基于熒光素酶的抗巨細胞病毒體外藥物篩選模型的建立及應(yīng)用

周丹云，吳俊文，2，蔣 情，王慶林，劉如石，全梅芳*

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗系，長沙 410013；2.長沙市南雅中學(xué)，長沙 410019）

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于皰疹科病毒，是一種機會致病性病毒［1-2］，免疫功能較差者感染后可能會患如肺炎、腦炎等多種疾病，甚至死亡［1］。HCMV也是人類五大致畸因子之一，孕婦一旦發(fā)生宮內(nèi)感染，胎兒可能會出現(xiàn)小頭畸形等嚴重后遺癥［3］。HCMV感染給人類造成了巨大的疾病負擔，但是目前仍無有效疫苗上市［4］，故抗病毒藥物的篩選對于HCMV的治療具有重要意義。

目前臨床上治療HCMV感染的首選藥物是更昔洛韋（Ganciclovir），然而其容易發(fā)生耐藥，且具有一定的副作用［5］。2017年，一種名為樂特莫韋（Letermovir）的新藥上市，它通過靶向DNA末端酶復(fù)合物抑制病毒的復(fù)制來發(fā)揮抗病毒的作用，但仍有可能導(dǎo)致肝腎損傷的發(fā)生［6］。除此之外，新藥馬立巴韋（Maribavir）正在開展臨床Ⅲ期試驗，但目前研究表明，它在一定程度上會與更昔洛韋產(chǎn)生交叉耐藥，且不良反應(yīng)率仍然較高［7-8］。目前臨床對大多數(shù)病毒感染缺乏特效藥物治療，新藥研發(fā)的周期較長，而化學(xué)合成藥物往往療效有限，且毒副作用較大；細胞因子類藥物療效好，但成本太高。而中藥能在整體上調(diào)節(jié)人的免疫功能，許多中藥提取物顯示對病毒有效，如在新冠肺炎的治療研究中發(fā)現(xiàn)，用于治療病毒性呼吸道感染的經(jīng)典中草藥可能含有抗新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）的化合物［9］，因此篩選抗病毒中藥有效單體成分具有較好的應(yīng)用前景。

近年來，熒光素酶（luciferase，Luc）報告基因已經(jīng)被廣泛運用于藥物篩選的研究，如將低密度脂蛋白基因啟動子序列與luc基因連接構(gòu)成質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至HepG2細胞構(gòu)建了降脂藥物的篩選報告系統(tǒng)［10］。利用Luc報告細胞篩選能夠激活Wnt/β-catenin 信號的藥物，并評估其激活和修復(fù)肺上皮細胞的潛力，應(yīng)用于肺氣腫疾病的治療［11］。Luc報告病毒系統(tǒng)也是近年來常用的一種抗病毒藥物篩選系統(tǒng)，如Luc標記的（HIV）-luc/SARS假型病毒被用于抗 SARSCoV中藥單體篩選［12］。另外，也有基于Luc的抗流感病毒、寨卡病毒和HIV病毒等藥物篩選體系的構(gòu)建和應(yīng)用［13-15］。

本研究將帶有Luc標簽的鼠巨細胞重組病毒（Luc-MCMV）感染小鼠成纖維細胞NIH-3T3，構(gòu)建了抗MCMV體外藥物篩選的細胞模型，在此基礎(chǔ)上，選用更昔洛韋作為陽性對照藥物，評價了6種中藥單體在體外對重組病毒的抑制效果，以期為抗HCMV藥物的體外快速初篩奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 BAC質(zhì)粒和細胞株

Wt-MCMV-BAC和Luc-MCMV-BAC質(zhì)粒均由美國羅格斯醫(yī)學(xué)院朱樺教授惠贈，小鼠成纖維細胞（NIH-3T3）由本實驗室保存。

1.2 藥品和試劑

更昔洛韋（ID：KRVX-GNQ3）和黃芩素（ID：P2Z0-5CZP）由中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；黃芪甲苷（Lot：P1710025）、穿心蓮內(nèi)酯（Lot：N4450005）、綠原酸（Lot：S0740025）、槲皮素（Lot：H1610050）均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；苦參堿（Lot：X05J6M6）購自上海源葉生物科技有限公司；Luc底物L(fēng)uciferin購自美國Thermo Fisher Scientific公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEMTMI減血清培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購于美國Gibco公司；噻唑藍［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetra-zolium bromide，MTT］購自美國MP生物醫(yī)藥公司；氨芐青霉素-鏈霉素雙抗、低熔點瓊脂糖購自美國Sigma公司；Lipo2000購自美國Invitrogen公司。

1.3 主要儀器

超速離心機Optima XE-100購自美國Beckman公司；小動物活體成像系統(tǒng)IVIS Lumina LT購自美國PerkinElmer公司。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

NIH-3T3細胞用含10% FBS的DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細胞生長至80%左右，用0.25%胰酶消化細胞后接種至24孔板，調(diào)整細胞密度為1×104個/孔，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染前吸棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌后每孔加入200 μL Opti-MEM孵育2 h，按操作說明加入適量BAC質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)1～3 d后用生物發(fā)光成像鑒定轉(zhuǎn)染效果。

1.5 生物發(fā)光成像

室溫避光情況下將Luc底物母液（30 mg/mL）按體積比1∶200用無菌PBS稀釋，每孔加入適量的底物稀釋液，放入培養(yǎng)箱中避光孵育10 min，用IVIS Lumina LT儀器檢測發(fā)光情況。

1.6 空斑形成單位法測定病毒滴度

將NIH-3T3細胞調(diào)整密度至3.6×106個/mL，1 mL/孔接種于24孔板，待細胞貼壁成單層后，吸棄培養(yǎng)基，每孔分別加入400 μL梯度稀釋（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）的病毒懸液，每梯度共4個復(fù)孔，37℃、5% CO2孵育1 h，吸棄病毒液，PBS洗滌后，加入覆蓋物（細胞培養(yǎng)基與2%低熔點瓊脂糖按體積比1:1混合），待其凝固后繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細胞形態(tài)并計數(shù)空斑，滴度計算公式為：噬斑形成單位（plague formation unit，PFU）/mL=平均空斑個數(shù)×病毒稀釋度×加入的病毒液的體積（mL），根據(jù)病毒滴度繪制Luc-MCMV與Wt-MCMV的生長曲線。

1.7 MTT法檢測中藥單體的細胞毒性

取對數(shù)期細胞接種到96孔板，貼壁生長為單層細胞后，將中藥單體母液用細胞培養(yǎng)基稀釋成不同濃度梯度，并加入至96孔板，每個濃度梯度設(shè)置6個復(fù)孔，每孔100 μL藥液，并設(shè)置溶媒二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）對照孔和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）空白對照孔，孵育24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液和80 μL無血清培養(yǎng)基，避光孵育4 h，吸棄上清，加入150 μL DMSO，水平搖床上低速震蕩10 min，然后用酶標儀測定各孔在490 nm處的光密度值（optical density，OD）。計算公式：細胞存活率=（OD藥物-OD空白/OD對照-OD空白）×100%，試驗重復(fù)3次，取平均值作為試驗結(jié)果。根據(jù)細胞存活率，用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件計算藥物半數(shù)毒性濃度（median toxic concentration，TC50）。

1.8 藥物抗Luc-MCMV試驗

將細胞接種至48孔板，生長為單層細胞后，將病毒按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=1感染細胞；在病毒感染24 h后，吸棄培養(yǎng)基，將含藥培養(yǎng)基以每種藥物的最大無毒濃度（the maximum non-toxic concentration，TC0）作為工作濃度加入細胞孔中，3個復(fù)孔為一組，對照組僅加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，檢測生物發(fā)光；發(fā)光值經(jīng)定量后導(dǎo)出，分析整理數(shù)據(jù)后用GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Luc-MCMV BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的鑒定

用Lipo2000對Luc-MCMV-BAC質(zhì)粒溶液進行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示：Lipo2000使用量為2.0 μL時，鏡下可見細胞狀態(tài)不佳，生物發(fā)光強度很弱，說明Lipo2000的細胞毒性對轉(zhuǎn)染效率有一定的影響；而Lipo2000加入量為0.5 μL或1.0 μL時，鏡下觀察到細胞生長良好，生物發(fā)光檢測信號較強（圖1），證明Luc-MCMV-BAC質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染入NIH-3T3細胞。

圖1 生物發(fā)光成像檢測Luc-MCMV BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.1 Confirmation of Luc-MCMV BAC plasmid transfection by bioluminescence imaging

2.2 Luc-MCMV與Wt-MCMV的生長曲線測定

將Luc-MCMV與Wt-MCMV以MOI=0.1分別感染NIH-3T3細胞，每隔24 h用噬斑法測定病毒滴度，連續(xù)培養(yǎng)8 d，繪制病毒生長曲線。結(jié)果顯示：Luc-MCMV與Wt-MCMV均在感染后第2～5天快速生長，第5天為兩種病毒滴度的最高峰值，隨后開始下降，在此過程中雖然Wt-MCMV的滴度均高于Luc- MCMV（P＜0.05），但2種病毒的生長趨勢大致相同（圖2a）；Luc-MCMV同Wt-MCMV一樣，能使感染后的細胞變圓皺縮，并聚集形成空斑，光學(xué)顯微鏡下的噬斑形態(tài)如圖2b所示。因此，本研究使用的Luc-MCMV能夠基本反映野生型MCMV的生長狀況，可用于后續(xù)抗病毒藥物的篩選。

圖2 Luc-MCMV與Wt-MCMV的生長曲線（a）與斑塊形態(tài)（b）Fig.2 Growth curves (a) and plaque morphology (b) of Luc-MCMV and Wt-MCMV

2.3 Luc-MCMV在感染細胞中具有穩(wěn)定的Luc活性

為了檢測Luc-MCMV是否能在細胞中穩(wěn)定發(fā)光，我們設(shè)置正常細胞孔為對照，另外兩孔分別感染W(wǎng)t-MCMV與Luc-MCMV，加入Luc底物后測定生物發(fā)光。結(jié)果顯示，未感染細胞組與Wt-MCMV組都沒有檢測到生物發(fā)光信號，只有Luc-MCMV組檢測到強發(fā)光信號（圖3a）。在此基礎(chǔ)上，我們進一步將Luc-MCMV稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度，結(jié)果顯示，病毒稀釋到10-7時還能發(fā)光，說明Luc-MCMV在體外的Luc活性非常穩(wěn)定和靈敏（圖3b），且發(fā)光強度隨Luc-MCMV的梯度稀釋逐漸下降（圖3c）。

圖3 Luc-MCMV生物發(fā)光穩(wěn)定性檢測Fig.3 Stability detection of Luc-MCMV bioluminescence

2.4 中藥單體對NIH-3T3細胞毒性的測定

通過Probit回歸法分析可知，本試驗中陽性藥物更昔洛韋的TC50值為1 106.16 μg/mL，其他受試中藥單體黃芪甲苷、黃芩素、苦參堿、槲皮素、綠原酸及穿心蓮內(nèi)酯的TC50值分別為31.22、8.95、90.30、33.80、78.40和42.18 μg/mL。根據(jù)細胞存活計算可知，更昔洛韋的TC0值為625.00 μg/mL，黃芪甲苷和黃芩素的為1.60 μg/mL，苦參堿和綠原酸的為40.00 μg/mL，槲皮素和穿心蓮內(nèi)酯的為8.00 μg/mL。7種藥物的細胞毒性測定結(jié)果見表1和表2。

表1 陽性藥物更昔洛韋對NIH-3T3細胞毒性測定Tab.1 Cytotoxicity of positive drug Ganciclovir on cultured NIH-3T3 cell

表2 各中藥單體對NIH-3T3細胞毒性測定Tab.2 Cytotoxicity of traditional Chinese medicine monomers on cultured NIH-3T3 cell

2.5 中藥單體抗病毒活性的檢測結(jié)果

在加入藥物的第3、5、7、9天檢測發(fā)光強度（圖4a），發(fā)現(xiàn)槲皮素、苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、綠原酸與對照組相比，發(fā)光強度沒有顯著差異，與更昔洛韋組相比差異顯著（**P＜0.01）；黃芩素和黃芪甲苷與對照組相比，發(fā)光強度具有顯著差異（**P＜0.01），與更昔洛韋相比無顯著差異（圖4b）。這說明黃芩素、黃芪甲苷與陽性藥物更昔洛韋一樣對Luc-MCMV具有抗病毒活性。

圖4 抗病毒藥物的生物發(fā)光成像及定量Fig.4 Bioluminescence imaging and quantification of antiviral drugs

3 討論

DNA聚合酶的UL54蛋白是絕大部分傳統(tǒng)抗HCMV藥物的作用靶點［6］。由于傳統(tǒng)的幾種藥物作用位點較為單一且臨床使用二十幾年，使得病毒對該類藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。目前美國食品及藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）已經(jīng)批準抑制病毒末端酶的新藥樂特莫韋上市。該藥用于耐藥的病毒株效果較好，但是伴隨著腎損傷或者肝損傷等毒副作用。以上臨床實踐說明，研究抗HCMV新藥具有較高的臨床價值，我們還需要更多作用于不同靶點并且毒性更小的藥物。而傳統(tǒng)中藥用于病毒感染治療擁有非常悠久的歷史，安全性具有保障。中藥單體的毒性相對于人工設(shè)計的藥物較小，作用靶點相對于化學(xué)藥物也更加豐富。無論是篩選有效中藥單體研究其作用靶點，還是研究其構(gòu)效關(guān)系以開發(fā)新藥，均有很高的應(yīng)用價值。

正因如此，高效、便捷、低成本、高通量的篩選方法對于中藥單體的研究具有重要意義。Luc報告系統(tǒng)在過去已經(jīng)被廣泛研究，Eckert等［16］用分泌型的Gaussia Luciferase修飾甲型流感病毒，用于檢測藥物對病毒復(fù)制的影響。也有研究人員構(gòu)建了luc基因標記的狂犬病毒，該病毒顯示出和野生型狂犬病毒相似的復(fù)制曲線，但在動物中的致病力更弱［17］。本研究利用luc基因修飾的MCMV作為抗病毒藥物篩選的報告系統(tǒng)，并且對Luc-MCMV的細胞感染模型做了一定的研究。我們分析了Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對于細胞活性的影響，探究并選擇了較為適合的轉(zhuǎn)染條件。隨后對野生型與Luc標記的病毒生長滴度進行了測定，發(fā)現(xiàn)二者擁有相似的生長動力學(xué)，因此，Luc-MCMV可以較好地代替Wt-MCMV構(gòu)建模型。此外，我們稀釋了Luc-MCMV，并發(fā)現(xiàn)即使稀釋到較低濃度，其依舊能夠在細胞中發(fā)光，這也說明構(gòu)建的Luc-MCMV感染性較強，并且該模型的靈敏度較高。

本研究對多種中藥單體進行了藥物敏感篩選，檢測了這些藥物在不產(chǎn)生細胞毒性濃度的前提下對Luc-MCMV報告系統(tǒng)發(fā)光強度的影響，并以此作為藥效指標。研究顯示，黃芩素、黃芪甲苷處理組具有較低的發(fā)光強度，表明這兩種藥物具有一定的抑制Luc-MCMV增殖的作用。已有研究表明，黃芩素具有廣譜抗病毒活性，包括流感病毒、呼吸道合胞病毒和單純皰疹病毒I型等，其主要作用機制是黃芩素對流感病毒唾液酸酶具有強抑制作用，此外，黃芩素的免疫調(diào)節(jié)功能也起到抑制病毒的作用［18］。Evers等［19］研究表明，黃芩素的體外抗HCMV活性甚至高于陽性對照藥物更昔洛韋，其抗病毒機制與阻斷表皮生長因子受體酪氨酸激酶活性和HCMV核易位相關(guān)。黃芪甲苷也具有抗病毒活性［20］，但目前無抗HCMV相關(guān)機制研究的報道。因此，本研究中的Luc-MCMV藥物篩選報告系統(tǒng)還可以進一步深入研究。一方面，藥物對MCMV的作用機制可以使用qRT-PCR/Western blot試驗進一步驗證和探討。另一方面，我們并未繼續(xù)探討Luc-MCMV在動物模型上的有效性，同時，其以及其對小鼠的致病力是否存在差異也有待檢驗，且藥物在體內(nèi)的代謝過程較為復(fù)雜，可能經(jīng)過代謝生成更為有效的活性成分，也有藥物通過影響免疫而發(fā)揮藥效。因此，Luc-MCMV動物報告模型的構(gòu)建將會為藥物的有效性篩選提供更強有力的證據(jù)。而Luc-MCMV報告系統(tǒng)與其他新技術(shù)相結(jié)合能夠減少藥物篩選的時長。其如與微流控技術(shù)相結(jié)合，可以由微流控系統(tǒng)將細胞分散入單個液滴或單個微孔進行藥物敏感性檢測，可以實現(xiàn)單細胞水平上的藥物敏感性試驗［21］，其通量可以進一步提高。此外，我們對大蒜素的藥物活性進行過檢測，發(fā)現(xiàn)其細胞毒性較高，因此不適宜作為抗MCMV藥物進行開發(fā)。與以往研究不同的是，應(yīng)用本報告系統(tǒng)的篩選結(jié)果顯示，槲皮素、苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和綠原酸對Luc-MCMV均未有明顯的抑制作用［22-23］。這可能與使用病毒株的種類、給藥劑量以及所選用的細胞/動物模型有關(guān)。本研究中藥效不明顯的中藥單體與其他藥物聯(lián)合使用或許還能提高療效。

總的來說，本文構(gòu)建了一種基于熒光素酶的抗巨細胞病毒體外藥物篩選模型，應(yīng)用該模型篩選出兩種具有抗MCMV活性的中藥單體——黃芩素和黃芪甲苷，說明其在抗HCMV藥物的體外快速初篩中具有潛在的應(yīng)用價值。