光動力療法對牙齦卟啉單胞菌和福賽坦菌生物膜的抗菌效果

陳 晨，何家才

種植體周圍炎是一種發(fā)生在種植體周圍組織與牙菌斑相關(guān)的病理性疾病，其特征是種植體周圍黏膜發(fā)炎，隨后支持骨喪失。有報(bào)道稱種植體周圍炎是由革蘭陰性細(xì)菌感染所引起的，如牙齦卟啉單胞菌(

Porphyromonas

gingivalis

，

P

gingivalis

)和福賽坦菌(

Tannerellaforsythia

，

T

forsythia

)。機(jī)械清創(chuàng)術(shù)因其一定的臨床操作風(fēng)險(xiǎn)而慎用，抗生素療法也會導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生。目前，尚缺乏種植體周圍炎有效的臨床治療方法。自1999年第1個(gè)光動力治療藥物被批準(zhǔn)以來，光動力療法( photodynamic therapy ,PDT)由于其侵襲性和重復(fù)性極小且無誘導(dǎo)耐藥性而成為一種引人注目的治療方式。光動力治療結(jié)合光敏劑和可見光，在氧的存在下產(chǎn)生對細(xì)菌有毒的細(xì)胞毒性活性氧(reactive oxygen species ,ROS)，如單線態(tài)氧。該文旨在研究新型光敏劑NHS-BODIPY-Br在體外對

P

gingivalis

和

T

forsythia

生物膜的抗菌作用，以期為種植體周圍炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

P

gingivalis

(ATCC 33277,美國模式培養(yǎng)物集存庫)；

T

forsythia

(ATCC 43037,美國模式培養(yǎng)物集存庫)；光敏劑NHS-BODIPY-Br(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院提供)；胰酶消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；阿爾瑪藍(lán)試劑盒、顯色基質(zhì)法鱟試劑盒、PBS緩沖劑(美國Solarbio公司)；活/死染試劑盒、CO恒溫孵箱(美國賽默飛公司)；DMEM培養(yǎng)液(美國Gbico公司)；腦心浸液肉湯、氯化血紅素、脫纖維羊血、0.02%維生素K1(青島海博生物公司)；680 nm半導(dǎo)體激光治療儀(中國遠(yuǎn)明激光公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡880(德國zeiss公司)；厭氧培養(yǎng)箱(英國DWS公司)；酶標(biāo)儀(美國bio-tex公司)。

1.2 方法

1

.

2

.

1

光敏劑的準(zhǔn)備 將光敏劑NHS-BODIPY-Br在PBS中稀釋成不同濃度：5、10、15 mg/L。制備好的光敏劑在容器中避光以消除反應(yīng)，并在8 ℃下保存?zhèn)溆谩?p>1

.

2

.

2

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 從該課題組取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行培養(yǎng)，取P3代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將BMSCs以4×10個(gè)/ml的密度接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)液，用PBS清洗，將不同濃度的NHS-BODIPY-Br加入，沒有加光敏劑的細(xì)胞作為對照組。分別在培養(yǎng)第1、3、5天將CCK-8以1 ∶9的比例加入DMEM培養(yǎng)液中，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中2 h，隨后在450 nm波長處檢測各孔的吸光度。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1

.

2

.

3

生物膜的培養(yǎng) 將

P

gingivalis

和

T

forsythia

接種在BHI固體培養(yǎng)基上 ,在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后收獲菌落。用 PBS 稀釋細(xì)菌并采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲瞥杉?xì)菌懸濁液2.5×10～3.5×10CFU/ml。將0.1 ml的細(xì)菌接種在96孔板中，在37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)48 h，獲得的生物膜用于阿爾瑪藍(lán)和脂多糖實(shí)驗(yàn)。將1 ml同樣密度的細(xì)菌接種在共聚焦培養(yǎng)皿上，厭氧培養(yǎng)48 h獲得的生物膜用于激光共聚焦熒光成像。

1

.

2

.

4

光動力治療 去除培養(yǎng)液后，在96孔板中加入0.02 ml不同濃度的光敏劑，在共聚焦培養(yǎng)皿中加入1 ml光敏劑，反應(yīng)5 min后去除光敏劑，使用680 nm波長，光劑量為150 mw/cm的二極管激光器工作100和200 s，分別對應(yīng)15和30 J/cm。

1

.

2

.

5

阿爾瑪藍(lán)活力分析 激光處理結(jié)束后，阿爾瑪藍(lán)溶液以1 ∶10的比例加至培養(yǎng)液中，96孔板每孔中加入0.1 ml該混合液后在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。以600 nm作為參考波長，在570 nm波長下用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。沒有加入光敏劑的細(xì)菌作為對照組。吸光度減少率(%)計(jì)算如下：(對照組阿爾瑪藍(lán)的吸光度-光動力治療后阿爾瑪藍(lán)的吸光度)/對照組阿爾瑪藍(lán)的吸光度×100%。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1

.

2

.

6

脂多糖檢測 在光動力治療后，剩余的脂多糖濃度通過內(nèi)毒素檢測試劑盒來定量。加入細(xì)菌沒有光照的是陽性對照組，沒有加入細(xì)菌的是陰性對照組。在545 nm處讀取吸光度的結(jié)果。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1

.

2

.

7

共聚焦 光動力治療后，在每個(gè)共聚焦培養(yǎng)皿中加入1 ml的活/死染溶液，反應(yīng)20 min后吸出溶液，用PBS清洗3次后用于共聚焦顯微鏡觀察。對照組未進(jìn)行激光照射。每個(gè)治療組設(shè)3個(gè)重復(fù)皿。圖片使用軟件ZEN進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 NHS-BODIPY-Br濃度對BMSCs細(xì)胞增殖的影響

與對照組相比，A、B、C組細(xì)胞吸光度值無明顯差異(

F

=1.715、2.112、1.037,

P

>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、表1。

圖1 CCK-8檢測不同濃度光敏劑對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響A組:5 mg/L; B組:10 mg/L; C組:15 mg/L

表1 CCK8檢測不同時(shí)間和組別的細(xì)胞OD值

2.2 NHS-BODIPY-Br濃度和光照時(shí)間對細(xì)菌活力的影響

不同濃度的NHS-BODIPY-Br經(jīng)過光照0、100、200 s處理后，阿爾瑪藍(lán)檢測結(jié)果顯示生物膜的減少率持續(xù)上升(

F

=28.882、60.525、36.923，

P

<0.05)。例如，當(dāng)NHS-BODIPY-Br濃度5 mg/L，光照0 s時(shí)細(xì)菌減少約17%，光照100 s時(shí)細(xì)菌減少率約67%，光照200 s時(shí)減少率約78%。值得注意的是，當(dāng)NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L和15 mg/L，光照100 s和光照200 s時(shí)細(xì)菌的減少率均接近98%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、表2。

圖2 阿爾瑪藍(lán)檢測結(jié)果

表2 阿爾瑪藍(lán)檢測不同光敏劑濃度和光照時(shí)間對細(xì)菌生物膜的減少率

2.3 NHS-BODIPY-Br濃度和光照時(shí)間對細(xì)菌脂多糖水平的影響

不同濃度的NHS-BODIPY-Br經(jīng)過光照0、100、200 s處理后，脂多糖檢測結(jié)果顯示殘余生物膜脂多糖的吸光度值持續(xù)下降(

F

=41.095、69.514、17.840，

P

<0.05)。當(dāng)NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L和15 mg/L，光照100 s和200 s時(shí)，殘余的脂多糖水平與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 殘余脂多糖水平

2.4 不同NHS-BODIPY-Br濃度和光照時(shí)間處理后的共聚焦顯微鏡成像

圖4A顯示的是對照組的死活染。從圖中綠色熒光度可看出對照組細(xì)菌存活水平顯著。圖4B、E中紅色熒光和綠色熒光相間，當(dāng)NHS-BODIPY-Br濃度5 mg/L，光照100 s和200 s時(shí)還有存活的細(xì)菌。圖4C、D、F、G中紅色熒光度豐富，整個(gè)生物膜中沒有活的細(xì)菌菌落。

圖4 共聚焦熒光成像 ×20

3 討論

近年來，光動力治療作為種植體周圍炎的輔助治療手段引起了越來越多的關(guān)注。與傳統(tǒng)療法相比，PDT有一些優(yōu)勢。光動力學(xué)療法已在醫(yī)學(xué)上用于腫瘤的治療，并建議將其用于消除齦下微生物從而對根表面進(jìn)行更好的滅菌。該研究以NHS-BODIPY-Br作為光敏劑，680 nm半導(dǎo)體激光作為光源，評估了PDT對

P

gingivalis

和

T

forsythia

生物膜的抗菌作用。該實(shí)驗(yàn)使用的BODITY類光敏劑在光動力治療中展示出其獨(dú)特的優(yōu)越性，其吸收峰值為680 nm波長，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，摩爾消光系數(shù)高，暗毒性低，其中溴原子的加入使系間穿梭效率明顯提升，單線態(tài)氧量子產(chǎn)率得到明顯改善，達(dá)到0.76。紫外線被證明對口腔微生物具有出色的抗菌功效。然而，紫外線的照射可能導(dǎo)致DNA損傷和紫外線引起的皮膚損傷，而可見光和近紅外光被認(rèn)為是安全的。而且激光可以改變牙本質(zhì)，從而使膠原纖維暴露，膠原蛋白可促進(jìn)血凝塊的附著和穩(wěn)定。所以該文使用的是一種低功率的半導(dǎo)體激光治療儀，大量研究表明只要參數(shù)設(shè)置合理，使用方法正確，就不會造成牙根和牙周組織的損害。該研究的實(shí)驗(yàn)組與對照組樣品相比，CCK-8的結(jié)果并未隨著NHS-BODIPY-Br的加入而降低，表明NHS-BODIPY-Br對細(xì)胞無毒性，表明了NHS-BODIPY-Br具有生物相容性。通過阿爾瑪藍(lán)來檢測不同光敏劑濃度以及光照時(shí)間細(xì)菌生物膜的減少率，當(dāng)NHS-BODIPY-Br濃度越高，光照時(shí)間越久，細(xì)菌的減少率越高,這與Umeda et al使用光敏劑亞甲基藍(lán)的結(jié)果一致。脂多糖是革蘭陰性菌如

P

gingivalis

的主要細(xì)胞壁成分，殘余脂多糖水平的多少可以間接反應(yīng)殘余的細(xì)菌數(shù)量。NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L，光強(qiáng)度15 J/cm時(shí)脂多糖含量接近陰性對照組的含量，這與細(xì)菌活力的結(jié)果一致。該研究中共聚焦熒光顯微鏡成像顯示當(dāng)NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L，光強(qiáng)度15 J/cm時(shí)能完全殺滅生物膜中的細(xì)菌，光動力治療可以激活敏化細(xì)胞產(chǎn)生ROS，從而促進(jìn)細(xì)菌的死亡。目前研究的一個(gè)局限是生物膜的厚度相對較低。該研究是雙種群生物膜生長2 d，不能完全代表一個(gè)真正口腔環(huán)境的復(fù)雜性，因此，未來的研究必須考慮生物膜厚度的變化。

革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞包膜是一種較為復(fù)雜且相對不易滲透的結(jié)構(gòu)，由內(nèi)質(zhì)膜和外膜組成，外膜由肽聚糖層隔開，而且由于抗菌藥物難以有效穿透生物膜致其在生物膜內(nèi)活性較低。因此，選擇PDT作為替代療法很重要。Fontana et al通過激光共聚焦掃描顯微鏡表明，亞甲基藍(lán)對生物膜敏感性降低的原因是亞甲基藍(lán)穿透生物膜的滲透性降低，導(dǎo)致在生物膜外層滯留，而且吩噻嗪類光敏劑如亞甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)O等是細(xì)菌多藥耐藥泵的底物。但是該研究中當(dāng)NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L，光強(qiáng)度15 J/cm時(shí)，整個(gè)生物膜中的細(xì)菌完全被殺死，說明光敏劑NHS-BODIPY-Br在整個(gè)生物膜中無處不在。而且光敏劑NHS-BODIPY-Br負(fù)載于具有良好水溶性的納米藥物載體中，這可能是它能穿透細(xì)菌生物膜的原因。