乙烯促進(jìn)牡丹‘洛陽(yáng)紅’切花花瓣脫落與內(nèi)源生長(zhǎng)素的關(guān)聯(lián)性分析

葉迪，施江，高雙成，王占營(yíng)，史國(guó)安?

1河南科技大學(xué)牡丹學(xué)院/洛陽(yáng)市牡丹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng) 471023；2洛陽(yáng)農(nóng)林科學(xué)院牡丹研究所，河南洛陽(yáng) 471000

0 引言

【研究意義】牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）鮮切花是國(guó)內(nèi)外切花市場(chǎng)的高檔花材，極具市場(chǎng)發(fā)展前景。通常切花觀賞的核心是花朵，但花瓣衰老脫落在很大程度上決定著一朵花的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的高低，對(duì)花卉業(yè)至關(guān)重要[1-5]。牡丹切花離開母體后衰老加快，開放時(shí)間明顯縮短，觀賞品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，制約了牡丹切花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6]，深入開展牡丹切花保鮮理論與技術(shù)研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】‘洛陽(yáng)紅’是乙烯敏感型花卉，瓶插期間出現(xiàn)明顯的乙烯躍變現(xiàn)象[6-9]。牡丹花朵開放和衰老脫落受到多方面因素的調(diào)控，包括溫度、外源糖、乙烯及其作用抑制劑等[8-15]，萎蔫和落瓣是其主要衰老特征。器官脫落是高等植物生命周期中一個(gè)重要的發(fā)育事件[16]，包括衰老葉片、幼蕾、幼鈴、成熟果實(shí)、成熟種子，以及花朵和部分花器官的脫落等[17-18]。器官脫落是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和礦物質(zhì)的合理轉(zhuǎn)運(yùn)與再分配的重要過程[19]，花瓣脫落也屬于正常脫落現(xiàn)象之一[20]。植物器官發(fā)生脫落的區(qū)域稱為離區(qū)或離層（absciss zone，AZ），由幾層小而細(xì)胞質(zhì)密集的細(xì)胞組成，細(xì)胞之間缺乏大的空泡和成熟特征[21]，類似于未分化細(xì)胞[22]。不同植物類型、不同器官與組織中花瓣離層細(xì)胞層數(shù)存在一定差異，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）花瓣的離層細(xì)胞有 4—6層[16]，水稻離層細(xì)胞有 12層[23]。植物花瓣或花被離層部位一般在花瓣基部與花托相連，當(dāng)花瓣開啟衰老進(jìn)程時(shí)，激活相關(guān)代謝過程，開始釋放水解酶類，離層細(xì)胞壁降解，進(jìn)而離層細(xì)胞發(fā)生解體，最終導(dǎo)致花瓣脫落[19,24]。乙烯和生長(zhǎng)素共同控制著植物離層細(xì)胞的解體過程[25-26]。生物體內(nèi)重要的發(fā)育過程都有生長(zhǎng)素參與，依賴Trp的TAA/YUC合成途徑將Trp轉(zhuǎn)化為IAA，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[27]。生長(zhǎng)素梯度學(xué)說指出，離層的生長(zhǎng)素梯度變化能啟動(dòng)脫落，乙烯能夠加速這一過程[17,28]。在許多不同的物種（擬南芥、番茄）和器官（葉片、花瓣、花朵和果實(shí)等）中，乙烯加速離層的形成，促進(jìn)器官脫落[25,29]。外源施用乙烯或乙烯利能促進(jìn)植物器官的脫落，外源乙烯處理加快石斛蘭和玫瑰花朵脫落[30-31]。在月季切花衰老過程中，生長(zhǎng)素含量逐漸降低，而高含量生長(zhǎng)素能抑制器官脫落[25]，生長(zhǎng)素的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控了蔗糖向花瓣的運(yùn)輸，延緩了乙烯誘導(dǎo)的花瓣脫落[32]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于牡丹切花花瓣衰老脫落機(jī)制研究的報(bào)道尚少。基于前期研究，推測(cè)牡丹花朵開放和衰老中呼吸躍變受到乙烯和生長(zhǎng)素的共同調(diào)控，其中伴隨著離層水解酶類活性升高以及相關(guān)基因表達(dá)變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究用乙烯拮抗劑（AVB）預(yù)處理，結(jié)合乙烯釋放劑乙烯利（CEPA）預(yù)處理，觀測(cè)牡丹‘洛陽(yáng)紅’切花瓶插過程中花瓣脫落的生理效應(yīng)，以期為牡丹切花保鮮技術(shù)研究提供理論支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在河南科技大學(xué)洛陽(yáng)市牡丹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試材及取樣

供試材料為‘洛陽(yáng)紅’牡丹，于2019年4月14日取自牡丹實(shí)驗(yàn)基地，采取開放程度二級(jí)（綻口期）的牡丹花枝，采后放入置有冰袋的泡沫箱中，保濕并快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的切花，在水中剪切花枝至25 cm，保留2—3片復(fù)葉。

將花枝隨機(jī)分為4組，每組40枝。4個(gè)處理包括：對(duì)照組用去離子水預(yù)處理1 h（CK）；20 μL·L-1乙烯拮抗劑可利鮮（商用乙烯拮抗劑，荷蘭可利鮮公司產(chǎn)品）預(yù)處理1 h（AVB）；20 μL· L-1外源乙烯釋放劑乙烯利（40%CEPA，江蘇安邦電化有限公司）預(yù)處理1 h（CEPA）；AVB預(yù)處理1 h，接著再用CEPA預(yù)處理1 h（AVB+CEPA）。預(yù)處理結(jié)束后，用去離子水單枝瓶插。觀察花枝形態(tài)和瓶插壽命，瓶插過程中測(cè)定花瓣生理指標(biāo)，并采取 1 cm長(zhǎng)度的花瓣基部樣品，經(jīng)液氮速凍后保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

瓶插環(huán)境溫度設(shè)為 23—25℃，相對(duì)濕度在50%—60%，光照12 h/光暗12 h。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 離區(qū)細(xì)胞形態(tài)觀察 將切花的花朵整體切下，縱切為兩半，徒手撕取帶有花托的花瓣，將花瓣上部分切除，留取1 cm帶有花托的花瓣基部，在解剖鏡下用尖頭鑷和刀片撕取合適的切片，用70%乙醇固定，5%番紅染色，依次用70%、85%和95%乙醇梯度沖洗，再用 0.05%固綠復(fù)染色，100%乙醇固色，50%乙醇-50%二甲苯混合溶液透明，100%二甲苯固定，中性樹膠封片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，放大倍數(shù)為10 倍[33]。

1.2.2 瓶插品質(zhì) 從瓶插0 d起，每天在同一時(shí)間觀察統(tǒng)計(jì)花朵的開放等級(jí)，測(cè)量花朵直徑，記錄花朵的開放和衰老進(jìn)程。最佳觀賞期為半開期到50%花枝進(jìn)入始衰期的天數(shù)；瓶插壽命為瓶插0 d到50%花枝花瓣開始萎蔫落瓣的天數(shù)。

1.2.3 花瓣抗脫落力 依據(jù)物理力學(xué)原理，自制一個(gè)測(cè)力裝置。用脫脂棉包裹花枝后固定到工作臺(tái)上，用長(zhǎng)尾夾夾緊花瓣中部，鏈接一根光滑的細(xì)尼龍繩，繩子另一端穿過兩個(gè)無阻尼的定滑輪，鏈接上與長(zhǎng)尾夾等質(zhì)量的小砝碼盤，在砝碼盤中增加砝碼，直至花瓣脫落，記錄添加砝碼的總質(zhì)量。在每一次測(cè)量中，花枝和砝碼盤的高度以及繩子的長(zhǎng)度和角度都保持不變。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定外、內(nèi)層花瓣的抗脫落力，每個(gè)測(cè)定5個(gè)重復(fù)，并計(jì)算測(cè)量值的平均值。依據(jù)作用力與反作用力相等的原理，統(tǒng)計(jì)花瓣抗脫落力的大小。

1.2.4 乙烯釋放速率、ACC含量、ACS和ACO活性 參照王哲等[34]的方法，取花瓣基部0.5 cm稱量后放入集氣瓶中，靜置3 h后采用頂空法，抽取5 mL混合氣體注入氣相色譜儀中，測(cè)定乙烯釋放速率。試驗(yàn)使用GC-7890Ⅱ氣相色譜儀（上海天美）測(cè)定，分析檢測(cè)器為FID檢測(cè)器，分析條件為進(jìn)樣口溫度120℃，Porapak Q 色譜柱，柱長(zhǎng)2 m，內(nèi)徑3 mm，柱溫45℃，檢測(cè)口溫度140℃，燃?xì)猓℉2）流速25 mL·min-1，載氣（N2）流速 25 mL·min-1，空氣流速 250 mL·min-1。

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane1-carboxylate acid，ACC）含量采用Concepcion[35]的方法測(cè)定。

ACS（ACC synthase）活性采用 FERNáNDEZMACULET和 YANG[36]的方法測(cè)定。ACO（ACC oxidase）活性采用KATO和HYODO[37]的方法測(cè)定。

1.2.5 生長(zhǎng)素（IAA）含量 參考YANG 等[38]的方法，采用酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）檢測(cè)花瓣基部IAA含量。取0.5 g花瓣基部樣品加提取液快速勻漿，4℃冰箱放置4 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液，沉淀中加1 mL提取液，混合均勻，置4℃再提取1 h，離心得上清，合并上清液過C-18固相萃取柱，將過柱后的樣品轉(zhuǎn)入5 mL塑料離心管中，氮吹儀吹干，用樣品稀釋液稀釋至1 mL。樣品測(cè)定按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生長(zhǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.6 IAAO活性 參考張志良[39]分光光度法改進(jìn)試驗(yàn)溫度和反應(yīng)條件，測(cè)定花瓣基部IAA氧化酶（IAAO）活性。取0.5 g花瓣基部樣品加5 mL pH 6.0磷酸緩沖液冰浴勻漿，4 000 r/min離心15 min，上清液即為酶液，試管中加氯化錳1 mL、二氯酚1 mL、IAA標(biāo)品2 mL、磷酸緩沖液5 mL、酶液1 mL，混合均勻，弱光條件下置于30℃水浴中孵育30 min，吸取混合液2 mL，加入FeCl3和過氯酸混合液，搖勻置于40℃的黑暗處保溫30 min，顯色后用分光光度計(jì)測(cè)定A530吸光值。

1.2.7 水解酶類活性 果膠甲酯酶（PME）活性測(cè)定參考 LOHANI等[40]的方法；多聚半乳糖醛酸酶（PG）和 β-葡萄糖苷酶（BG）測(cè)定參考曹建康[41]等的方法。

1.3 基因表達(dá)分析

使用RNAprep Pure Plant Plus Kit（北京天根科技有限公司）提取‘洛陽(yáng)紅’花瓣的總RNA，用Fastking cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根科技有限公司）將 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，選擇PsD-GAPDH作為內(nèi)參基因，測(cè)定瓶插過程中PsETR1、PsCTR1、PsEIN3、PsERF1、PsYUCCA10、PsPIN1、PsPME1、PsPG1、PsBG1的相對(duì)表達(dá)量。熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在Roche Light Cycle 96 PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照 TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）說明書進(jìn)行。引物（表1）委托華大基因股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016軟件及SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及圖表繪制，在顯著性檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 花瓣離區(qū)形態(tài)

‘洛陽(yáng)紅’切花衰老過程中花瓣逐漸萎蔫脫落，從靠近雌蕊的內(nèi)層花瓣最早開始脫離花托，靠近萼片的外層花瓣最后脫落。圖1-A為切花花器官分布情況，圖1-B為切花盛開期花瓣和花托的連接狀態(tài)，圖1-C為解剖鏡下與花托相連的單片花瓣，圖1-D和圖1-E為花瓣與花托相連的細(xì)胞狀態(tài)。圖1-E為離區(qū)放大部分，上半部分為正常花瓣細(xì)胞，排列規(guī)則緊密，接近離層的部分細(xì)胞逐漸變小，下半部分為花托細(xì)胞，排列疏松不規(guī)則，中間相連的部分為離層細(xì)胞，約有 2—5層，部分細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化為橫向排列的細(xì)胞，與花瓣和花托的細(xì)胞形態(tài)明顯不同。

2.2 切花形態(tài)和瓶插品質(zhì)變化

CK瓶插1 d后進(jìn)入盛開期，4 d時(shí)花瓣開始萎蔫失水，6 d開始落瓣；與CK相比，AVB處理在2 d時(shí)達(dá)到盛花期且一直不脫落；CEPA處理在4 d時(shí)花瓣逐漸失水萎蔫，且花徑較大，5 d開始脫落，至6 d結(jié)束瓶插；AVB+CEPA處理在4 d時(shí)花瓣逐漸失水萎蔫，但在7 d時(shí)才開始脫落（圖2）。AVB預(yù)處理能明顯延緩切花花瓣脫落，CEPA加快花瓣脫落，而 CEPA能夠部分抵消 AVB的抗脫落效應(yīng)，說明乙烯在調(diào)控‘洛陽(yáng)紅’花瓣脫落過程中起著重要的生理作用。

由表2可知，牡丹切花在瓶插過程中，CK組的瓶插壽命、最佳觀賞期和最大花徑分別為（5.9±0.3）d、（4.5±0.5）d和（11.15±2.2）cm。與對(duì)照組相比，CEPA預(yù)處理瓶插壽命縮短了1.1 d，最佳觀賞期縮短了0.4 d，最大花徑增大了1.71 cm；AVB預(yù)處理最大花徑增大了1.04 cm（P＜0.05）；AVB+CEPA組瓶插壽命縮短了0.1 d，最佳觀賞期縮短了0.2 d，最大花徑增大了1.71 cm，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。乙烯拮抗劑 AVB預(yù)處理延緩了牡丹切花的衰老進(jìn)程，而外源乙烯釋放劑CEPA則加速花朵開放和衰老，意味著調(diào)控乙烯代謝能夠有效地調(diào)控‘洛陽(yáng)紅’切花的瓶插品質(zhì)。

表2 牡丹切花瓶插品質(zhì)變化Table 2 Changes of quality of cut tree peony flowers in vase

2.3 花瓣脫落力學(xué)特性

圖3所示，‘洛陽(yáng)紅’切花瓶插期間逐漸衰老脫落，外、內(nèi)層花瓣抗脫落力有明顯差異。外層花瓣的抗脫落力整體比內(nèi)層大，均呈下降趨勢(shì)。瓶插前期（0—4 d），CK處理和AVB處理抗脫落力下降較緩，4 d后外、內(nèi)層花瓣的抗脫落力均呈現(xiàn)大幅度下降，但AVB抗脫落力顯著高于CK，僅萎蔫、不脫落；CEPA瓶插期間外、內(nèi)層花瓣抗脫落力持續(xù)下降，始終低于其他處理，4 d時(shí)外層和內(nèi)層抗脫落力分別比CK降低了55.1%和56.1%（P＜0.05），5 d即出現(xiàn)脫落現(xiàn)象；AVB+CEPA處理外層花瓣抗脫落力變化趨勢(shì)與CEPA處理類似，至5 d時(shí)接近CK，而內(nèi)層抗脫落力變化在前3 d與CK接近，4 d才迅速下降，說明瓶插前期AVB與CEPA有一定的拮抗作用。表明‘洛陽(yáng)紅’花瓣的抗脫落力能夠作為花朵衰老脫落特征的重要指標(biāo)，AVB通過抑制乙烯作用則顯著提高外層花瓣的抗脫落能力，外用乙烯釋放劑CEPA降低了內(nèi)、外層花瓣的抗脫落力，揭示花瓣離層結(jié)構(gòu)變化與脫落密切相關(guān)。

2.4 花瓣基部乙烯代謝

圖4-A所示，‘洛陽(yáng)紅’瓶插期間花瓣基部有明顯的乙烯躍變特征。花瓣基部的乙烯釋放速率呈現(xiàn)先降低后上升再降低的趨勢(shì)。CK處理瓶插1 d時(shí)降到最低值，4 d時(shí)達(dá)到乙烯峰值；CEPA明顯提高了切花的乙烯峰值，且在瓶插期間一直高于其他處理；AVB降低并推遲了乙烯躍變峰值，乙烯釋放速率明顯低于CK和 CEPA處理，AVB+CEPA處理的乙烯躍變峰值也顯著低于CK。

瓶插前期（0—3 d）花瓣ACC含量變化不明顯，之后ACC含量迅速增加。與CK相比，AVB顯著降低瓶插中期（4—5 d）時(shí)花瓣ACC含量，而CEPA則明顯提高了瓶插后期花瓣ACC含量；AVB+CEPA處理僅在瓶插末期（6—7 d）高于CK（圖4-B）?；ò闍CS和ACO活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，AVB抑制ACS和ACO酶活性，而CEPA促進(jìn)酶活性，CEPA能部分抵消AVB的效應(yīng)（圖4-C和D）。說明‘洛陽(yáng)紅’花瓣乙烯代謝在調(diào)控其衰老過程中有重要的生物學(xué)作用。

2.5 花瓣基部生長(zhǎng)素代謝

圖5-A所示，CK處理花瓣基部IAA含量呈現(xiàn)先迅速上升后緩慢下降的趨勢(shì)，3 d時(shí)達(dá)到峰值，而后緩慢下降；AVB在5 d時(shí)的花瓣IAA含量達(dá)到峰值，末期（6—7 d）顯著低于CK，7 d時(shí)花瓣萎蔫而沒有明顯脫落；CEPA末期（5—6 d）花瓣IAA含量顯著低于CK；AVB+CEPA 第5天時(shí)花瓣IAA含量達(dá)到峰值，而后降低接著再升高。說明 AVB能提高瓶插后期花瓣基部IAA含量，而CEPA則降低瓶插后期花瓣基部 IAA含量。瓶插過程中，CK處理的花瓣基部IAAO活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；AVB降低瓶插末期IAAO活性，CEPA促進(jìn)瓶插中后期IAAO活性，而AVB+CEPA處理后期IAAO活性一直低于CK（圖5-B）。說明‘洛陽(yáng)紅’瓶插中后期，IAA含量和IAAO活性與花瓣衰老脫落存在一定關(guān)系。

2.6 水解酶類活性變化

‘洛陽(yáng)紅’花瓣基部的水解酶類活性變化趨勢(shì)明顯（圖6）。花瓣P(guān)ME活性前期上升緩慢，4 d后迅速增加，與CK相比，AVB處理明顯降低了PME活性，CEPA顯著升高PME活性，CEPA能夠抵消AVB的作用。花瓣基部BG和PG活性在瓶插前期變化平緩，瓶插4 d后迅速升高。說明瓶插過程中，花瓣基部的水解酶類活性與花瓣細(xì)胞衰老密切相關(guān)，其中BG活性升高早于PME和PG。

2.7 花瓣脫落相關(guān)基因差異表達(dá)

2.7.1 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因PsETR1、PsCTR1、PsEIN3、PsERF1的表達(dá) 乙烯受體編碼基因 PsETR1和PsCTR1表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)（圖7-A、B）。CK處理瓶插前期（0.5—3 d）花瓣P(guān)sETR1處于較高的表達(dá)水平，1—2 d時(shí)AVB處理的峰值比CK顯著升高了 53.2%和 19.8%，中后期表達(dá)量較低；CEPA和AVB+CEPA處理瓶插初期（0.5—1 d）和后期（5—7 d）高于CK。CK處理瓶插3 d時(shí)花瓣P(guān)sCTR1表達(dá)量到達(dá)峰值，AVB處理的峰值較CK提前了2 d，CEPA處理較CK有不同程度的降低，AVB+CEPA處理則在前期較低，后期升高，說明PsCTR1的表達(dá)受乙烯拮抗劑（AVB）的影響，表達(dá)為上調(diào)，AVB和 CEPA有拮抗作用。

乙烯轉(zhuǎn)錄因子編碼基因 PsEIN3在花瓣中的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，瓶插2 d時(shí)出現(xiàn)峰值（圖7-C）。AVB處理的瓶插初期（0.5—1 d）顯著低于CK，后期呈現(xiàn)波動(dòng)變化；CEPA和AVB+CEPA處理的表達(dá)量總體上低于 CK。乙烯響應(yīng)因子編碼基因PsERF1的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)波動(dòng)式變化趨勢(shì)（圖7-D），AVB處理的瓶插初期表達(dá)量增加后迅速下降，4 d時(shí)再次達(dá)到峰值，CEPA和AVB+CEPA處理初期的表達(dá)不明顯，1 d后表達(dá)量迅速增加。說明外源AVB和CEPA有通過乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控內(nèi)源乙烯的生理作用。

2.7.2 花瓣生長(zhǎng)素合成基因 PsYUCCA10和輸出載體蛋白基因 PsPIN1差異表達(dá) 花瓣 IAA合成酶基因PsYUCCA10表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后迅速下降的趨勢(shì)，第5天出現(xiàn)峰值。AVB處理顯著抑制其表達(dá)，CEPA處理的表達(dá)量在瓶插1 d和4—6 d時(shí)顯著高于CK?；ò晟L(zhǎng)素輸出載體蛋白 PsPIN1表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)（圖8-B）。AVB處理表達(dá)量在瓶插前期（0.5—3 d）顯著低于CK，4—6 d時(shí)高于CK；CEPA處理瓶插0.5 d時(shí)的表達(dá)量也顯著高于CK，瓶插中期（2—3 d）顯著低于CK。結(jié)果表明切花瓶插過程中花瓣P(guān)sYUCCA10調(diào)控著IAA的合成，PsPIN1在生長(zhǎng)素運(yùn)輸方面也起到一定的調(diào)控作用，外源 AVB抑制花朵開放，CEPA促進(jìn)花朵開放。

2.7.3 花瓣水解酶基因PsPME1、PsPG1和PsBG1差異表達(dá) 由圖9可知，瓶插過程中，花瓣P(guān)sPME1、PsPG1和PsBG1差異表達(dá)，變化模式明顯不同。CK處理瓶插早期0.5 d花瓣P(guān)sPME1呈現(xiàn)大幅升高后快速下降；AVB下調(diào)瓶插前期 PsPME1表達(dá)量，上調(diào)后期表達(dá)量；而CEPA的作用與AVB相反；AVB+CEPA處理的花瓣P(guān)sPME1表達(dá)量一直處于極低水平。除瓶插后期（5—6 d）外，CK處理瓶插PsPG1表達(dá)量呈現(xiàn)先迅速上升后緩慢下降的趨勢(shì)；AVB下調(diào)瓶插前期花瓣P(guān)sPG1表達(dá)量；CEPA前期（0.5—2 d）顯著上調(diào)花瓣P(guān)sPG1表達(dá)量，AVB+CEPA處理的前期（0.5—2 d）上調(diào)效應(yīng)明顯。CK瓶插過程中，PsBG1表達(dá)量逐漸升高，末期迅速降低；AVB瓶插后期（4—7 d）顯著下調(diào) PsBG1表達(dá)量。相對(duì)于瓶插期間 PsPME1和PsPG1表達(dá)量變化，PsBG1在瓶插中后期的持續(xù)升高可能與離層細(xì)胞解體直接相關(guān)。

3 討論

3.1 乙烯可能通過生長(zhǎng)素調(diào)控牡丹花瓣脫落過程

植物器官的衰老脫落與乙烯和生長(zhǎng)素的激素平衡密切相關(guān)，前期有關(guān)激素對(duì)落花落果的研究主要集中在模式植物擬南芥、番茄。擬南芥乙烯不敏感突變體ETR1-1和EIN2表現(xiàn)出抑制花器官脫落[16]；涉及乙烯信號(hào)傳導(dǎo)的EIN3-like類基因LeEIL的沉默，延遲了番茄花器官的脫落[42]。外源生長(zhǎng)素NAA和生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑TIBA處理睡蓮中間花瓣，白天花朵開啟過程中，YUC8、YUC9和YUC10轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，YUC5在花瓣晚間閉合時(shí)表達(dá)，表明晝夜花朵開啟階段細(xì)胞伸長(zhǎng)與閉合階段細(xì)胞收縮的節(jié)律運(yùn)動(dòng)受到內(nèi)源生長(zhǎng)素代謝的調(diào)節(jié)[43]。外源ETH能提前AheERF1/2表達(dá)高峰出現(xiàn)時(shí)間[44]，但在器官脫落過程中乙烯和生長(zhǎng)素相互作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步分析。GAO等[24]檢測(cè)了ERF在月季花瓣離層中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) RhERF1和RhERF4的表達(dá)分別受到乙烯和生長(zhǎng)素的影響，乙烯與生長(zhǎng)素在調(diào)控花瓣脫落過程中可能存在拮抗作用。生長(zhǎng)素酸生長(zhǎng)理論認(rèn)為，植物細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到內(nèi)源生長(zhǎng)素的調(diào)控[45]。牡丹花的迅速開放是一個(gè)花瓣細(xì)胞伸長(zhǎng)和質(zhì)量的不可逆生長(zhǎng)過程[10]，花瓣的快速伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到高水平 IAA的調(diào)控，而衰老過程伴隨著 IAA水平的迅速下降與IAAO活性的上升（圖5）。本研究發(fā)現(xiàn) AVB+CEPA預(yù)處理能降低花瓣基部的乙烯峰值，但不能推遲乙烯躍變出現(xiàn)時(shí)間，兩者調(diào)節(jié)牡丹切花花朵開放與衰老的生理效應(yīng)存在拮抗作用。表明外源AVB和乙烯能夠調(diào)節(jié)‘洛陽(yáng)紅’切花花瓣內(nèi)源IAA代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)過程，乙烯調(diào)控牡丹切花花瓣落瓣過程可能與內(nèi)源IAA的作用存在一定的關(guān)聯(lián)性。

3.2 乙烯對(duì)離層脫落細(xì)胞水解酶類的調(diào)控

離層細(xì)胞的產(chǎn)生不僅受激素的影響，還受到細(xì)胞壁代謝酶類調(diào)控。已有研究證實(shí)，花朵和果實(shí)等植物器官脫落主要受纖維素酶（EG）、PG和PME控制[41]。乙烯不僅加速植物落花落果進(jìn)程，也能促進(jìn)離區(qū)中誘導(dǎo)合成水解酶類，如纖維素酶和果膠酶[20]。研究表明，乙烯誘導(dǎo)的番茄花柄離區(qū)折斷強(qiáng)度的下降伴隨著細(xì)胞壁降解酶活性的升高[46]。齊明芳等[47]認(rèn)為，β-葡萄糖苷酶屬于纖維素酶類，通過糖化作用對(duì)花朵離區(qū)纖維素進(jìn)行降解，從而導(dǎo)致花朵凋謝和自動(dòng)脫落。PG參與多種植物器官的脫落，如大豆花莢[48]和豇豆花莢[49]等。本研究也證實(shí)外源乙烯拮抗劑（AVB）顯著降低4 d后離層水解酶類活性，下調(diào)前期PsPME1和PsPG1表達(dá)量，抑制細(xì)胞降解；外源CEPA顯著提高瓶插4 d后離層水解酶類活性，加速離區(qū)細(xì)胞壁降解，加快切花的衰老和脫落；AVB+CEPA提高4 d后PG活性，但BG和PME活性與CK相差不大，瓶插中后期AVB與CEPA存在拮抗效應(yīng)。說明內(nèi)源乙烯是調(diào)節(jié)水解酶的重要因素之一。牡丹花瓣離層細(xì)胞脫落涉及多重因素，進(jìn)一步深入其分子生理機(jī)制研究能夠?yàn)榍谢ūｕr技術(shù)與長(zhǎng)壽命品種培育提供理論支撐。

4 結(jié)論

牡丹‘洛陽(yáng)紅’切花瓶插期間存在明顯的乙烯躍變，內(nèi)源IAA含量先上升后下降，提高了乙烯促進(jìn)衰老的敏感性，切花在瓶插6 d時(shí)即出現(xiàn)脫落；乙烯拮抗劑（AVB）推遲乙烯的躍變，并降低乙烯峰值，維持瓶插末期切花IAA含量，提高花瓣抗脫落力，降低離層水解酶類活性和水解酶類基因表達(dá)量，有效抑制切花花瓣的脫落；外源乙烯釋放劑（CEPA）促進(jìn)乙烯躍變，提高乙烯釋放量，提高瓶插前期花瓣伸長(zhǎng)過程中IAA含量，促進(jìn)花朵開放，顯著提高離層水解酶類活性，切花瓶插 5 d時(shí)即出現(xiàn)萎蔫脫落；AVB與CEPA存在拮抗效應(yīng)，能降低乙烯峰值，但不能延遲乙烯躍變。說明內(nèi)源IAA參與了乙烯調(diào)控牡丹‘洛陽(yáng)紅’切花花瓣離層細(xì)胞的衰老脫落過程。