血卟啉單甲醚介導(dǎo)的光動力抗微生物化療法對牙齦卟啉單胞菌體外殺菌效果的研究

欒小敏，路海艷，武笑影，齊 峰，畢良佳

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院口腔科，哈爾濱 150001）

牙周炎是指發(fā)生在牙齒支持組織上的慢性感染性疾病，不僅會造成牙槽骨吸收、牙齒松動脫落，影響進(jìn)食與美觀，還會對我們身體其他的器官造成極大的危害，與心腦血管病、肺炎、胃炎、胃潰瘍等疾病密切相關(guān)。孕婦若患重度牙周炎，還會導(dǎo)致早產(chǎn)及低出生體重兒［1-2］。革蘭陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）被認(rèn)為是主要的牙周致病菌。許多研究指出，牙齦卟啉單胞菌能夠誘導(dǎo)大量吞噬細(xì)胞聚集，在吞噬細(xì)菌的同時引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙周結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收，加劇牙周組織破壞的進(jìn)程［3］。

牙周炎的傳統(tǒng)治療方法是牙周刮治和輔助全身、局部藥物療法。然而牙周刮治器械無法到達(dá)較深且形態(tài)復(fù)雜的牙周袋及病變的根分叉處，菌斑無法完全清除，同時牙周袋深部的細(xì)菌沉積和牙周組織中的內(nèi)毒素會影響治療效果?；颊咝枰磸?fù)就診，過程繁瑣復(fù)雜，在機(jī)械治療的基礎(chǔ)上，如果效果不佳需要使用手術(shù)輔助治療，則會增加患者手術(shù)創(chuàng)傷及疼痛，引發(fā)術(shù)后不適，產(chǎn)生心理壓力，導(dǎo)致患者不愿意接受治療［4-5］。臨床上常用全身或局部應(yīng)用抗生素來輔助治療牙周炎，這種方法雖然可以在一定程度上控制細(xì)菌感染，但由于藥物很難在口腔局部微環(huán)境中，尤其是牙周袋內(nèi)長久地維持較高濃度，且細(xì)菌不斷繁殖以及DNA變異以抵抗藥物的殺菌作用易造成細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，長期應(yīng)用，治療效果會逐漸下降，同時藥物還會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一些副作用，如惡心、口干、口腔異味、菌群失調(diào)等［6］。

因此，臨床上迫切需要找到一種有效的、對患者無傷害或傷害較輕的治療牙周炎的新方法。光動力抗微生物化療法（photodynamic antimierobial chemotherapy，PACT）是利用光敏劑和激光導(dǎo)致微生物病原體光動力滅活的一種抗菌方法，目前尚未發(fā)現(xiàn)其耐藥性［7］。卟啉類光敏劑具有良好的光譜特性和較高的單線態(tài)氧產(chǎn)率，且在生物體內(nèi)廣泛存在，代謝途徑明晰，生物相容性好，作為抗菌光敏劑已受到廣泛的研究。血卟啉單甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether，HMME）是一種卟啉類光敏劑，體內(nèi)外試驗(yàn)表明其有較高的選擇性、較強(qiáng)的光敏性、低毒性，應(yīng)用于光動力殺菌、腫瘤治療、消炎等方面［8-9］。張蕾等［10］的研究表明40 mg/L HMME介導(dǎo)的光動力療法可有效殺滅大鼠齲病模型中的變形鏈球菌；鄒朝暉等［11］使用HMME聯(lián)合80 mW激光可有效殺滅離體牙根管中的糞腸球菌；黃青等［12］發(fā)現(xiàn)HMME介導(dǎo)的光動力可有效殺滅牙齦卟啉單胞菌生物膜。HMME用于對口腔牙周致病菌的研究相對較少，因此本試驗(yàn)研究HMME介導(dǎo)的PACT對牙齦卟啉單胞菌的作用效果，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牙齦卟啉單胞菌菌株（ATCC-33277）接種于哥倫比亞血平板，37℃厭氧培養(yǎng)；培養(yǎng)至第二代后，挑取單一菌落用磷酸鹽緩沖液溶液稀釋，調(diào)節(jié)OD600nm值為1（菌液濃度為108個/mL）備用。光敏劑HMME的配置：HMME（先輝醫(yī)藥科技有限公司，上海，中國）粉末固體溶于超純水中，配成1 mg/mL HMME溶液，-20℃冰箱避光保存?zhèn)溆?；試?yàn)時用超純水稀釋至所需濃度密封，4℃避光保存?zhèn)溆?。腦心浸液培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。L7012 LIVE/DEADTMBacLightTM細(xì)菌活力檢測試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司。羥苯基熒光素（hydroxyphenyl-fluorescein，HPF）、單線態(tài)氧熒光綠探針（singlet oxygen sensor green，SOSG）購自天津阿爾法生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測HMME光照下產(chǎn)生的活性氧

在黑色96孔酶標(biāo)板孔中分別加入100 μL 100 μg/mL的HMME，后加入100 μL SOSG/HPF，使其終濃度為10 μmol/L，用移液槍輕吹混勻后分為兩組：無光照組（0 min組）和光照組（10 min組）。無光照組樣本混勻后立即使用熒光分光光度計(jì)（SOSG激發(fā)波長為504 nm，發(fā)射波長為525 nm，HPF激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為515 nm）測量熒光量。光照組使用激光照射10 min后，立即使用熒光分光光度計(jì)（SOSG激發(fā)波長為504 nm，發(fā)射波長為525 nm，HPF激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為515 nm）檢測。

1.2.2 HMME介導(dǎo)的PACT對牙齦卟啉單胞菌的作用

將100 μL牙齦卟啉單胞菌菌懸液加入96孔板中，隨機(jī)分為4組，分別為對照組、光照組、HMME組、PACT組。對照組和光照組加入100 μL 無菌磷酸鹽緩沖液，HMME組與PACT組加入光敏劑HMME溶液（使HMME終質(zhì)量濃度為50 μg/mL），避光孵育90 min，然后使用波長為650 nm的激光（輸出功率為50 mW/cm2）置于96孔板上方垂直照射10 min（光照強(qiáng)度為30 J/cm2）。為了避免激光照射到相鄰的孔，本文采用了黑色不透明的96孔板，樣本間隔操作。各組試驗(yàn)操作結(jié)束后，所有樣本10倍梯度稀釋，取50 μL涂板于哥倫比亞血平板上，恒溫37℃厭氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌存活率。每組3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測

隨機(jī)將細(xì)菌樣本分為3組：對照組、HMME組、PACT組，其中HMME組與PACT組加入100 μL HMME溶液（終濃度為50 μg/mL），對照組加入等量無菌磷酸鹽緩沖液作為對照，避光孵育90 min后，PACT組激光光照10 min。各組結(jié)束后，移液槍吸樣本于1.5 mL離心管中，離心（10 000×g）15 min，棄上清液，加入0.85%無菌氯化鈉溶液，振蕩混勻，重復(fù)操作1次后加入細(xì)菌活力檢測試劑盒中避光染色15 min，混勻后移液槍吸5 μL染色菌液于載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀測活/死細(xì)菌分布。

1.2.4 HMME與牙齦卟啉單胞菌 zeta電位檢測

為了檢測牙齦卟啉單胞菌帶的負(fù)電荷是否影響HMME與其結(jié)合，本研究利用Malvern Nano ZS儀器，使用電泳光散射法檢測HMME與牙齦卟啉單胞菌的zeta電位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將研究所得數(shù)據(jù)錄入SPSS 19.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較不同組別之間的差異。若P＜0.05則差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測HMME光照下產(chǎn)生的活性氧

PACT殺菌機(jī)制為光敏劑在光照射下產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），進(jìn)而殺滅細(xì)菌，因此用分光光度計(jì)檢測HMME產(chǎn)生的ROS。結(jié)果顯示，HMME在光照下主要以SOSG熒光量為主，與不光照組相比，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HPF熒光量差異不顯著（圖1）。

圖1 HMME光激活的ROS試驗(yàn)Fig.1 ROS experiment on photoactivation of HMME

2.2 HMME介導(dǎo)的PACT對牙齦卟啉單胞菌的作用

如圖2所示，當(dāng)HMME的濃度為50 μg/mL時，光照10 min后，PACT組細(xì)菌存活率最低，74.13%的細(xì)菌被殺滅，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。單純光敏劑HMME組有少量細(xì)菌死亡（P＜0.05）。單純光照對細(xì)菌無殺傷作用，與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 HMME介導(dǎo)PACT對牙齦卟啉單胞菌的殺菌效果Fig.2 The bactericidal effect of PACT mediated by HMME on P.gingivalis

2.3 CLSM檢測

通過CLSM觀察對照組、HMME組、PACT組的牙齦卟啉單胞菌死活菌的分布情況，存活牙齦卟啉單胞菌被染發(fā)出綠色熒光，然而細(xì)胞膜破壞的滅活細(xì)菌被染發(fā)紅色熒光，同一視野圖像疊加為橙色。對照組視野下幾乎全顯示綠色熒光，HMME組顯現(xiàn)出少量紅色熒光，說明HMME對牙齦卟啉單胞菌有稍許影響，然而，PACT組顯示幾乎全為紅色熒光，表明HMME-PACT對牙齦卟啉單胞菌處理后，存活細(xì)菌大量減少，幾乎都為死菌（green表示活菌，red表示死菌，merge為疊加圖片）。

圖3 CLSM觀測HMME-PACT處理后牙齦卟啉單胞菌變化Fig.3 CLSM observed the change of P.gingivalis after HMMEPACT

2.4 zeta電位

檢測HMME與牙齦卟啉單胞菌的電位，發(fā)現(xiàn)兩者均表現(xiàn)出較強(qiáng)的zeta負(fù)電位，分別為-11.47 mV和-13.33 mV（圖4）。

圖4 HMME 與 牙齦卟啉單胞菌zeta電位Fig.4 HMME and P.gingivalis zeta potential

3 討論

牙周炎的始動因子是牙菌斑生物膜，其中革蘭厭氧菌牙齦卟啉單胞菌是牙周炎發(fā)生發(fā)展的主要致病菌［13］。通過表達(dá)一系列毒力因子蛋白酶、黏附素、脂多糖等不僅可以直接致病，還可以逃脫宿主免疫反應(yīng)，間接導(dǎo)致牙周炎變加重［14-15］。傳統(tǒng)治療牙周炎的方法是通過齦下刮治、根面平整輔助使用抗生素治療，但由于創(chuàng)傷大、出血多、根分叉及根面解剖變異處器械難以到達(dá)、細(xì)菌耐藥等問題導(dǎo)致其治療效果不佳［10］，因此迫切需要一種新型的牙周炎治療方法。

PACT是光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用，光敏劑是影響PACT療效的重要的元素。HMME是一種新型二代光敏劑［16-17］，相比于其他光敏劑，其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、對正常組織低毒性、避光期相對較短、ROS產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，而且與血卟啉衍生物相比價格便宜（第一代光敏劑）［15］，因此，已被廣泛用于治療腫瘤、感染等各種疾病的研究［18］，是一種用于PACT的非常有前景的光敏劑。

PACT通過激活光敏劑產(chǎn)生ROS殺菌［13］。ROS產(chǎn)生種類很多［19-20］，本試驗(yàn)使用的是ROS熒光分子探針SOSG和HPF，SOSG用于檢測單線態(tài)氧，HPF用于檢測羥基自由基。結(jié)果顯示，HMME在10 min光照后以SOSG熒光為主（P＜0.05），而光動力殺菌機(jī)制中Ⅱ型反應(yīng)主要產(chǎn)生單線態(tài)氧，說明HMMEPACT主要通過Ⅱ型反應(yīng)來達(dá)到殺菌的目的。

試驗(yàn)所選用的HMME濃度是課題組成員篩選的較為理想的濃度，此濃度光敏劑的毒性作用較低，并且在此濃度下對正常細(xì)胞不會造成損害。如圖2所示，當(dāng)HMME的質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，光照10 min后可以有效殺滅牙齦卟啉單胞菌，滅菌率達(dá)到74.13%（P＜0.05）。HMME介導(dǎo)的PACT的作用機(jī)制可能為：當(dāng)結(jié)合在牙齦卟啉單胞菌上的HMME受到特定波長激光激活后，主要通過能量轉(zhuǎn)移（Ⅱ型）機(jī)制產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，破壞牙齦卟啉單胞菌的基本組成，導(dǎo)致牙齦卟啉單胞菌死亡［21］。但其并沒有完全殺滅牙齦卟啉單胞菌，可能是因?yàn)楦锾m陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌表面帶負(fù)電荷，同時HMME表面的zeta電位也為負(fù)電荷（圖4），兩者均為負(fù)電荷會影響牙齦卟啉單胞菌與HMME相互結(jié)合，進(jìn)而影響PACT的殺菌效果。另外革蘭陰性菌細(xì)胞壁外由脂蛋白、脂質(zhì)雙層和脂多糖構(gòu)成外膜，具有屏障作用，能阻止光敏劑進(jìn)入，所以，牙齦卟啉單胞菌對光敏劑的結(jié)合量較少，從而影響殺菌效果。后期將繼續(xù)深入研究對光敏劑改性，提高其與革蘭陰性菌的結(jié)合能力，同時提高試驗(yàn)參數(shù)，以達(dá)到最佳的PACT殺菌效果。單純光敏劑HMME組有少量細(xì)菌死亡（P＜0.05），表明HMME對牙齦卟啉單胞菌有輕微毒性作用，而光照組細(xì)菌存活率無變化，表明650 nm激光對牙齦卟啉單胞菌無殺傷作用。CLSM觀察結(jié)果一致，HMME介導(dǎo)的PACT組視野內(nèi)幾乎全部為紅色熒光，剩余較少綠色熒光，表明HMME介導(dǎo)的PACT可有效殺滅細(xì)菌。

針對牙周炎各種療法的弊端，PACT顯示出其獨(dú)特優(yōu)勢，具有無創(chuàng)、細(xì)菌不耐受、簡便易行、價格低廉、患者易于接受等優(yōu)點(diǎn)［22］。本試驗(yàn)HMME介導(dǎo)的PACT有望為治療牙周炎提供理論指導(dǎo)及試驗(yàn)依據(jù)。然而，牙周炎是菌斑生物膜引起的炎癥性病變，需要更多關(guān)于HMME介導(dǎo)的PACT對以牙齦卟啉單胞菌為主的菌斑生物膜殺菌效果的研究，并且相關(guān)的動物試驗(yàn)也值得我們進(jìn)一步探討與論證。相信HMME介導(dǎo)的PACT不僅能提高牙周炎患者的治療效果，同時也能減輕治療的痛苦，有希望成為輔助治療牙周炎的有效方法。