中巨噬細(xì)胞在DN患者的腎臟活檢組織和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型腎組織均有發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)，并且巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度與腎損害的嚴(yán)重程度和纖維化程度相關(guān)。巨噬細(xì)胞可通過(guò)多種機(jī)制介導(dǎo)腎損傷，包括活性氧(ROS)、細(xì)胞因子和蛋白酶等的產(chǎn)生，這些損傷介質(zhì)可以導(dǎo)致腎臟的炎癥并最終引起纖維化改變。該研究表明，DN患者血清中促炎介質(zhì)表達(dá)升高，并且DN患者腎組織中TNF-α表達(dá)增加，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及激活增加。DN患者血清中的促炎趨化因子可以招募巨噬細(xì)胞進(jìn)入腎臟，同時(shí)高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的激活，引起腎臟內(nèi)炎癥的增加進(jìn)而參與疾病的進(jìn)展。

Bruton酪氨酸激酶(BTK)是Tec胞質(zhì)酪氨酸激酶家族的成員，主要在髓系造血細(xì)胞中表達(dá)。除了其在B細(xì)胞中的重要調(diào)控作用外，BTK還參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化和促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路，而后者在DN的進(jìn)展中起著重要作用。課題組前期研究表明，高糖可以激活骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞中BTK表達(dá)，并且通過(guò)激活下游的NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)促炎介質(zhì)的釋放，而BTK抑制后可以減輕該過(guò)程。該研究結(jié)果顯示，DN患者腎組織中BTK的表達(dá)與激活增加，并且免疫熒光共標(biāo)結(jié)果顯示，BTK可以在巨噬細(xì)胞中激活。通過(guò)進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，研究表明DN組腎組織中腎小球和腎小管內(nèi)BTK及p-BTK的表達(dá)均與24 h尿蛋白和血清肌酐呈正相關(guān)，與腎小球?yàn)V過(guò)率呈負(fù)相關(guān)，并且腎小管間質(zhì)中的BTK表達(dá)與血尿素氮呈正相關(guān)，腎小球及腎小管間質(zhì)中p-BTK的表達(dá)均與血尿素氮呈正相關(guān)。這提示BTK介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在DN的疾病進(jìn)程中有著重要的作用，BTK可以作為DN的潛在治療靶點(diǎn)。

DN目前缺乏有效的治療手段，而減輕腎組織的炎癥對(duì)于延緩疾病的進(jìn)程有著重要的作用。該研究表明DN患者微循環(huán)和腎臟內(nèi)炎癥的增加，并且該過(guò)程與巨噬細(xì)胞和BTK的激活有著重要的聯(lián)系。BTK的表達(dá)與DN患者的臨床指標(biāo)有著重要的相關(guān)性。該研究具有重要的臨床意義且可能為DN的治療提供了新的思路。