抑制自噬可以增強(qiáng)七葉皂苷鈉對(duì)肝細(xì)胞性肝癌的抑制作用

方 超, 周大臣，崔 笑，魏 昇, 耿小平

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率在癌癥中位于第6位，病死率位于第4位，其中，肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占了75%～85%。對(duì)于HCC患者來(lái)說(shuō)，主要的治療方法包括肝臟切除、肝臟移植、射頻消融、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)和藥物治療，但是這些治療都存在一定的局限性。自噬(在此特指巨自噬)是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的高度保守的分解代謝過(guò)程,可以為細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。它能夠保護(hù)正常肝細(xì)胞，阻止其發(fā)生癌變，但是當(dāng)HCC形成后，自噬會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。七葉皂苷鈉是中藥娑羅子的一種自然提取物，先前的研究已經(jīng)表明了它在HCC中的抗腫瘤作用。這篇文章主要研究七葉皂苷鈉對(duì)HCC細(xì)胞自噬流的影響及自噬抑制劑氯喹對(duì)七葉皂苷鈉作用效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1

.

1

.

1

主要試劑 七葉皂苷鈉購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司；氯喹購(gòu)自美國(guó)MCE公司；HCC細(xì)胞系Huh7、HepG2和Hep3B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素/鏈霉素、BCA試劑盒和4%多聚甲醛購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM購(gòu)自美國(guó)Hycolne公司；0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Wisen公司；β-Actin，PI3K (p85)，AKT，4E-BP1，Phospho-4E-BP1 (Thr37/46)購(gòu)自美國(guó)CST公司；LC3B購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；山羊抗鼠或抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)和0.1%結(jié)晶紫購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1

.

1

.

2

主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自上海科華生物工程股份有限公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1

.

2

.

1

細(xì)胞培養(yǎng) 3種細(xì)胞系(Huh7、 HepG2和Hep3B)均在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)，并放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為37 ℃，含有5% CO。細(xì)胞培養(yǎng)液每2 d更換1次，每3～5 d傳1次代，用0.25%胰酶消化，所有細(xì)胞培養(yǎng)不超過(guò)10代。

1

.

2

.

2

細(xì)胞蛋白提取及Western blot 分析 RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑按照100 ∶10 ∶1的比例配制成所需的蛋白提取液，裂解細(xì)胞15 min后收集所有液體在4 ℃離心機(jī)中離心20 min，轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白液和上樣緩沖液按照比例混合，于100 ℃變性10 min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。將蛋白條帶置于5%胎牛血清白蛋白中，在室溫孵育1 h，在4 ℃冰箱孵育一抗過(guò)夜，第2天在室溫孵育相應(yīng)鼠抗或兔抗1 h，使用顯影儀進(jìn)行蛋白條帶顯影。

1

.

2

.

3

MTT檢測(cè) 細(xì)胞種植于96孔板中，每孔3 000 個(gè)細(xì)胞，100 μl培養(yǎng)液。第2天，用藥物處理細(xì)胞48 h之后，在每個(gè)孔中加入10 μl MTT(5 mg/ml)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。然后吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO溶解結(jié)晶，振蕩10 min混勻，使用酶標(biāo)儀在570 nm和630 nm處測(cè)定吸光度，最終吸光度為兩者差值。細(xì)胞生存率計(jì)算方法：處理組吸光度/對(duì)照組吸光度。

1

.

2

.

4

克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞種植于6孔板中，每孔1 000個(gè)細(xì)胞。第2天，用藥物處理細(xì)胞12 h后換成正常培養(yǎng)基，之后每隔2～3 d換1次培養(yǎng)液，并于顯微鏡下觀察，直到形成50個(gè)細(xì)胞左右的細(xì)胞團(tuán)。吸棄培養(yǎng)基，加入1 ml 4%多聚甲醛固定10 min。然后吸棄多聚甲醛，加入1 ml 0.1%結(jié)晶紫染色15 min，拍照，使用Image-J軟件計(jì)數(shù)。

1

.

2

.

5

細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用藥物處理6孔板中的細(xì)胞48 h后，消化，離心收集細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，將5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI分別加入每一個(gè)流式管中，在室溫避光孵育15 min。然后，使用CytoFLEX 流式細(xì)胞儀在1 h內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 七葉皂苷鈉對(duì)HCC細(xì)胞自噬流的促進(jìn)作用

根據(jù)先前的研究結(jié)果，確定了七葉皂苷鈉的濃度為40 μmol/L。在其處理3種細(xì)胞系(Huh7、HepG2和Hep3B)24 h后，Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，七葉皂苷鈉上調(diào)了LC3B蛋白的表達(dá)水平(圖1)。另外，當(dāng)七葉皂苷鈉和氯喹聯(lián)合使用12 h后，聯(lián)合處理組的LC3B蛋白表達(dá)量高于七葉皂苷鈉和氯喹單獨(dú)處理組(圖2)。

圖1 七葉皂苷鈉處理細(xì)胞24 h后LC3B蛋白表達(dá)量Con：對(duì)照組；SA：七葉皂苷鈉處理組，濃度為40 μmol/L

圖2 七葉皂苷鈉和氯喹聯(lián)合用藥12 h后LC3B蛋白表達(dá)量

2.2 七葉皂苷鈉對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用

七葉皂苷鈉抑制了Huh7和HepG2細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路。Western blot結(jié)果表明，七葉皂苷鈉抑制了PI3K以及AKT的表達(dá)。此外，七葉皂苷鈉還下調(diào)了蛋白4EBP1的表達(dá)并抑制了其磷酸化水平(圖3)。

圖3 七葉皂苷鈉處理細(xì)胞48 h后PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)量Con：對(duì)照組；SA：七葉皂苷鈉處理組，濃度為40 μmol/L

2.3 氯喹對(duì)七葉皂苷鈉抗腫瘤效果的增強(qiáng)作用

在HCC細(xì)胞系(Huh7、HepG2和Hep3B)中，七葉皂苷鈉和氯喹聯(lián)合應(yīng)用48 h后，與對(duì)照組或者單獨(dú)用藥相比，細(xì)胞生存率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3種細(xì)胞系中，

F

值分別為711.90、63.89和146.30，

P

<0.05)(圖4)。此外，聯(lián)合用藥48 h后，Huh7[

F

=17.33；七葉皂苷鈉

vs

聯(lián)合用藥：(5.52±2.33)%

vs

(13.53±3.19)%，

P

=0.006 7]和HepG2[

F

=158.00；七葉皂苷鈉

vs

聯(lián)合用藥：(31.15±3.56)%

vs

(51.76±2.51)%，

P

<0.001]細(xì)胞的早期凋亡率增加(圖5)。同時(shí)，七葉皂苷鈉和氯喹聯(lián)合處理細(xì)胞12 h后，Huh7[

F

=1 789.00；七葉皂苷鈉

vs

聯(lián)合用藥：(71.00±3.61)

vs

(9.00±3.61)，

P

<0.001]和HepG2[

F

=1 731.00；七葉皂苷鈉

vs

聯(lián)合用藥：(225.30±22.19)

vs

(95.00±9.17)，

P

<0.001]的細(xì)胞克隆數(shù)減少(圖6)。

圖4 藥物處理48 h后MTT檢測(cè)結(jié)果

圖5 藥物處理48 h后細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

圖6 藥物處理12 h后細(xì)胞克隆形成能力測(cè)定結(jié)果

3 討論

LC3B-II蛋白是自噬小體形成的一個(gè)重要標(biāo)志，主要是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的LC3B-I蛋白與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合而形成。在該研究中，七葉皂苷鈉作用后的HCC細(xì)胞，LC3B-II蛋白的表達(dá)水平明顯增加，間接表明七葉皂苷鈉可以誘導(dǎo)HCC細(xì)胞產(chǎn)生大量的自噬小體。而自噬小體的大量增加一般有兩個(gè)原因，一是因?yàn)樽允闪鞯姆纸膺^(guò)程被阻斷，自噬小體不能被降解，沉積在細(xì)胞內(nèi)；另一個(gè)原因是自噬流增加，自噬小體的合成增加了。當(dāng)氯喹被使用去抑制自噬流的分解過(guò)程時(shí)，七葉皂苷鈉誘導(dǎo)形成的LC3B-II蛋白表達(dá)量反而比單獨(dú)用藥時(shí)更高，表明自噬小體的增加是由于它的合成增加，而不是自噬小體的降解被抑制。因此，綜合這些研究結(jié)果可以證實(shí)七葉皂苷鈉確實(shí)能夠誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的自噬流。

至于具體的分子機(jī)制，該研究表明七葉皂苷鈉可以下調(diào)PI3K和AKT蛋白，而且mTOR的下游蛋白4EBP1的磷酸化也被抑制了。通過(guò)這個(gè)結(jié)果，可以推測(cè)七葉皂苷鈉抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路，并且也抑制了mTOR蛋白的表達(dá)，因此，其促進(jìn)了HCC細(xì)胞的自噬流。

盡管已經(jīng)證實(shí)七葉皂苷鈉確實(shí)促進(jìn)了HCC細(xì)胞的自噬流，但是這個(gè)上調(diào)的自噬流在HCC細(xì)胞中所起的作用以及對(duì)七葉皂苷鈉的影響還不是很明確。從目前已知的情況來(lái)看，自噬在HCC中所發(fā)揮的作用是十分復(fù)雜多變的。它能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)衰老的細(xì)胞器，錯(cuò)誤折疊的蛋白等降解成小分子物質(zhì)(核苷、氨基酸、脂肪酸等)，這樣既可以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，也可以為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以從這個(gè)角度來(lái)看，它可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，幫助癌細(xì)胞在一些應(yīng)激環(huán)境下生存，甚至適應(yīng)這些環(huán)境。然而另一方面，自噬能夠通過(guò)抑制HCC細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)來(lái)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并且自噬介導(dǎo)的自噬性細(xì)胞死亡也是殺傷癌細(xì)胞的一種方式，一些研究表明促進(jìn)自噬流可以延緩HCC的發(fā)展，而抑制自噬流則有利于HCC的發(fā)展。

為了弄清楚七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的自噬流對(duì)HCC細(xì)胞的影響，氯喹被用來(lái)抑制HCC細(xì)胞的自噬流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)自噬流被抑制時(shí)，七葉皂苷鈉可以進(jìn)一步降低癌細(xì)胞的生存率，促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡，抑制細(xì)胞克隆形成能力。這些發(fā)現(xiàn)表明抑制自噬可以增強(qiáng)七葉皂苷鈉的作用效果，也就是說(shuō)七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的自噬是保護(hù)性的。當(dāng)七葉皂苷鈉殺傷癌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多的自噬流，為其自身提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持生長(zhǎng)，保護(hù)細(xì)胞，在一定程度上抵消了藥物的作用效果。因此，當(dāng)HCC細(xì)胞的自噬流被氯喹阻斷時(shí)，癌細(xì)胞失去了這個(gè)保護(hù)作用，導(dǎo)致七葉皂苷鈉的抗腫瘤效果變強(qiáng)了。

綜上所述，七葉皂苷鈉可以增加HCC的自噬流，并且通過(guò)阻斷自噬流，可以增強(qiáng)七葉皂苷鈉的作用效果。