烏司他丁對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥厚的保護作用

孫 滔，段靜思，龔 倩，葛圣林，陳志武

心肌肥厚被認為是心血管疾病的獨立危險因素，病理性的肥厚通常會發(fā)展為心力衰竭，并最終引起心源性猝死。心肌肥厚的主要特征是心肌細胞的肥大，而不是心肌細胞的增加。盡管分子機制十分復雜，許多證據(jù)已經(jīng)表明自噬在心肌肥大過程中起到重要作用。自噬是真核生物細胞代謝和更新的過程。研究表明，基礎水平的自噬有助于維持心臟的形態(tài)和功能，而過度激活的自噬可能會適得其反。因此，抑制過度自噬對防止心肌肥大有積極意義。

烏司他丁(ulinastatin, UTI)是一種蛋白酶抑制劑，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫和改善循環(huán)的作用。研究表明，UTI對心力衰竭大鼠有保護作用，可以降低炎癥指標，改善心室重構。但尚不清楚UTI是否對心肌肥厚大鼠具有保護作用。因此，該研究通過注射異丙腎上腺素建立大鼠心肌肥厚模型，探究UTI是否對心肌肥厚大鼠具有保護，并進一步闡釋其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(210±10)g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(皖)2017-001。所有動物均在標準條件下飼養(yǎng)[溫度(23±2 ) ℃，濕度45%～75%]，照明周期12 h光照/黑暗，并且正常飲食自由飲水。

1.2 藥品與試劑

UTI購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：031909213；鹽酸異丙腎上腺素購自上海麥克林生化科技有限公司，批號：K07M7B10273；兔源Beclin-1抗體、兔源LC3B抗體購自英國Abcam公司，批號分別為GR3236570-9和GR3199111-3；兔源ATG-5抗體、兔源ATG-7抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司, 批號分別為5和9；兔源TNF-α抗體、兔源IL-6抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司，批號分別為L12092841和L11101581；兔源內(nèi)參GAPDH抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：AF7021；預染蛋白Marker購自中國賽默飛世爾科技有限公司，批號為00880566；BCA蛋白濃度試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；超敏度ECL發(fā)光液購自江蘇親科生物研究中心有限公司，批號為KF005；山羊抗兔lgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.3 主要儀器

全波長酶標儀(上海賽默飛世爾科技有限公司)，凝膠電泳儀、電泳槽 (美國BIO-RAD公司)，離心機(德國Hettich公司)，ChemiDoc MP成像儀(美國BIO-RAD公司)，石蠟組織切片機(德國Leica公司)。

1.4 方法

1

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4

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1

實驗分組及大鼠心肌肥厚模型建立 所有大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，分為4組：正常對照組(Ctrl組，

n

=8)，異丙腎上腺素組(ISO組，

n

=8)，UTI+異丙腎上腺素組(UTI+ISO，

n

=8)，普萘洛爾+異丙腎上腺素組(Pro+ISO，

n

=8)。大鼠心肌肥厚模型的建立以及UTI的給藥劑量參考先前的研究。整個實驗持續(xù)21 d，除Ctrl組外，所有大鼠通過皮下多點注射ISO 5 mg/(kg·d)，連續(xù)7 d，建立心肌肥厚模型。第8～21天，UTI+ISO組腹腔注射UTI 30 000 U/(kg·d)，Pro+ISO組注射普萘洛爾40 mg/(kg·d)，ISO組腹腔注射等量生理鹽水。Ctrl 組第1～7天皮下注射等量生理鹽水，8～21 d腹腔注射等量生理鹽水。

1

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4

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2

M型超聲檢測大鼠心臟功能 實驗結束后，對大鼠進行無創(chuàng)超聲檢測。腹腔注射2.5%三溴乙醇麻醉大鼠，前胸壁脫毛后，暴露前胸，將超聲探頭置于左胸壁，采集M模式超聲心動圖。主要采集指標包括：舒張期室間隔厚度(IVSd)，左室后壁舒張末期厚度(LVPWd)，左室射血分數(shù)(LVEF)，左室短軸縮短率(LVFS)。每只大鼠記錄3次，采集3個連續(xù)心動周期用于數(shù)據(jù)分析。

1

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4

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3

心肌質(zhì)量與體質(zhì)量 稱量大鼠體質(zhì)量(body weight，BW)，麻醉后取心臟并用預冷的PBS灌洗，用雙層濾紙充分吸干水分，準確稱量全心質(zhì)量(heart weight，HW)，再去除心房、右心室、瓣膜等其他組織，剝離左心室，稱量左心室心肌質(zhì)量( left ventricular weight, LVW), 計算心臟體質(zhì)量指數(shù)(HMI=HW/BW)以及左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI=LVW/BW)。

1

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4

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4

HE和Masson染色 取大鼠心肌組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇梯度脫水后，行石蠟包埋、切片，分別進行蘇木精-伊紅染色以及Masson染色。蘇木精伊紅染色用于觀察心肌壞死的程度，Masson染色用于觀察心肌纖維化程度。Masson染色后使用image J軟件進行膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)分析統(tǒng)計心肌纖維化程度。

1

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4

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5

Western blot檢測蛋白表達水平 大鼠心肌組織保存于-80 ℃冰箱，稱取50 mg左心室心肌組織，加入RIPA裂解液，使用冰凍研磨儀在-4 ℃制備心肌組織勻漿，置于冰上裂解30 min后離心提取蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，各組蛋白煮沸變性后取相同質(zhì)量的蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳分離。將蛋白濕轉入甲醇激活過的PVDF膜上，PVDF膜置于5%脫脂牛奶中進行封閉1 h，依照蛋白分子量的大小截取不同條帶，分別放置于含有ATG-7、ATG-5、Beclin-1、LC3B、TNF-α、IL-6、GAPDH一抗的溶液中，在4 ℃條件下孵育過夜，漂洗3次后與二抗在常溫下孵育1 h。洗膜3次，使用增強化學發(fā)光顯色法進行顯色，用Image J軟件進行蛋白表達分析。

2 結果

2.1 UTI對心肌肥厚大鼠心臟功能的影響

由圖1結果可見，與Ctrl組大鼠相比，ISO組大鼠的舒張期室間隔厚度(IVSd)以及左室后壁厚度(LVPWd)均升高(

F

=70.62、

F

=42.02，

P

<0.05)，而左室射血分數(shù)(LVEF)，左室短軸縮短率(LVFS)表現(xiàn)出下降，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=30.22、

F

=27.27，

P

<0.05)，表明ISO組大鼠出現(xiàn)心臟肥厚和心臟功能的降低。與ISO組相比較，UTI+ISO組大鼠的IVSd、LVPWd減低，LVEF、LVFS升高，差異有統(tǒng)計學意義。相較于ISO組，Pro+ISO組大鼠的IVSd、LVPWd更低，LVEF、LVFS水平更高。這一結果顯示UTI可抑制ISO誘導的心臟肥厚，并改善心肌肥厚大鼠的心臟功能。

2.2 UTI對心肌肥厚大鼠HMI、LVMI的影響

心肌肥厚發(fā)生時，常伴隨著心臟質(zhì)量的增加，這其中左心室質(zhì)量的增加尤為明顯?？梢酝ㄟ^稱量大鼠的全心質(zhì)量以及左心室質(zhì)量與體質(zhì)量之比來判斷心肌肥厚的程度。如表1所示，各組大鼠的體質(zhì)量無明顯差別，而ISO組全心質(zhì)量及左心室質(zhì)量升高，在使用UTI后這種現(xiàn)象得到了抑制，當使用普萘洛爾時這種抑制現(xiàn)象更為明顯。圖2結果顯示，與Ctrl組比較，ISO組的HMI、LVMI升高，而UTI+ISO組大鼠的HMI和LVMI低于ISO組，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=46.2，

F

=65.65，

P

<0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量的比較

圖1 UTI對心肌肥厚大鼠心臟功能的影響

圖2 UTI對心肌肥厚大鼠體質(zhì)量指數(shù)、左心室質(zhì)量指數(shù)的影響

2.3 UTI對心肌肥厚大鼠組織病理學的影響

HE染色顯示Ctrl組大鼠心肌細胞結構正常、排列整齊，大小形態(tài)基本一致，ISO組大鼠心肌細胞結構受損，心肌纖維排列紊亂，部分區(qū)域心肌纖維組織出現(xiàn)缺失和斷裂。大鼠UTI+ISO組心肌病理改變程度較ISO組有所減輕，心肌纖維比較完整，基本上呈整齊排列(圖3A)；Masson染色結果顯示與正常組比較，ISO組大鼠心肌出現(xiàn)了更多的淡藍色的膠原纖維(圖3B)，進行定量分析表明CVF升高(圖3C)；與ISO組相比，UTI+ISO組大鼠CVF降低，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=164.1，

P

<0.05)。Pro+ISO組大鼠的CVF相較于UTI+ISO組更低。以上結果表明UTI可減輕ISO導致的心肌損傷，并降低心肌纖維化程度。

圖3 UTI對心肌肥厚大鼠心肌組織病理學的影響

2.4 UTI對心肌肥厚大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6蛋白表達的影響

為了進一步探究UTI對異丙腎上腺素誘導的大鼠心臟保護的可能機制，該研究選擇Ctrl組、ISO組、UTI+ISO組進行心肌組織的Western blot分析。如圖4所示，與Ctrl組相比，ISO組大鼠心肌中TNF-α、IL-6蛋白的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義。UTI可降低大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6蛋白的升高，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=89.15，

F

=131.00，

P

<0.05)。結果顯示UTI可抑制心肌肥厚大鼠心肌組織中的炎癥蛋白的表達。

圖4 UTI對大鼠肥厚心肌組織中TNF-α、IL-6蛋白表達的影響

2.5 UTI對心肌肥厚大鼠心肌中ATG-5、ATG-7、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達的影響

圖5的Western blot檢查結果顯示，與Ctrl組相比，ISO組大鼠心肌中ATG-5、ATG-7、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義；而使用UTI可抑制心肌肥厚大鼠心肌組織中ATG-5、ATG-7、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的升高，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=611.00，

F

=63.02，

F

=65.29，

F

=68.31，

P

<0.05)。

圖5 UTI對大鼠肥厚心肌中ATG-5、ATG-7、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達的影響

這些結果提示UTI可能抑制心肌肥厚大鼠心肌組織中的自噬水平。

3 討論

心肌肥厚是對血流動力學負荷增加的適應性過程，是冠狀動脈疾病和心力衰竭發(fā)展的主要預測指標。長期的心肌適應性肥大會引起心肌病理性肥厚，導致心功能不全、心律失常及心臟衰竭等不良預后，因此，研究其發(fā)病機制及尋找治療藥物意義重大。

心肌肥厚常常伴隨心肌結構和功能的改變，心臟超聲在診斷心肌肥厚方面起到重要作用，是一種簡單、無創(chuàng)的檢測手段，因此，該研究使用M形超聲來評價大鼠心功能。實驗結果表明，ISO可誘導大鼠左心室心肌肥厚和左心功能下降，表現(xiàn)為IVSd、LVPWd增高和LVEF、LVFS下降，但UTI治療后，這種左心室心肌肥厚和心功能下降的現(xiàn)象可被阻斷，表現(xiàn)為IVSd、LVPWd的下降和LVEF、LVFS的上升。結果表明UTI可改善ISO誘導大鼠左心室心肌肥厚和左心功能下降。HMI與LVMI測定結果也同樣證實了這一點。

為了進一步評估心臟肥厚程度，該研究使用病理組織學檢查觀察心肌肥厚時心肌的形態(tài)以及心肌纖維化程度。HE染色檢查結果表明ISO誘導的大鼠心肌細胞異常增大、細胞結構排列紊亂、纖維細胞增生，使用UTI治療后這種現(xiàn)象被抑制；Masson染色的結果表明ISO可以誘導大鼠的心肌纖維化，心肌間質(zhì)膠原纖維沉積增多，而UTI可改善心肌肥厚過程中的病理性纖維化，病理學半定量評分減小，表明UTI可改善ISO誘導的大鼠心肌肥厚及纖維化程度。

促炎細胞因子對各個器官的炎癥反應具有重要影響。在心肌肥厚的過程中，炎癥能夠促進心肌細胞的肥大。TNF-α、IL-6是最具代表性的兩個細胞因子。TNF-α可以通過鞘磷脂酶途徑的激活來介導抑制心臟的收縮，最終導致心肌肥厚的發(fā)生。IL-6可以通過自分泌和旁分泌對心肌細胞和成纖維細胞產(chǎn)生影響，介導產(chǎn)生心肌肥厚和心肌纖維化，研究表明抑制IL-6的表達后心肌肥厚得到減輕。

目前，越來越多的證據(jù)支持細胞因子可以通過多種途徑激活自噬。自噬是真核生物高度保守的生物學過程。研究已經(jīng)表明自噬參與了心肌肥厚的過程，抑制自噬可以改善心臟功能，從而減輕病理性的心肌肥厚。Beclin-1是自噬的核心蛋白，對自噬體膜的誘導形成、自噬相關蛋白定位自噬體膜具有促進作用，Beclin1能夠反應自噬的強度。LC3是自噬標記蛋白，當自噬啟動時，LC3-Ⅰ被ATG-7活化成LC3-Ⅱ，再經(jīng)過ATG-5的促進，最終LC3-Ⅱ被固定在自噬體膜上，因而LC3-Ⅱ的含量反應自噬的活躍程度。現(xiàn)有研究表明，TNF-α可以通過JNK和Erk信號傳導以及活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而激活自噬過程；心臟中IL-6可以激活JAK-STAT通路，從而使自噬的表達水平升高。該研究表明經(jīng)ISO誘導的心肌肥厚大鼠心肌中促炎細胞因子TNF-α、IL-6表達以及標志性自噬蛋白Beclin1、ATG-5、ATG-7、LC3-Ⅱ的表達水平升高，而在經(jīng)過UTI治療后，促炎細胞因子及自噬蛋白的表達減少。這些結果表明，一方面，UTI可能通過抑制細胞因子的表達，直接起到心臟保護的作用；另一方面，UTI可能通過介導心肌細胞中促炎因子水平的降低，從而減輕自噬的水平，最終達到保護心臟的作用。

綜上所述，該研究在皮下注射ISO誘導的大鼠心肌肥厚模型上，UTI可改善大鼠心肌肥厚和心功能的下降，其機制可能與抑制炎癥以及自噬有關。