FoxO1蛋白在癌細(xì)胞質(zhì)中的差異表達(dá)及其功能研究

陳 潔，耿慧武，王鳳杰，陳姝文，劉曉穎，范曉云

叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型1(forkhead-box O class 1, FoxO1)是叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead-box class O, FoxOs)超家族中的一員，哺乳動物FoxOs超家族包含了FoxO1、FoxO3A、FoxO4等4名成員。已知的FoxOs家族成員的功能包括參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、分化、凋亡、氧化應(yīng)激、代謝、炎癥、衰老及腫瘤抑制等。FoxO1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)參與糖代謝、脂肪代謝等相關(guān)的疾病，此外，已有研究表明，F(xiàn)oxO1參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，F(xiàn)oxO1在某些種類的腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如乳腺癌、子宮頸癌、腎癌、前列腺癌等。然而，有研究指出了FoxO1在其他一些類型腫瘤中高表達(dá)，如膀胱癌。因此，F(xiàn)oxO1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中是否發(fā)揮不同作用值得探究。該研究對肺癌和食管癌及其相應(yīng)的癌旁組織制作成的組織芯片(tissue microarray, TMA)進(jìn)行免疫組化染色，探究FoxO1在肺癌和食管癌組織中的差異表達(dá)、具體亞細(xì)胞定位及相關(guān)影響因素；進(jìn)一步在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和食管癌細(xì)胞系Eca109中進(jìn)行FoxO1的siRNA敲低及后續(xù)的克隆形成實驗，初步探索FoxO1在肺癌和食管癌中的功能，了解FoxO1蛋白的亞細(xì)胞定位與腫瘤發(fā)生的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

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病例資料 收集2013—2015年在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的非小細(xì)胞肺癌組織及對應(yīng)癌旁組織110例。收集2018—2019年在該院經(jīng)病理確診的食管癌組織樣本及相應(yīng)的癌旁組織48例。上述所有患者均未接受放化療或靶向治療。每位患者簽署了知情同意書。肺癌樣本中，鱗癌組織48例，腺癌組織62例。男性74例，女性36例，年齡48～73歲，中位年齡61歲。食管癌樣本全部為鱗癌，男性38例，女性10例，年齡42～82歲，中位年齡66歲。

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主要試劑 胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基購自美國GE公司；胰酶細(xì)胞消化液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FoxO1抗體購自武漢Proteintech公司(18529-1-AP)；Lipofectamine RNAi MAX購自美國Thermo Fischer Scientific公司；細(xì)胞總mRNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司；二甲苯(AR)、無水乙醇(AR)和30% HO(AR)購自上海國藥集團(tuán)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

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主要儀器 生物安全柜(BSC-2，新加坡ESCO公司)；微量核酸濃度檢測儀(NanoDrop，美國Thermo Fischer公司)；自動組織包埋機(jī)(HistoCroe Arcadia H&C，德國徠卡公司)；全自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2255，德國徠卡公司)；光學(xué)顯微鏡(CX21，日本尼康公司)。

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細(xì)胞株 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和食管癌細(xì)胞系Eca109購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 實驗方法

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細(xì)胞培養(yǎng) A549和Eca109復(fù)蘇后，分別用含10%血清的DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞生長達(dá)80%～90%時傳代。

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siRNA knockdown實驗 將細(xì)胞用胰酶消化離心后重懸，按合適密度接種至適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)板中，次日細(xì)胞匯合度約50%。用Opti-MEM分別稀釋siRNA和Lipofectamine RNAi MAX，靜置5 min后，將兩者等體積溫和混勻，靜置20 min后加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，6 h后更換不含抗生素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。FoxO1 siRNA序列見表1。

表1 FoxO1 siRNA序列

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Western blot實驗 棄去6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，棄盡殘液，加入50～80 μl細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min，轉(zhuǎn)移裂解液至1.5 ml離心管，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。配制12% SDS-PAGE凝膠，每泳道上樣30 μg總蛋白，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌后加入一抗置4 ℃冰箱孵育過夜。次日TBST洗滌后加入二抗孵育，再經(jīng)TBST洗滌后進(jìn)行ECL顯影。

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qRT

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PCR實驗 棄去12孔板細(xì)胞培養(yǎng)液，之后按試劑盒說明書提取細(xì)胞總mRNA。微量核酸濃度檢測儀測定mRNA濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應(yīng)體積20 μl，反應(yīng)條件為：95 ℃初始變性3 min、95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，32次循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2法計算FoxO1與內(nèi)參比值的相對表達(dá)量。FoxO1 qRT-PCR引物序列見表2。

表2 FoxO1 qRT-PCR引物序列

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免疫組化 組織芯片置于二甲苯中脫蠟15 min×2次，取出玻片，依次放入無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇和蒸餾水中，每次3 min。采用枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，微波爐中高火加熱至沸騰開始計時7 min，暫停1 min后繼續(xù)加熱至沸騰5 min，自然冷卻至室溫。將玻片放置濕盒內(nèi)，PBS清洗后滴加3% HO溶液完全覆蓋整個組織，室溫反應(yīng)30 min，PBS洗滌3 min×3次，滴加一抗完全覆蓋整個組織，置4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。次日恢復(fù)至室溫，PBS洗滌3 min×3次，滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌3 min×3次，顯微鏡下進(jìn)行DAB染色，蒸餾水終止反應(yīng)。加入蘇木精染液中染色2 min，1%鹽酸乙醇分化、0.01 mol/L碳酸鋰藍(lán)化后烘干，二甲苯透明，滴加中性樹脂封片，固定后顯微鏡下觀察。根據(jù)染色強(qiáng)弱，對染色結(jié)果分別評分為0～3分。0分，細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無棕色染色；1分，細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)有淡黃色染色；2分，細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)有中等棕色染色；3分，細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)有棕褐色染色。根據(jù)染色腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的比例，分別評分為1～4分。1分，0%<染色細(xì)胞占比≤25%；2分，25%<染色細(xì)胞占比≤50%；3分，50%<染色細(xì)胞占比≤75%；4分，染色細(xì)胞占比>75%。綜合評分=染色評分×占比評分。綜合評分>3分為陽性，綜合評分>6分為高表達(dá)，3≤綜合評分≤6分為低表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對該實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，率的比較采用χ檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗。所有實驗數(shù)據(jù)資料均保留小數(shù)點后3位，

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<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FoxO1在肺癌組織細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)情況

肺癌組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在正常呼吸性支氣管上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)；在腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。比較FoxO1在癌組織及對應(yīng)癌旁組織細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在肺鱗癌組中，癌組織FoxO1表達(dá)高于癌旁的有38例，低表達(dá)的有10例，占比分別為79.17%和20.83%；癌旁組織中高表達(dá)的有12例，低表達(dá)的有36例，占比分別為25.00%和75.00%。在肺腺癌組中，癌組織細(xì)胞質(zhì)中FoxO1高表達(dá)的有43例，低表達(dá)的有19例，占比分別為69.35%和30.65%；癌旁組織細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)的有20例，低表達(dá)的有42例，占比分別為32.26%和67.74%。χ檢驗比較肺鱗癌組和腺癌組FoxO1細(xì)胞質(zhì)高、低表達(dá)占比情況，結(jié)果表明兩種類型的腫瘤間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ=1.342，

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=0.247)。見圖1。

圖1 FoxO1在肺鱗癌、肺腺癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)

2.2 FoxO1在肺癌組織細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)與臨床各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

FoxO1在肺癌組織細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的免疫組化評分與臨床各指標(biāo)間的相關(guān)性分析表明，細(xì)胞質(zhì)中FoxO1的表達(dá)與性別、年齡、分化程度、侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3、4。

表3 FoxO1在肺癌組織細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的免疫組化評分與臨床各指標(biāo)間的相關(guān)性

表4 性別及組織類型對肺癌組織細(xì)胞質(zhì)中FoxO1表達(dá)的影響[n(%)]

2.3 FoxO1在食管癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，在食管癌癌旁組織中，F(xiàn)oxO1主要表達(dá)在基底層和上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較低或不表達(dá)，見圖2；在癌組織中，F(xiàn)oxO1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中表達(dá)減少或不表達(dá)，其表達(dá)與正常細(xì)胞中的定位有顯著差異。癌旁組織樣本中陽性表達(dá)17例，陰性表達(dá)31例；癌組織中陽性表達(dá)41例，陰性表達(dá)7例，癌組織中陽性率高于癌旁組織(χ=15.875，

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<0.01)。癌旁組織樣本中高表達(dá)9例，低表達(dá)39例；癌組織中高表達(dá)28例，低表達(dá)20例，癌組織中陽性率高于癌旁組織(χ=25.089，

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<0.01)。

圖2 FoxO1在食管癌癌旁和癌組織中的表達(dá) A：癌旁組織；B：癌組織;原圖 ×40；局部圖 ×400

2.4 FoxO1在食管癌組織細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)與臨床各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

該實驗對FoxO1在食管癌組織中的免疫組化評分與臨床各指標(biāo)間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO1的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

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<0.05)，而與性別、年齡、是否吸煙、是否飲酒、分化程度、侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期以及是否有其他消化系統(tǒng)疾病差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表5、6。

表5 FoxO1在食管癌組織中的免疫組化評分與臨床各指標(biāo)間的相關(guān)性

表6 性別及伴有其他消化系統(tǒng)疾病對食管癌FoxO1免疫組化評判的影響[n(%)]

2.5 FoxO1在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和食管癌細(xì)胞系Eca109中的表達(dá)及定位

為了驗證腫瘤細(xì)胞系中FoxO1的表達(dá)是否與組織中的表達(dá)一致，該實驗選擇常用的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(圖3A～C)和食管癌細(xì)胞系Eca109(圖3D～F)中進(jìn)行FoxO1的內(nèi)源性免疫熒光實驗，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。顯微圖像顯示，在上述兩種細(xì)胞系中，F(xiàn)oxO1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均呈彌散分布，但細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)水平顯著高于細(xì)胞核(

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<0.01)，結(jié)果與組織中的免疫組化結(jié)果一致。

圖3 FoxO1在A549和Eca109細(xì)胞中的定位 ×400

2.6 FoxO1 siRNA對A549和Eca109細(xì)胞中FoxO1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的影響

為了進(jìn)一步了解FoxO1在腫瘤細(xì)胞中的功能，該實驗使用siRNA干擾技術(shù)敲低A549和Eca109細(xì)胞的FoxO1的表達(dá)。Western blot檢測轉(zhuǎn)染FoxO1 siRNA后A549和Eca109細(xì)胞中FoxO1蛋白表達(dá)水平(圖4A～D)；提取細(xì)胞總mRNA，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染FoxO1 siRNA后A549和Eca109細(xì)胞中FoxO1 mRNA表達(dá)水平(圖4E、F)。結(jié)果顯示，在成功轉(zhuǎn)染siRNA后，細(xì)胞內(nèi)FoxO1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯受到抑制(

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<0.01)。

圖4 FoxO1 siRNA knockdown后FoxO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測

2.7 A549和Eca109細(xì)胞系中FoxO1的敲低對細(xì)胞增殖的影響

為了探索FoxO1能否影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力，該實驗在A549細(xì)胞系(圖5A)和Eca109細(xì)胞系(圖5B)中瞬時轉(zhuǎn)染FoxO1 siRNA，隨后進(jìn)行相應(yīng)的克隆形成實驗。實驗結(jié)果顯示，在上述兩種細(xì)胞系中，F(xiàn)oxO1敲低組相對于陰性對照組的細(xì)胞克隆數(shù)明顯降低(

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<0.01)，提示FoxO1的敲低抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖5 A549和Eca109細(xì)胞系FoxO1 的siRNA敲低抑制細(xì)胞增殖A：A549細(xì)胞系；B：Eca109細(xì)胞系；1：陰性對照組；2～4：3個siRNA敲低組

3 討論

在早期階段，采用免疫組化實驗研究蛋白分子在組織中的表達(dá)時，各樣本組織貼附在多張載玻片上，在DAB顯色操作時，各標(biāo)本顯色時間不易控制在相同時間，造成最終的組織顯色存在誤差，對染色結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。近年來，利用組織芯片技術(shù)將多個樣本組織貼附在同一張載玻片上制作成組織芯片，隨后進(jìn)行免疫組化實驗，可有效避免顯色時間差異的弊端，各組織樣本間的差異性得到可靠體現(xiàn)。

該研究利用肺癌和食管癌組織芯片，使用兔FoxO1多克隆抗體檢測肺癌和食管癌組織細(xì)胞質(zhì)中FoxO1的表達(dá)情況，根據(jù)染色強(qiáng)弱和陽性細(xì)胞率形成綜合評分并與臨床病理多個指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。該實驗的免疫組化結(jié)果顯示，在正常支氣管上皮細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)；在肺癌細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。在正常食管上皮細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1主要表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)中不表達(dá)或低表達(dá)；在食管癌細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1主要表達(dá)在胞質(zhì)中。可見，F(xiàn)oxO1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)分布發(fā)生了明顯的改變，即在細(xì)胞核中表達(dá)減少，而更多地發(fā)生了細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。通過內(nèi)源性免疫熒光實驗，可以清晰觀察到，F(xiàn)oxO1在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和食管癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞核中的表達(dá)顯著低于細(xì)胞質(zhì)。在缺乏外界應(yīng)激刺激因子、存活因子或生長因子時，F(xiàn)oxO1定位在細(xì)胞核中并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性。而在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT信號通路被組成性激活，隨后AKT磷酸化FoxO1，進(jìn)而促進(jìn)FoxO1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中失去轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。用PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002和MAPK/ERK信號通路特異性抑制劑UO126分別處理A549細(xì)胞，均可導(dǎo)致FoxO1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，進(jìn)而能夠抑制細(xì)胞增殖。因此，該結(jié)果提示，F(xiàn)oxO1在細(xì)胞核中發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。隨后進(jìn)行的siRNA敲低及相應(yīng)克隆形成實驗表明，細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)FoxO1的A549和Eca109細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1的敲低能夠抑制細(xì)胞增殖，結(jié)合免疫組化結(jié)果即腫瘤組織細(xì)胞質(zhì)中FoxO1普遍高表達(dá)，提示腫瘤細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)的FoxO1可能發(fā)揮促癌作用。

FoxO1蛋白的表達(dá)和活性受到轉(zhuǎn)錄與翻譯以及翻譯后的乙?；⒘姿峄蚍核鼗揎椀亩嘀卣{(diào)節(jié)。鑒于FoxO1在細(xì)胞內(nèi)的不同定位、作用及其自身活性調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的確切作用機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。