C-Myc通過調(diào)控lncRNA NEAT1對口腔鱗癌細胞增殖作用的研究

許玉俊，朱友明， 何家才，3

口腔惡性腫瘤是世界第6大常見癌癥，近些年其發(fā)病率在中國呈上升趨勢。大部分惡性腫瘤細胞即使在氧供充足的情況下，其葡萄糖代謝也傾向于糖酵解，從而發(fā)生“有氧糖酵解”現(xiàn)象，即“Warburg效應”。有氧糖酵解不僅能夠為腫瘤細胞提供增殖所需的能量，也能夠為新生的腫瘤細胞提供合成代謝的底物。據(jù)報道，C-Myc參與細胞凋亡，而且與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。研究表明，長鏈非編碼RNA核富集轉(zhuǎn)錄本1(long non-coding RNA nuclear enriched abundant transcript 1，lncRNA NEAT1)在多種惡性腫瘤中的表達水平呈現(xiàn)異常，但是，其表達量上調(diào)的機制還未完全清楚。該實驗擬探討C-Myc和lncRNA NEAT1在口腔癌細胞中的調(diào)控關(guān)系以及l(fā)ncRNA NEAT1對口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma ，OSCC)細胞糖酵解水平的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取15例安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和安徽省口腔醫(yī)院頜面外科初診確認為口腔癌的患者的口腔癌組織及正常癌旁組織。所有口腔癌患者術(shù)前均未進行過放化療等治療。標本置于凍存管內(nèi)，編號，液氮中保存待用，記錄相關(guān)信息。

1.2 主要材料

OSCC3、人胚胎腎細胞293T、大腸桿菌DH5α(安徽省口腔疾病研究重點實驗室保存)；胎牛血清購自美國康寧生命科學有限公司；噻唑藍(MTT)試劑、RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol細胞裂解試劑購自美國賽默飛世爾科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本寶生物工程有限公司。載體質(zhì)粒 plko.1、pCDH，慢病毒包裝質(zhì)粒pRev、pGag、pVsvg、pAX2、pMD2，表達載體plko.1-shc-Myc、對照組plko.1-shctrl、flag-c-Myc，對照組flag空載(中國科學技術(shù)大學生科院提供)；表達載體plko.1-shlnc-NEAT1(plko.1-shlncNEAT1 AAGTCCAAAAGGAGCACT)及對照組 plko.1-shConctrol(該實驗室構(gòu)建)；lnc-NEAT1、對照組Control質(zhì)粒、PCR引物(由上海生工技術(shù)服務有限公司設(shè)計合成，pCDH-lnc-NEAT1載體的引物，上游引物：GCGAATTCGCAAAAGTTGTGGCAAGTCCAGCC；下游引物：GCGGATCCTACCCACCATTCCCTTCTCCTAGT)(中國科學技術(shù)大學生科院實驗室提供)。

1.3 方法

1

.

3

.

1

細胞培養(yǎng)及傳代 OSCC3、293T細胞用10% 胎牛血清以及1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液置37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換1次液；待細胞融合至80%時，消化、傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

1

.

3

.

2

構(gòu)建表達載體plko.1-shlnc-NEAT1、包裝慢病毒和轉(zhuǎn)染OSCC3細胞 根據(jù)shlnc-NEAT1 AAGT CCAAAAGGAGCACT，合成plko.1-shlnc-NEAT1。擴增目的片段，回收。37 ℃水浴酶切目的片段和質(zhì)粒載體 plko1，連接產(chǎn)物和載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌DH5α體內(nèi)，涂于Luria-Bertani培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱倒置過夜、篩選、測序鑒定，成功構(gòu)建plko.1-shlnc-NEAT1。慢病毒包裝:消化293T細胞，6孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合至50%時，用上述攜帶目的片段的表達載體(2 μg)和病毒包裝質(zhì)粒(2 μg pRev、2 μg pGag、1 μg pVsvg)共轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)48 h后，收集病毒上清液，過濾、分裝、-80 ℃保存。慢病毒轉(zhuǎn)染：病毒感染前24 h，消化OSCC3細胞，鋪6孔板，待細胞融合為30% 時，上述病毒液感染OSCC3，同時加入2 μl的8×10g/L 聚凝胺，培養(yǎng)24 h、換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1

.

3

.

3

構(gòu)建表達載體pCDH-lnc-NEAT1、包裝慢病毒和轉(zhuǎn)染OSCC3細胞 由上海生工技術(shù)服務有限公司設(shè)計pCDH-lnc-NEAT1載體的引物，上游引物： GCGAATTCGCAAAAGTTGTGGCAAGTCCAGCC；下游引物：GCGGATCCTACCCACCATTCCCTTCTCCTAGT，合成pCDH-lnc-NEAT1。擴增目的片段，回收。水浴雙酶切基因片段和質(zhì)粒載體pCDH，連接產(chǎn)物和載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α內(nèi)，涂布于Luria-Bertani培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱內(nèi)倒置過夜、篩選、測序鑒定，成功構(gòu)建pCDH-lnc-NEAT1。慢病毒包裝:消化293T細胞，6孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合50%時，用上述攜帶目的片段的表達載體(2 μg)和病毒包裝質(zhì)粒(3 μg pAX2、2 μg pMD2)共轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)48 h后，收集病毒上清液，過濾、分裝、-80 ℃保存。慢病毒轉(zhuǎn)染：病毒感染前24 h，消化OSCC3細胞，鋪6孔板，待細胞融合為30%時，上述病毒液感染OSCC3，同時加入2 μl的8×10g/L聚凝胺，培養(yǎng)24 h、換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1

.

3

.

4

qRT-PCR檢測lnc-NEAT1的表達水平 提取 plko.1-shc-Myc、flag-c-Myc、plko.1-shlnc-NEAT1、lnc-NEAT1及其各自對照組的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。lncRNA NEAT1上游引物：CCAGGGTGGTGGCAGTGCTCC，下游引物：CACCCCAGCCTCAGCGGGAAG ；Actin上游引物：TCCATCATGAAGTGTGACG，下游引物：TACTCCTGCTTGCTGATCCAC。將配制好的擴增體系依次按順序加入8連管中，每組設(shè)置3個復孔，上機設(shè)置反應程序，預變性：95 ℃、2 min； PCR反應：95 ℃、5 s；60 ℃、15 s；72 ℃、 20 s，循環(huán)40次。記錄結(jié)果，以Actin作為分子內(nèi)標，采用2法比較分析各組 lncRNA NEAT1的表達量。

1

.

3

.

5

Western blot檢測C-Myc蛋白的表達 RIPA裂解 plko.1-shc-Myc、flag-c-Myc及其各自對照組的OSCC3細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度，煮蛋白，凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉2 h，抗體孵育，TBST充分洗膜，顯影，分析條帶灰度。

1

.

3

.

6

MTT比色法檢測OSCC3細胞生長 將轉(zhuǎn)染shlnc-NEAT1以及l(fā)nc-NEAT1后的OSCC3細胞按2×10個/孔接種于96孔板，每組設(shè)置3個復孔，培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng) 6、12、24、48、72 h，每孔依次加入 MTT試劑 10 μl(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸除各孔培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μl，低速振蕩10 min，檢測各孔吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1

.

3

.

7

糖酵解壓力檢測OSCC3細胞能量代謝 將轉(zhuǎn)染lnc-NEAT1以及其對照組的OSCC3細胞按2×10個/孔傳代到安捷倫Seahorse XFe 96孔板，Seahorse基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1 mmol/L谷氨酰胺，預熱培養(yǎng)基到37 ℃，用0.1 mol/L NaO調(diào)節(jié)pH至7.4，繼續(xù)37 ℃保溫；96孔板每孔加入糖酵解壓力試劑后，按既定的糖酵解壓力程序開始檢測；結(jié)束后，對每孔的OSCC3細胞進行定量，根據(jù)結(jié)果再用Seahorse 結(jié)果分析軟件輸出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 目標lncRNA的確定

檢測shctrl和shc-Myc的OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA的表達情況。相關(guān)的長鏈非編碼RNA的表達已不同程度地下降。經(jīng)過篩選后，篩選出3個目的長鏈非編碼RNA，分別為lncRNA H19、lncRNA NEAT1、lncRNA SNHG1；經(jīng)過大量的文獻閱讀，得知長鏈非編碼RNA NEAT1參與多種腫瘤細胞的發(fā)生、增殖以及發(fā)展。同時，當C-Myc基因下調(diào)，結(jié)果中檢測到長鏈非編碼RNA NEAT1表達量降低，而且差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。長鏈非編碼RNA NEAT1與口腔癌細胞的發(fā)生以及增殖，還未見詳盡的報道，因此，該課題組選擇了長鏈非編碼RNA NEAT1。lncRNA檢測數(shù)據(jù)見圖1。

圖1 敲低C-MycOSCC3細胞中l(wèi)ncRNA表達量變化與shctrl對照組比較：*P<0.05

2.2 口腔癌組織中l(wèi)ncRNA表達情況

15例癌組織中有13例組織lncRNA NEAT1表達量高于癌旁組織，10例口腔癌組織lncRNA NEAT1表達量高于癌旁組織的2倍多。結(jié)果顯示，lncRAN NEAT1在口腔癌組織中的高表達可能與口腔癌發(fā)展有關(guān)(

P

<0.05)，見圖2。

圖2 口腔癌組織以及癌旁組織中l(wèi)ncRNA NEAT1表達水平與癌旁組織組比較：*P<0.05

2.3 上調(diào)C-Myc對OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示flag-c-Myc組蛋白表達較flag對照組增高，見圖3A。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示flag-c-Myc組lncRNA NEAT1的表達量高于flag對照組，見圖 3B。結(jié)果顯示，上調(diào)C-Myc可能提高OSCC3細胞的lncRNA NEAT1的表達水平(

P

<0.05)。

圖3 上調(diào)C-Myc對OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達水平的影響

2.4 敲低C-Myc對OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與shctrl對照組比較，shc-Myc組C-Myc蛋白表達降低，見圖4A。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示shc-Myc組lncRNA NEAT1表達量較shctr對照組降低，見圖4B。結(jié)果顯示，敲低C-Myc可能降低OSCC3細胞的lncRNA NEAT1的表達水平(

P

<0.05)。

圖4 敲低C-Myc對OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達水平的影響

2.5 上調(diào)lncRNA NEAT1對OSCC3細胞增殖能力的影響

qRT-PCR檢測lncRNA NEAT1組和對照(Control)組OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達水平。結(jié)果顯示，lncRNA NEAT1組OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1過表達(

P

<0.05)，見圖5A。MTT比色法檢測兩組細胞的增殖能力。結(jié)果顯示，與Control組相比，lncRNA NEAT1組轉(zhuǎn)染12 h時細胞增殖能力開始增加，直到72 h細胞增殖能力一直處于增加狀態(tài)，見圖5B。結(jié)果顯示，上調(diào)OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1，可能促進細胞增殖能力(

P

<0.05)。

圖5 上調(diào)lncRNA NEAT1對OSCC3細胞增殖能力的影響

2.6 敲低lncRNA NEAT1對OSCC3細胞增殖能力的影響

qRT-PCR檢測shlncRNA NEAT1組和對照(shControl)組OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達水平。結(jié)果顯示，shlncRNA NEAT1組OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達量降低(

P

<0.05)，見圖6A。MTT比色法檢測兩組細胞的增殖能力。結(jié)果顯示，與shControl組相比，shlncRNA NEAT1組轉(zhuǎn)染12 h時細胞增殖能力開始降低，直到72 h細胞增殖能力仍然持續(xù)降低，見圖6B。結(jié)果顯示，敲低OSCC3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達可能降低細胞的增殖能力(

P

<0.05)。

圖6 敲低lncRNA NEAT1對OSCC3細胞增殖能力的影響

2.7 上調(diào)lncRNA NEAT1對OSCC3細胞的糖酵解水平的影響

糖酵解壓力實驗檢測上調(diào)lncRNA NEAT1的OSCC3細胞中的糖酵解產(chǎn)酸速率以及產(chǎn)生ATP的水平。結(jié)果顯示， lncRNA NEAT1組較Control組細胞糖酵解相對產(chǎn)酸速率以及產(chǎn)生ATP的相對水平均提高，見圖7A、B。因此，上調(diào)lncRNA NEAT1可能促進OSCC3細胞的糖酵解水平(

P

<0.05)。

圖7 上調(diào)lncRNA NEAT1對OSCC3細胞的糖酵解水平的影響

3 討論

Myc基因?qū)儆谠┗蚝驼{(diào)節(jié)基因，L-myc、N-myc和C-Myc組成了Myc基因，它們分別定位于1號染色體、2號染色體和8號染色體。根據(jù)Fan et al研究表明，失調(diào)的C-Myc可以與低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF1)共同作用于己糖激酶2(hexokinase 2 ，HK2)和丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1)，影響線粒體氧化磷酸化作用，從而促進糖酵解。有研究表明，C-Myc可能通過負性調(diào)控lncRNA55，影響舌鱗癌細胞的生長。

lncRNA NEAT1是細胞核內(nèi)的一個lncRNA，可以與一些核內(nèi)蛋白結(jié)合形成亞核結(jié)構(gòu)旁斑。據(jù)報道,lncRNA NEAT1在多種腫瘤中高表達，參與腫瘤的發(fā)展。研究表明，下調(diào)的lncRNA NEAT1通過減弱miR-193對腫瘤的促進作用，抑制腫瘤的發(fā)展。此外，lncRNA NEAT1通過負性調(diào)控miR-139-5p，促進其靶基因CDK6的表達，加速膠質(zhì)瘤的進展。在子宮內(nèi)膜癌中，lncRNA NEAT1靶向miR-146b-5p/MMP9分子軸，通過β-catenin/Wnt信號通路，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。在骨肉瘤中，高表達的lncRNA NEAT1通過負性調(diào)控miR-339-5p/TGF-β1，促進骨肉瘤的發(fā)展。

雖然，大量研究表明lncRNA NEAT1在多種惡性腫瘤中的表達水平呈現(xiàn)異常，然而，lncRNA NEAT1對口腔癌細胞的調(diào)控，迄今還未見詳盡的報道。該實驗通過將表達載體plko.1-shc-Myc以及flag-c-Myc轉(zhuǎn)染至OSCC3細胞中，檢測lncRNA NEAT1表達量，結(jié)果顯示過表達或者敲低C-Myc，lncRNA NEAT1的表達量呈現(xiàn)升高或者降低趨勢，推測C-Myc與lncRNA NEAT1的表達量可能呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。為進一步評估lncRNA NEAT1在OSCC3細胞的生物學功能，構(gòu)建表達載體 plko.1-shlnc-NEAT1以及pCDH-lnc-NEAT1轉(zhuǎn)染至OSCC3細胞，檢測OSCC3 細胞的增殖水平，結(jié)果顯示過表達lncRNA NEAT1可能促進OSCC3細胞的增殖能力。糖酵解壓力實驗結(jié)果顯示過表達的lncRNA NEAT1可能提高OSCC3細胞的糖酵解水平，增強細胞的糖酵解代謝。

因此，在OSCC3細胞中C-Myc可能調(diào)控lncRNA NEAT1的表達，并且lncRNA NEAT1過表達可能提高OSCC3細胞的糖酵解代謝水平，促進口腔癌細胞的增殖能力以及口腔癌的發(fā)展。