630 nm LED照射阻滯STAT1核轉位抑制M1型巨噬細胞極化

潘 越，宋武琦，張鳳民，劉海亮

（哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學微生物學教研室，哈爾濱醫(yī)科大學伍連德研究所，哈爾濱 150081）

關鍵字：發(fā)光二極管；M1型巨噬細胞極化；單核細胞；STAT1；核轉位

巨噬細胞（macrophage）作為天然免疫中最有效的細胞類型之一，可以調節(jié)宿主防御和體內炎癥反應平衡［1］。其具有強大的細胞吞噬、抗原呈遞和分泌細胞因子的能力，可控制先天性免疫和適應性免疫的起始和消退［2］。針對不同的局部微環(huán)境，靜息巨噬細胞（M0型）可以極化為經(jīng)典活化型巨噬細胞（M1型）和替代活化型巨噬細胞（M2型）［3］。M1型巨噬細胞是抵抗細胞內病原體和抑制腫瘤生長的關鍵效應細胞，M2型巨噬細胞與免疫抑制、促進組織重塑和腫瘤進展有關［4-6］。M1/M2型巨噬細胞比例的精確調節(jié)可以改變組織內的微環(huán)境，在自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病和腫瘤中發(fā)揮重要作用，并且對疾病的預后及轉歸起關鍵性作用。調控巨噬細胞極化是藥物治療的重要手段，因此調控巨噬細胞極化的分子可作為治療巨噬細胞極化相關疾病的重要靶點［7］。許多轉錄因子在調控巨噬細胞極化中起重要作用，如干擾素調節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）、核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）、信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等［8］。Jiang等［9］報道了T細胞 Ig黏蛋白3（T cell Ig mucin-3 ，TIM-3）可通過Y256和Y263殘基與 JAK競爭結合STAT1，抑制STAT1的磷酸化和核轉位，從而抑制巨噬細胞中的STAT1-miR-155信號軸，促進巨噬細胞極化為 M2 表型。Ding等［10］發(fā)現(xiàn)，酸棗仁甙D能抑制STAT1的激活和核轉位，同時增強STAT6的核轉位，促進巨噬細胞向M2型轉化，從而調節(jié)巨噬細胞M1/M2極化。這些研究發(fā)現(xiàn)了STAT1 在調控巨噬細胞極化中起關鍵作用，為治療相關疾病提供了科學有效的解決方案。

光生物調節(jié)（photobiomodulation，PBM）是一個發(fā)展較快的生物醫(yī)學研究領域，如使用低功率密度的紅光或近紅外光能對細胞或組織產(chǎn)生有益影響［11］。與傳統(tǒng)的激光光源療法相比，發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）光療法的優(yōu)勢在于可以提供大型平面陣列照射大面積身體區(qū)域［12］。除此之外，LED與激光相比還具有發(fā)光波長涵蓋范圍廣、光轉換效率高、可以以脈沖的形式輸出、操作便利、使用成本低、安全、可靠、適宜進行專用的醫(yī)學設計等優(yōu)點。鑒于這些特點，LED在醫(yī)療應用和光生物調節(jié)中得到了迅速發(fā)展。LED光療已被證實在多種臨床適應癥中均有效，如減輕疼痛、促進傷口愈合、嫩膚、緩解過敏性鼻炎等［12］。Cheong等［13］報道了850 nm LED照射能夠抑制T細胞誘導的細胞因子表達。Kim等［14］證明了633 nm LED照射會增加I型前膠原的合成，并降低皮膚成纖維細胞中基質金屬蛋白酶的表達。本課題組前期研究結果證實，630 nm LED照射可能通過TRPV4/PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制人滑膜細胞的增殖［15］，同時，630 nm LED照射能抑制巨噬細胞產(chǎn)生促炎癥因子，從而發(fā)揮抗炎作用［16］。然而，630 nm LED照射對于巨噬細胞極化的作用及其機制尚未報道，故本研究對630 nm LED照射對人髓系白血病單核細胞（human acute monocytic leukemia，THP-1）來源的M1型巨噬細胞極化的影響進行評價，探討其對M1型巨噬細胞極化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及630 nm LED照射處理

將THP-1培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco，USA）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco，USA）中，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。THP-1細胞于100 nmol/L佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA，Solaribio，中國北京）中孵育24.0 h，將其分化為巨噬細胞（M0型），更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24.0 h。用20 ng/mL干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ，peprotech，USA）和100 ng/mL 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，Sigma，USA）刺激M0型巨噬細胞18.0 h，使其極化為M1型。LED照射組在誘導極化的第14小時對細胞進行630 nm LED照射，每2.0 h照射1次，每次10 min，共照射3次。本研究使用的630 nm LED 照射燈板由北京創(chuàng)盈光電科技有限公司研制。

1.2 細胞活性測定（MTT、CCK-8、LDH）

THP-1細胞以1×104個/孔接種在96孔板中，根據(jù)試驗條件培養(yǎng)細胞和LED照射處理后，在每孔中加入20 μL 4 mg/mL的噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液，37℃孵育3.5 h后棄掉培養(yǎng)基，每孔中加入200 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）37℃ 孵育30 min，在波長為570 nm處測量吸光度。細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細胞活性，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4.0 h，在波長為450 nm處測量吸光度。乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性檢測參照試劑盒說明書操作（Solarbio, 中國北京），在波長為450 nm處測量吸光度。

1.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

收集照射后的細胞，用Trizol法（Invitrogen，USA）提取細胞的總RNA，用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（康為世紀，中國）逆轉錄2 μg總RNA，反應體系和反應程序參照試劑盒說明書。用ChamQ Universal SYBR qPCR Mix（諾唯贊生物，中國）和引物（10 μmol/L，庫美生物，中國）進行擴增反應。以β-actin為參照基因進行歸一化，采用閾值循環(huán)法計算目的基因的表達量。實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試驗數(shù)據(jù)中各基因在各樣本組細胞中的表達量用循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）表示，采用 2-ΔΔCT法表示 LED 照射組與對照組目的基因mRNA的相對表達量，引物序列如表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 The primer sequences of RT-qPCR

1.4 蛋白質提取和免疫印跡分析

收集照射后的細胞，用細胞核漿蛋白提取試劑盒（Solarbio，中國）分離細胞核和漿蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，中國）進行蛋白濃度測定后，將樣品置于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠上分離，然后轉移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）上轉膜（300 mA 恒流，1.5 h），5%脫脂牛奶封閉1.0 h，抗體4℃過夜。主要抗體為STAT1（Cell Signal Technology，USA）、Histone H3（Cell Signal Technology，USA）、GAPDH（Cell Signal Technology，USA），抗體稀釋倍數(shù)均為1∶1 000，一抗孵育后用Tris-HCl緩沖液（Tris-buffered saline tween，TBST）洗膜3次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1.0 h，TBST洗膜3次后加入電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑顯色（Affinity，中國），進行凝膠顯影成像。

1.5 細胞免疫熒光

試驗前準備封閉緩沖液（1×PBS/5% BSA/0.3%Triton X-100）和抗體稀釋緩沖液（1×PBS/1%BSA/0.3% Triton X-100）。細胞經(jīng)LED照射處理后，用預冷的4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，在封閉緩沖液中封閉1.0 h，吸去封閉緩沖液，加入用抗體稀釋緩沖液稀釋的一抗STAT1（1:200），4℃孵育過夜。用PBS 漂洗3次，用抗體稀釋緩沖液稀釋熒光二抗（1∶100，F(xiàn)ITC Goat Anti-Rabbit IgG，ABclonal，中國），室溫下避光孵育標本1.0 h，PBS 漂洗3次，用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）染核10 min，PBS漂洗3次后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 630 nm LED照射對THP-1來源的M1型巨噬細胞活性的影響

為確定630 nm LED照射對于THP-1來源的M1型巨噬細胞活性的影響，我們分別采用CCK-8、MTT、LDH法對細胞活性進行測定。圖1a為試驗照射過程。圖1b～1d結果顯示，與對照組相比，630 nm LED照射（40.02 mW/cm2）對細胞活性無顯著影響［所有試驗重復3次，結果以均數(shù)±標準誤（n=3）表示］。因此，在不影響巨噬細胞活性的條件下，后續(xù)試驗均采用此照射條件探討LED對巨噬細胞極化的作用。

圖1 630 nm LED照射對THP-1來源的M1型巨噬細胞活性的影響Fig.1 Effects of 630 nm LED on THP-1-derived M1 macrophages viability

2.2 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞相關因子的mRNA表達

RT-qPCR法檢測630 nm LED照射對M1型巨噬細胞相關基因表達的影響。圖2結果顯示，M1組的CD80、白介素6（interleukin 6，IL-6）、白介素23（Interleukin 23，IL-23）、干擾素調節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）、趨化因子配體9（C-X-C motif chemokine ligand ，CXCL9）、CXCL10、CXCL11明顯高于M0組，表明M0巨噬細胞經(jīng)LPS和干擾素作用18.0 h后已極化為M1型巨噬細胞（****P＜0.000 1）。圖2a～2d顯示，LED照射處理組中CD80、白介素1β（interleukin 1，IL-1β）、IL-6、IL-23的 mRNA表達與對照組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。圖2e～2h結果顯示，LED照射處理組中IRF5、CXCL9、CXCL10、CXCL11mRNA的表達較M1對照組顯著降低（*P＜0.05，**P＜0.01）。結果表明，630 nm LED照射可抑制M1型巨噬細胞的極化。

圖2 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞相關基因mRNA的表達Fig.2 630 nm LED irradiation inhibits M1 macrophage-related mRNA expression

2.3 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞核蛋白中STAT1蛋白的表達

在巨噬細胞中，STAT1轉位至細胞核，從而與DNA結合促進巨噬細胞向M1型極化。本研究從M0、M1、M1+LED三組細胞中提取總蛋白，用免疫印跡法檢測巨噬細胞總STAT1的蛋白水平。如圖3a所示，M1組與M0組相比，巨噬細胞總蛋白中STAT1水平升高，而照射處理組與M1組STAT1沒有顯著差異（**P＜0.01）。將三組細胞進行核漿蛋白分離，以GAPDH和Histone分別作為漿蛋白和核蛋白的內參，用免疫印跡法進一步檢測M1型巨噬細胞核漿蛋白中STAT1的表達水平。如圖3b所示，M1組巨噬細胞核蛋白中的STAT1較M0組其相對表達量明顯升高，而經(jīng)630 nm LED照射處理后，核蛋白中STAT1的相對表達量降低（圖3b中左側的三組）（*P＜0.05，***P＜0.001）。在LED照射處理組中，漿蛋白STAT1的表達量與M1組相比無統(tǒng)計學意義（圖3b中右側的三組）。結果表明，630 nm LED光照不影響巨噬細胞總STAT1的表達水平，但可抑制巨噬細胞中STAT1向核內轉移。

圖3 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞核蛋白中STAT1蛋白表達Fig.3 630 nm LED irradiation inhibits nuclear STAT1 expression in M1 macrophages

2.4 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞中STAT1向核內轉移

免疫熒光檢測結果顯示，未用LPS和IFN-γ刺激的M0組STAT1蛋白大部分表達在胞漿中，LPS和IFN-γ刺激后的M1型巨噬細胞STAT1 大部分入核，而經(jīng)630 nm LED照射后STAT1入核減少（圖4）。結果表明，630 nm LED照射可抑制M1型巨噬細胞中STAT1向核內轉移。

圖4 630 nm LED照射抑制THP-1來源巨噬細胞的STAT1向核內轉移Fig.4 630 nm LED irradiation inhibits the intranuclear transfer of STAT1 in THP-1-derived macrophages

3 討論

LED光療因為具有抗炎、鎮(zhèn)痛和愈合傷口的作用，在臨床實踐中被廣泛應用，將適當?shù)?LED光療法作為輔助手段與許多其他手術或非手術方法結合，可達到顯著的治療效果。有研究報道，945 nm LED可誘導IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的基因下調，轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）和精氨酸酶-1（arginase-1，ARG1）的基因上調，表明巨噬細胞極化為M2表型有助于組織修復和炎癥消退［17］。另有研究報道，630 nm LED通過Nrf2和NF-κB信號通路抑制單核/巨噬細胞炎癥和降低細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。因此，LED對于調節(jié)巨噬細胞有重要作用。

在本研究中，我們檢測了630 nm LED對THP-1來源的M1型巨噬細胞活力的影響，結果表明，以40.02 mW/cm2的功率對THP-1來源的M1型巨噬細胞進行單次10 min（24 J/cm2）照射3次不影響其細胞活性。有報道指出，630 nm LED照射超過30.6 J/cm2后，THP-1細胞的存活能力下降［16］?？梢娺x擇正確波長、提供適當?shù)墓夤β拭芏群妥銐虻哪芰棵芏葘τ诰奘杉毎麡O化以及相關疾病的治療十分重要。

M1型巨噬細胞表達CD80、CD86等分子可通過分泌多種促炎癥因子（如IL-6、IL-23、IL-1β和TNF-α等）以及趨化因子（CXCL9、CXCL10、CXCL11）促進炎癥的發(fā)展，加速細胞外基質降解和細胞凋亡，調節(jié)并促進 Th1 型免疫應答［18］。IRF5作為干擾素調節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）家族的成員具有多種功能，包括激活編碼炎癥細胞因子、I型干擾素（interferon type I，IFN-I）和腫瘤抑制因子的基因，已被定義為 M1 巨噬細胞極化的關鍵轉錄因子［19］。在本研究中，我們檢測了M1型巨噬細胞的相關基因表達，發(fā)現(xiàn)經(jīng)630 nm LED照射后，IRF5、CXCL9、CXCL10、CXCL11mRNA的相對表達較M1對照組顯著降低。有研究報道，810 nm PBM 抑制了經(jīng)典活化巨噬細胞的標志物，減少了促炎細胞因子包括TNF-α和IL-1βmRNA的表達和分泌，除此之外，PBM可顯著降低經(jīng)典激活的骨髓來源的巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）中NF-κB p65的表達和磷酸化，表明PBM可以成功調節(jié)經(jīng)典激活小鼠骨髓來源的巨噬細胞BMDM的炎癥和極化［20］。與之前的研究一致的是，我們的數(shù)據(jù)也證明了630 nm LED照射對于M1型巨噬細胞極化具有顯著的抑制作用。還有研究表明，780 nm和660 nm兩種激光都能夠減少TNF-α和誘導性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的基因的表達，但660 nm 激光會導致IL-6表達和產(chǎn)生的上調［21］，說明不同的光照參數(shù)對于細胞的調節(jié)效應不同。因此，選用正確的參數(shù)，如波長、功率密度、能量密度、照射頻率、操作制度和連續(xù)照射之間的間隔，是實現(xiàn)預期結果的基礎。

巨噬細胞極化受多種轉錄因子的影響，JAK激活的STAT蛋白家族成員是調控巨噬細胞 M1/M2 極化的關鍵轉錄因子［22］。通過刺激IFN-γ受體觸發(fā)JAK介導的酪氨酸磷酸化和STAT1二聚化，STAT1以同源二聚體的形式遷移到細胞核，與編碼iNOS、MHC II類反式激活因子（MHC class IItransactivator，CIITA）和IL-12等基因的啟動子中的順式元件γ激活序列結合，調節(jié)M1巨噬細胞的極化［23］。雖然LED療法在臨床上治療疾病中的應用顯著增多，但對光照射的作用機制，特別是紅光照射對預防和治療巨噬細胞極化相關疾病的作用機制研究較少。為了闡明其相關機制，我們研究了630 nm LED照射對于經(jīng)典巨噬細胞極化的轉錄因子STAT1的影響。與對照組相比，M1+LED組巨噬細胞中總STAT1的相對表達量沒有顯著變化，但核蛋白中STAT1經(jīng)照射處理后的相對表達量較M1組顯著降低。與免疫印跡結果一致的是，細胞免疫熒光結果顯示，630 nm照射處理后STAT1入核減少。抑制STAT1入核是調控巨噬細胞極化的重要因素。如TIM-3通過Y256和Y263殘基與JAK 競爭結合STAT1，可抑制 STAT1 磷酸化和核轉位，從而抑制巨噬細胞中的STAT1-miR-155信號軸，促進巨噬細胞極化為M2 表型［10］。新色胺S5通過降低促炎細胞因子、下調NF-κB和STAT1信號顯著抑制M1樣巨噬細胞的極化［24］。然而，巨噬細胞極化的機制復雜，630 nm LED調節(jié)巨噬細胞極化的其他分子機制還需進一步研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)630 nm LED照射可通過抑制STAT1核轉位對M1型巨噬細胞極化產(chǎn)生抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)可能對治療巨噬細胞極化相關疾病提供治療策略。