防己黃芪湯治療小兒腎病綜合征的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制分析

胡紅蕾，于心田，孫冬冬，刁娟娟

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014）

小兒腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是一組因腎小球濾過功能失常而出現(xiàn)的以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥及水腫為主要特點(diǎn)的臨床綜合征［1］，以2～8歲的兒童常見，西方醫(yī)學(xué)的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。大量研究發(fā)現(xiàn)其可能與免疫失調(diào)相關(guān)［2-6］。目前一線治療藥物為糖皮質(zhì)激素，但是會出現(xiàn)生長抑制、代謝紊亂、感染加重等多種副作用，常見激素依賴和激素耐藥的現(xiàn)象。尤其對于難治性腎病，往往需要二線免疫抑制劑治療，但不同患兒治療效果差異大，同時又伴有嚴(yán)重的副作用，給患兒及家長帶來了極大的困擾。

防己黃芪湯出自《金匱要略·痙濕暍病脈證并治》?！帮L(fēng)濕，脈浮身重，汗出惡風(fēng)者，防己黃芪湯主之”為益氣祛風(fēng)利水的經(jīng)典方劑?，F(xiàn)代大量研究表明，此經(jīng)方在調(diào)節(jié)免疫功能、減少尿蛋白和改善腎功能方面有不錯的效果［7-10］，但其治療小兒NS的作用機(jī)制缺乏具體研究。中醫(yī)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法利用新的“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)多組分”模式，從系統(tǒng)的角度和分子水平詮釋中醫(yī)，并以高通量方式分析配方，同時解釋了草藥配方的組合規(guī)則和網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用［11］。本文基于中醫(yī)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對防己黃芪湯中的藥物、疾病靶點(diǎn)、富集通路、生物過程進(jìn)行系統(tǒng)和分子層面的研究，并通過分子對接對關(guān)鍵靶蛋白與藥物小分子的結(jié)合效果進(jìn)行驗證，以期為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 篩選藥物有效成分及靶點(diǎn)

先在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中依次輸入 “防己”“黃芪”“甘草”“白術(shù)”等檢索成分，同時挖掘現(xiàn)有文獻(xiàn)補(bǔ)充未挖掘到的成分，后對所得成分去重整理，并在TCMSP平臺上進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）規(guī)范靶點(diǎn)。

1.2 預(yù)測疾病潛在靶點(diǎn)

分別在OMIM（https://omim.org）、DisGenet（https://www.disgenet.org）數(shù)據(jù)庫中輸入“Nephrotic syndrome in children”“Pediatric nephrotic syndrome”以獲取小兒NS靶點(diǎn)，并查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充靶點(diǎn)，對靶點(diǎn)進(jìn)行去重整理后，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點(diǎn)。

1.3 繪制韋恩圖獲取交集靶點(diǎn)

把規(guī)范后的藥物和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩在線平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，其共有靶點(diǎn)即為防己黃芪湯治療小兒NS的潛在靶點(diǎn)。

1.4 繪制交集靶點(diǎn)-成分-藥物網(wǎng)絡(luò)圖

先構(gòu)建共有靶點(diǎn)-防己黃芪湯成分-藥物關(guān)系表，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件繪制靶點(diǎn)-成分-藥物網(wǎng)絡(luò)圖，再通過Network Analyzer工具進(jìn)行自由度拓?fù)浞治?，最后依?jù)自由度選取關(guān)鍵成分。

1.5 構(gòu)建蛋白互相作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

先把共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String11.0線上平臺（https://www.string-db.org），“Organism”設(shè)置為“Homo sapiens”，置信度設(shè)置為 0.4，以獲取蛋白互相作用關(guān)系（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖；再下載PPI tsv文件，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治鲆赃x取關(guān)鍵靶點(diǎn)，最后通過Mcode Cluster插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)模塊降維分解。

1.6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）、基因本體論（GO）富集分析

Metascape是一個功能強(qiáng)大的基因功能注釋分析工具，能幫助用戶實現(xiàn)對基因或蛋白功能的認(rèn)知［12］。先把共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺進(jìn)行基因本體論（gene oncology，GO）的生物過程（biological processes）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集通路分析，再通過R語言實現(xiàn)結(jié)果可視化。

1.7 分子對接

對關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對接驗證。先在Pemchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載蛋白配體，通過Chem3D、AUTODOCK轉(zhuǎn)化為pdbqt形式；后在PDB平臺（https://www1.rcsb.org/）上下載蛋白受體，通過pymol去除溶劑和有機(jī)物，去水、加氫、加電荷、計算電荷處理后保存為pdbqt形式；再結(jié)合文獻(xiàn)確定活性口袋坐標(biāo)，通過命令提示符輸入對接命令對配體和受體蛋白進(jìn)行對接驗證；最后通過OpenBal、pymol處理對接后的蛋白結(jié)構(gòu)以實現(xiàn)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 防己黃芪湯成分的相關(guān)靶點(diǎn)

依據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%、類藥性（drug likeness，DL）≥ 0.18在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到“防己”成分3個（靶點(diǎn)36個）、“黃芪”成分20個（靶點(diǎn)197個）、“白術(shù)”成分7個（靶點(diǎn)18個）。依據(jù)ADME 參數(shù)［脂水分配系數(shù)（AlogP）＜ 5、H 鍵供體數(shù)量（Hdon）＜ 5、H 鍵受體數(shù)量（Hacc）＜ 5、腸上皮通透性（Caco-2）≥ -0.40［13］］檢索到“甘草”化學(xué)成分為62個（靶點(diǎn)109個）。對四味藥物所對應(yīng)的成分靶點(diǎn)進(jìn)行整理去重后，共獲得78個有效成分（206個靶點(diǎn)）。

2.2 小兒腎病綜合征的相關(guān)靶點(diǎn)

通過OMIM、OMIM Gene Map、Disgenet數(shù)據(jù)平臺檢索到疾病靶點(diǎn)分別為89、859、1 538個，整理去除734個重復(fù)值，并補(bǔ)充文獻(xiàn)挖掘所獲取的2個靶點(diǎn)，最終共獲得1 754個疾病靶點(diǎn)。

2.3 韋恩圖和復(fù)方疾病的共有靶點(diǎn)

把206個藥物靶點(diǎn)和1 754個疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩在線平臺，獲得48個交集靶點(diǎn)，即為防己黃芪湯治療小兒NS的潛在生物靶點(diǎn)（圖1）。

圖1 防己黃芪湯-疾病共有靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Vnne diagram of Fangji Huangqi Decoction disease common targets.

2.4 交集靶點(diǎn)-成分-藥物網(wǎng)絡(luò)圖

把共有靶點(diǎn)、藥物、作用于共有靶點(diǎn)的活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件繪成分-共有靶點(diǎn)-藥物網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治觯▓D2）。圖中包含48個共有靶點(diǎn)、68個藥效成分（表1）、4味中藥、 120個節(jié)點(diǎn)、491條邊。選取圖中自由度前五的活性成分為關(guān)鍵成分，其中活性成分中自由度最高的是槲皮素（quercetin），作用于34個疾病靶點(diǎn)，其次為7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、4′，-甲氧基光甘草定（2-［(3R)-8，8-dimethyl-3，4-dihydro-2H-pyrano［6，5-f］chromen-3-yl］-5-methoxyphenol）、山奈酚（kaempferol）和美迪紫檀（medicarpin）。

表1 （續(xù)表）Tab.1 (continued)

表1 （續(xù)表）Tab.1 (continued)

表1 藥物活性成分Tab.1 Pharmaceutical active ingredients

圖2 防己黃芪湯活性成分-疾病藥物共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of target proteins of the active ingredient of Fangji Huangqi Decoction-drug disease

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖和子模塊網(wǎng)絡(luò)圖

首先把共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String平臺，以獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），圖中有48個節(jié)點(diǎn)，261條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為10.9。然后以tsv格式下載并導(dǎo)入Sytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯▓D4a），舍棄3個游離靶點(diǎn)后，圖中共45個節(jié)點(diǎn)，261條邊。圖4a中紫色圖標(biāo)為Degree值大于17的11個靶蛋白（表2），提示可能是防己黃芪湯治療小兒NS的重要作用靶點(diǎn)。同時選取自由度前3的TP53、MYC、AKT1為關(guān)鍵靶蛋白。最后通過Cluster Maker插件的Mcode Cluster功能對其進(jìn)行聚類分析，得到3個關(guān)系緊密的子功能模塊（圖4b）。Mcode 1（17節(jié)點(diǎn)模塊）主要與癌癥通路相關(guān)，Mcode 2（7節(jié)點(diǎn)模塊）主要與PI3K-Akt信號通路相關(guān)，Mcode 3（3節(jié)點(diǎn)模塊）主要與丙型肝炎相關(guān)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

表2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)重要靶點(diǎn)Tab.2 Important targets of protein interaction network

圖4 PPI拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)圖及子模塊網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein interaction diagram and sub module

2.6 KEGG和GO富集通路

先把共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺進(jìn)行KEGG通路富集分析，選取P值前20的通路，再通過R語言繪制氣泡圖（圖5），圖中氣泡大小表示富集靶點(diǎn)數(shù)量，顏色表示P值大小，然后根據(jù)每條通路富集靶點(diǎn)數(shù)繪制條形圖（圖6）。結(jié)果表明，防己黃芪湯對小兒NS的治療作用與癌癥相關(guān)通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、丙型肝炎、乙型肝炎、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染等通路有關(guān)。通過Metascape平臺對GO生物過程進(jìn)行富集聚類分析（圖7），圖中節(jié)點(diǎn)表示通路，節(jié)點(diǎn)大小表示通路富集靶點(diǎn)的數(shù)量（靶點(diǎn)越多節(jié)點(diǎn)越大），邊表示節(jié)點(diǎn)間的共同基因，邊的寬度表示共同基因的數(shù)量（邊越寬表示共同基因越多）。圖7a中節(jié)點(diǎn)顏色依據(jù)P值大小變化而變化，圖7b中節(jié)點(diǎn)的顏色依據(jù)不同的生物過程變化而變化。圖8為繪制的聚類條形圖，其分析結(jié)果主要涉及循環(huán)系統(tǒng)、細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖、對機(jī)械刺激的反應(yīng)、生長調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、對無機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、肽基酪氨酸磷酸化體液水平的調(diào)節(jié)、腺體發(fā)育、心臟發(fā)育等多種復(fù)雜的生物過程。

圖5 KEGG富集氣泡圖Fig.5 KEGG enrichment bubble diagram

圖6 KEGG富集條形圖Fig.6 KEGG enrichment bar chart

圖7 GO富集聚類圖Fig.7 GO enrichment cluster diagram

圖8 GO聚類條形圖Fig.8 Go clustering bar graph

2.7 分子對接

關(guān)鍵蛋白和關(guān)鍵成分的對接結(jié)果均小于-5.0 kcal/mol （圖9），且AKT1與槲皮素、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定的對接結(jié)果均小于-8.0 kcal/mol（圖10、11）。結(jié)合能數(shù)值越小，表明對接效果越好，小分子化合物與大分子蛋白對接結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，越有可能發(fā)生相互作用。此結(jié)果驗證了防己黃芪湯中槲皮素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定有效作用于靶點(diǎn)AKT1、TP53、MYC的可能性。

圖9 對接結(jié)構(gòu)結(jié)合能熱圖Fig.9 Heat map of binding energy of docking structure

圖10 分子對接結(jié)果模式圖Fig.10 Molecular docking result pattern

3 討論

腎病綜合征在古籍中并沒有完全對應(yīng)的病名，但依據(jù)臨床癥狀可歸為“尿濁”“水腫”的范疇。《景岳全書·腫脹》中說：“凡水腫等癥，乃肺脾腎三臟相干之病，蓋水為至陰，故其本在腎；水化于氣，故其標(biāo)在肺；水唯畏土，故其制在脾。今肺虛則氣不化精而化水，脾虛則土不制水而反克，腎虛則水無主而妄行”。 故本病病機(jī)主要與肺脾腎三臟失司相關(guān)，臨床早期多以肺脾氣虛，脾腎陽虛為主，遷延日久陽損及陰又可引起氣陰兩虛或肝腎陰虛。防己黃芪湯聯(lián)合西醫(yī)治療不僅能有效改善腎病綜合征患兒的免疫紊亂［14］，對患者 24 h 蛋白尿、肌酐、尿素氮和尿酸水平的調(diào)節(jié)具有顯著優(yōu)勢，且不會增加不良反應(yīng)［15］。

本研究共挖掘到防己黃芪湯相關(guān)靶點(diǎn)206個，疾病相關(guān)靶點(diǎn)1 754個，疾病復(fù)方共有靶點(diǎn)48個，防己黃芪湯中有68個活性成分作用于共同靶點(diǎn)。其中關(guān)鍵活性成分有槲皮素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定，關(guān)鍵靶點(diǎn)為AKT1、MYC、TP53。結(jié)合目前研究發(fā)現(xiàn)，KEGG富集通路主要涉及MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路，GO富集分析結(jié)果主要涉及循環(huán)系統(tǒng)、細(xì)胞應(yīng)激、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)及細(xì)胞分化等生物過程。

圖11 蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖Fig.11 Protein binding site structure

關(guān)于活性成分，槲皮素是植物界分布廣泛，具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，可抑制腎間質(zhì)中CD68+巨噬細(xì)胞的浸潤，并下調(diào) NF-κB p65和IRF5 的活性，使上游信號TLR4/Myd88失活，拮抗TGF-β1/Smad2/3信號的傳導(dǎo)，從而抑制F4/80+/CD11b+/CD206+M2巨噬細(xì)胞的極化，以減少細(xì)胞外基質(zhì)的過度積累和間質(zhì)纖維化［16］。山奈酚具有抗癌、抗炎、抗病毒、防治糖尿病等多種生物活性，可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷過程中炎癥因子、炎癥通路蛋白的升高，對急性腎功能損傷具有顯著的保護(hù)作用［17］。美迪紫檀是二氫異黃酮的第二大類群，被認(rèn)為是一類重要的植物抗毒素，具有抗菌、抗炎、抗氧化劑、免疫抑制活性抑制的作用［18-22］，而小兒NS與炎癥反應(yīng)、免疫紊亂密切相關(guān)，推測美迪紫檀素可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫狀況調(diào)控小兒NS。7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、4′，-甲氧基光甘草定雖作用于小兒NS的潛在靶點(diǎn)數(shù)量多，分子對接驗證了其蛋白對接結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合能力好，但目前仍缺乏相關(guān)研究，具體作用機(jī)制仍待挖掘。

關(guān)于關(guān)鍵靶點(diǎn)，AKT1 缺失會增加腎臟缺血再灌注期間的腎小管凋亡和炎癥反應(yīng)，從而加劇腎臟損傷［23］，而增強(qiáng)腎小管AKT1信號可減少再灌注后的腎損傷，提高存活率［24］。MYC為腎損傷過程中的關(guān)鍵靶蛋白，在腎臟特異性敲除小鼠中Cxcl12和MYC基因缺失會抑制線粒體代謝和糖酵解，并延遲缺血/再灌注損傷后的恢復(fù)［25］。AFB1 可通過PLK1、PLD1 和 MYC 上調(diào) p21 的表達(dá)，誘導(dǎo)腎損傷［26］；TP53 是一種眾所周知的腫瘤抑制因子，通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和自噬，在急性腎損傷和隨后的腎臟修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［27］。 慢性腎臟疾病與腎組織中的轉(zhuǎn)化生長因子-β、p53、缺氧誘導(dǎo)因子的變化及主要發(fā)育途徑的激活密切相關(guān)［28］。

關(guān)于富集通路， MAPK是一組能被不同的細(xì)胞外刺激（如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等）激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶， 根據(jù)序列相似性、上游激活因子和次級特異性，可分ERKs、JNK、p38三大類。ERKs主要與生長因子相關(guān)信號相關(guān)，JNK和p38家族主要與細(xì)胞的應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，p38、ERK1/2 和 JNK磷酸化后可有效減少急性腎損傷腎臟中凋亡細(xì)胞的數(shù)量［29］。激活p38 MAPK 信號通路能有效調(diào)控炎癥反應(yīng)，從而減輕腎切除大鼠的腎損傷［30］，同時MAPK的低表達(dá)可影響腎纖維化的進(jìn)展［31］。PI3K蛋白家族參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。相關(guān)研究表明：激活PI3K/Akt 信號通路可減輕缺血再灌注腎損傷［32］；敲低PI3K的短發(fā)夾 RNAk可降低對纖維化的抑制［33］；減少PI3K信號傳導(dǎo)可異位激活 β-連環(huán)蛋白途徑，觸發(fā)祖細(xì)胞的過早分化；PI3K信號通路聯(lián)合其他通路可微調(diào)腎單位祖細(xì)胞自我更新和分化之間的平衡［34］。相關(guān)研究進(jìn)一步證實了MAPK和PI3K-Akt信號通路在小兒防己黃芪湯通過復(fù)雜的生物過程多途徑調(diào)控腎臟疾病中的重要作用。

綜上，防己黃芪湯對于小兒NS的治療主要依賴于MAPK和PI3K-Akt兩條信號通路，并且通過槲皮素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定等活性成分作用于MYC、AKT1靶蛋白，同時需要循環(huán)系統(tǒng)、細(xì)胞應(yīng)激、生長調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞分化等多種生物過程的參與來實現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多層次、多途徑復(fù)雜的綜合調(diào)控。本文揭示了防己黃芪湯治療小兒NS的機(jī)制，并為臨床進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了新的參考，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法仍有一定的局限性。首先，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫是不完整的，此研究數(shù)據(jù)中黃芪甘草的成分靶點(diǎn)信息量大，而防己、白術(shù)信息量少，可能會導(dǎo)致核心靶點(diǎn)關(guān)鍵成分篩選出現(xiàn)偏差；其次，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥方劑研究中的應(yīng)用主要處于定性階段，而無法涉及藥物與疾病之間的量效關(guān)系，如在中醫(yī)學(xué)中復(fù)方藥物劑量的增減會改變藥物的作用，那么藥物劑量變化是否可影響關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選，是否會導(dǎo)致生物過程的變化尚未可知。未來，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)的普及和儀器分析、數(shù)據(jù)分析的發(fā)展，期待可以找到一種超高通量、快速、無損的方法來有效地解決上述局限性［35］。