利用Target SSR-seq技術(shù)鑒定溫州蜜柑芽變材料

胡冬梅，江東，李永平，彭磊，李冬云，朱延松，楊云光

1玉溪市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，云南玉溪 653100；2西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；3云南省綠色食品發(fā)展中心，昆明 650032；4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明 650201；5華寧縣柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室，云南華寧 652800

0 引言

【研究意義】柑橘極易發(fā)生芽變，從芽變和實(shí)生選種中獲得的柑橘新品種占所有品種的比例高達(dá)77%[1-2]，尤其是一些無(wú)核柑橘品種，如冰糖橙、溫州蜜柑等多數(shù)來(lái)源于芽變。通常，根據(jù)枝、葉、果等植物形態(tài)學(xué)特征就能夠?qū)ρ孔儾牧嫌枰詤^(qū)分，但環(huán)境、氣候、栽培條件的改變會(huì)造成植物形態(tài)學(xué)特征的較大差異，很難通過(guò)形態(tài)特征就將一些品種區(qū)分開[3]，所以僅靠形態(tài)標(biāo)記很難準(zhǔn)確用于親子關(guān)系的區(qū)分和鑒定，因此利用分子標(biāo)記開展品種辨別已成為資源鑒定、品種選育和品種權(quán)保護(hù)的一項(xiàng)重要工作，其關(guān)鍵又在于能夠發(fā)掘出區(qū)分芽變材料差異的分子標(biāo)記?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，許多分子標(biāo)記技術(shù)如 RAPD[4-6]、ISSR[7]、SRAP[8]等都被用于芽變材料的區(qū)分和柑橘遺傳背景的研究。隨著深度測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，芽變材料的基因組重測(cè)序結(jié)果表明，芽變材料間存在大量的重復(fù)序列變異[9]，這為芽變材料的分子標(biāo)記開發(fā)提供了重要方向。實(shí)際上，在柑橘基因組上廣泛分布著簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR，又稱作微衛(wèi)星DNA，它是以1—6個(gè)核苷酸為重復(fù)單元構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)，在不同個(gè)體或群體之間由于串聯(lián)數(shù)目的不同而呈現(xiàn)出高度的多態(tài)性和變異性。由于SSR在染色體上分布廣泛，基因組覆蓋率較高、數(shù)量豐富，呈共顯性遺傳、并由于其高可靠性和穩(wěn)定性，而被廣泛應(yīng)用于柑橘的遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建[10]、種質(zhì)資源鑒定[11-13]和分子標(biāo)記輔助選擇[14]等研究中[1,4-6,15]。由于柑橘芽變材料間的遺傳背景高度相似[11]，前人利用 ISSR標(biāo)記僅能鑒別部分芽變品種[11]，而溫州蜜柑、甜橙、椪柑、檸檬、葡萄柚中的芽變材料鑒定則相當(dāng)困難。目前SSR的檢測(cè)方法常采用聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管熒光電泳等進(jìn)行區(qū)分，由于凝膠分辨率以及制膠、電泳等問(wèn)題，常造成讀帶困難、自動(dòng)化程度較低、耗時(shí)費(fèi)力，一次只能對(duì)少數(shù)SSR位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。隨著大量基因組數(shù)據(jù)的公布，對(duì)基因組的比較研究發(fā)現(xiàn)在染色體個(gè)別位置上存在變異熱區(qū)[16-17]，利用這些變異熱區(qū)開發(fā)SSR標(biāo)記，將有助于材料的區(qū)分和鑒別。同時(shí)利用深度測(cè)序技術(shù)如AmpSeq-SSR、Target-SSR等技術(shù)可一次性對(duì)大量 SSR位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，突破了毛細(xì)管電泳檢測(cè)對(duì)SSR位點(diǎn)檢測(cè)數(shù)量的限制[18]，且通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)與已知的參考基因組比對(duì)，能夠發(fā)現(xiàn)一些新的轉(zhuǎn)錄本和新基因[19]，將有助于個(gè)體識(shí)別以及親緣關(guān)系的鑒定。目前靶位點(diǎn)SSR測(cè)序技術(shù)已經(jīng)在水稻[20]、黃瓜[21]、大戟[22]以及法醫(yī)物證鑒定[23]中得到廣泛應(yīng)用，但該技術(shù)在柑橘芽變材料的鑒定中還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】為提高柑橘芽變品種的分子鑒別能力，本研究首先從變異熱點(diǎn)區(qū)域篩選多態(tài)性較高的SSR位點(diǎn)，利用這些SSR位點(diǎn)的高多態(tài)性來(lái)顯著提高芽變材料的鑒別區(qū)分能力。由于多數(shù)情況下單個(gè)SSR并不能區(qū)分芽變材料，因此通過(guò)SSR位點(diǎn)的組合能夠提高芽變材料的檢測(cè)能力，為增加 SSR位點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)量、通量和準(zhǔn)確性，并利于自動(dòng)化檢測(cè)，本研究采用了 Target-SSR測(cè)序技術(shù)，利用多路復(fù)用靶位點(diǎn)PCR擴(kuò)增建立測(cè)序文庫(kù)，并運(yùn)用Miseq進(jìn)行測(cè)序和基因分型?？梢淮涡垣@得多個(gè) SSR位點(diǎn)基因分型數(shù)據(jù)，不僅降低了分型成本，而且分型的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，能直接確定突變的基因位點(diǎn)，對(duì)后續(xù)研究基因變異對(duì)性狀影響意義重大。在本研究中綜合應(yīng)用了高多態(tài)性SSR的數(shù)字挖掘和Target-SSR深度測(cè)序兩種策略，提高了柑橘芽變品種的鑒別能力?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】玉溪是云南省第一大柑橘產(chǎn)地，2019年，全市生產(chǎn)柑橘48.2萬(wàn)t，占云南省柑橘總產(chǎn)量的44.40%。近年來(lái)通過(guò)大力開展芽變資源選優(yōu)，發(fā)掘了一批有潛力的極早熟、早熟、優(yōu)質(zhì)的柑橘芽變資源。為高效鑒定這些芽變材料，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)掘高多態(tài)性SSR位點(diǎn)，多路復(fù)用SSR靶位點(diǎn)擴(kuò)增構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，并利用Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)驗(yàn)證了發(fā)掘出的 SSR位點(diǎn)在區(qū)分芽變材料中的有效性。同時(shí)通過(guò)這些SSR對(duì)22份柑橘材料進(jìn)行遺傳多態(tài)性的分析。本研究建立了柑橘芽變材料區(qū)分和鑒定的高效方法，為今后柑橘種質(zhì)資源的保存、利用和研究奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與DNA提取

試驗(yàn)于2019年6月至2020年12月在西南大學(xué)柑桔研究所國(guó)家柑橘資源圃實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

研究共選用22份柑橘資源，這些材料來(lái)源于云南省玉溪市華寧縣、新平縣在柑橘芽變選優(yōu)活動(dòng)中獲得的疑似芽變材料及其母本（表1），樣本分兩次采集，第二次由于未采集到13號(hào)標(biāo)本，故未納入后續(xù)的聚類分析。這些材料包括一些地方優(yōu)良品種。取每份材料的幼嫩葉片，利用CTAB法[24]提取DNA進(jìn)行遺傳多樣性研究和Target-SSR的PCR擴(kuò)增建庫(kù)。

表1 22份柑橘種質(zhì)資源Table 1 22 citrus accessions used in this study

1.2 利用柑橘基因組數(shù)據(jù)發(fā)掘SSR位點(diǎn)

通過(guò)全基因組掃描方式發(fā)掘SSR，這些SSR位點(diǎn)將用于靶位點(diǎn)的擴(kuò)增和文庫(kù)構(gòu)建。利用GMATA軟件[25]對(duì)克里曼丁紅橘參考基因組（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=clementina）進(jìn)行分析，用于搜索全基因組SSR。設(shè)置候選SSR位點(diǎn)的搜索條件為基序模長(zhǎng)至少2 bp，基序重復(fù)至少5次。獲得目的SSR位點(diǎn)69 100個(gè)。再利用NCBI的blastdbcmd軟件提取SSR位點(diǎn)及其側(cè)翼15 bp的序列，并進(jìn)一步利用Blastn比對(duì)去除其中一致性在90%以上冗余重復(fù)序列，余下的13 453個(gè)非重復(fù)SSR序列用于序列提取和隨后的引物設(shè)計(jì)。

為尋找能夠區(qū)分溫州蜜柑芽變材料的SSR，利用NCBI上的溫州蜜柑全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，依然選用GMATA軟件預(yù)測(cè)SSR，參數(shù)和處理步驟同克里曼丁紅橘，共獲得80 064個(gè)SSR，去除冗余重復(fù)的SSR，得到15 616項(xiàng)非重復(fù)的SSR。將溫州蜜柑中鑒定到的SSR與克里曼丁紅橘中獲得的非重復(fù) SSR進(jìn)行blast比對(duì)，刪除完全一致的SSR，只保留在溫州蜜柑和克里曼丁紅橘間存在基序數(shù)目差異的SSR，這些在克里曼丁紅橘和溫州蜜柑品種間存在差異的 SSR可以認(rèn)為是胚性變異，具有物種特異性，在物種內(nèi)的保守性較強(qiáng)。為進(jìn)一步發(fā)掘能夠區(qū)分溫州蜜柑芽變材料的SSR，從NCBI中下載溫州蜜柑的核酸數(shù)據(jù)共8 503條，這些溫州蜜柑的測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于不同地區(qū)、不同栽培品種的測(cè)序數(shù)據(jù)，其中核酸序列2 583條，EST序列2 806條，GSS序列3 114條。同樣利用GMATA軟件預(yù)測(cè)SSR。再利用溫州蜜柑與克里曼丁紅橘間有差異的SSR與8 503條溫州蜜柑中獲得的SSR進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)匹配的SSR序列共計(jì)2 190個(gè)，篩選出在序列比對(duì)中具有多個(gè)hits matches的序列，用于引物設(shè)計(jì)。

1.3 對(duì)22份柑橘資源的多態(tài)性檢測(cè)

根據(jù)獲得的SSR側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)采用 Primer3軟件[26]進(jìn)行。為驗(yàn)證設(shè)計(jì)引物在芽變材料上的區(qū)分能力，首先對(duì) 22 份柑橘材料進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)引物 53 對(duì)，引物長(zhǎng)度為 18—22 bp，引物Tm值為60—65℃，從中篩選出4對(duì)多態(tài)性較高的SSR引物用于22份柑橘材料的遺傳多樣性研究（表2）。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括100 ng DNA模板、10 μL 2×TSINGKE Mastermix酶和1 μL的SSR引物，PCR 條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物利用聚丙烯凝膠電泳后，銀染顯帶進(jìn)行觀測(cè)。

表2 本試驗(yàn)篩選出的4對(duì)多態(tài)性引物Table 2 The four pairs of polymorphic SSR primers used to discriminate 22 citrus accessions

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)22份柑橘資源開展遺傳多樣性分析，利用聚丙烯酰凝膠電泳法對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，根據(jù)SSR電泳條帶的有無(wú)記錄供試材料基因型。1表示有條帶（包括弱帶），0表示無(wú)條帶，構(gòu)建（0，1）矩陣。利用Cervus 3.07軟件[27]對(duì)4對(duì)引物的觀測(cè)等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、PIC值等進(jìn)行計(jì)算，通過(guò)GenAlEx 6.51[28]軟件對(duì)22份材料進(jìn)行PCoA分析。

1.5 測(cè)序驗(yàn)證

為驗(yàn)證SSR差異條帶在區(qū)分品種上的可靠性和穩(wěn)定性，對(duì)有差異的PCR條帶采用割膠回收純化，回收PCR產(chǎn)物，將PAGE膠搗碎后加入100 μL ddH2O；0℃金屬浴20 min；以水浴后溶液為模板做PCR擴(kuò)增；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后使用微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收；因回收量過(guò)低，對(duì)回收產(chǎn)物TA克隆后送深圳華大基因公司進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 Target SSR-Seq文庫(kù)構(gòu)建

為一次性對(duì)多個(gè)SSR靶位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，本研究在采用多路復(fù)用擴(kuò)增的方式來(lái)構(gòu)建 Target SSR-seq文庫(kù)。其步驟包括：第一步使用在線工具 Multiple Primer Analyzer對(duì)引物互補(bǔ)結(jié)構(gòu)分析并設(shè)計(jì)合適的引物組合，共設(shè)計(jì)18個(gè)引物組合包含77對(duì)引物，使用多路復(fù)用PCR對(duì)2份溫州蜜柑芽變材料DNA樣品進(jìn)行靶位點(diǎn)SSR的擴(kuò)增。多重PCR反應(yīng)在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，其中包括100 ng DNA模板、10 μL 2×Hieff Canace? Gold PCR Master Mix 高保真酶預(yù)混液和3—6 μL的多重SSR引物。PCR條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min延伸。用PCR產(chǎn)物小量回收試劑盒回收。第二步，使用MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina建庫(kù)試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物建庫(kù)，主要步驟包括PCR產(chǎn)物3′端添加A尾的末端修復(fù)反應(yīng)、為產(chǎn)物添加用于Illumina Miseq平臺(tái)的測(cè)序接頭，DNA clean beads純化、為每個(gè)樣品添加特異標(biāo)簽的Index Primer PCR反應(yīng)，DNA clean beads純化。此后，將Target SSR-seq文庫(kù)在Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

1.7 Target SSR-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)的分析

對(duì)測(cè)序后的fastq原始數(shù)據(jù)利用fastqc（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）進(jìn)行質(zhì)控，去除其中的低質(zhì)量序列。質(zhì)控后的數(shù)據(jù)再利用 NextGENe_v2.4.3（https://www.softgenetics.com/NextGENe.php）與克里曼丁紅橘參考基因組進(jìn)行對(duì)比，設(shè)定最低變異位點(diǎn)覆蓋深度為 5、SNP等位基因片段為0.2、同一位置的相同變異數(shù)為2等參數(shù)后，最終獲得vcf和BAM格式文件。利用vcftools（http://vcftools.sourceforge.net/）軟件提取vcf文件中的測(cè)序深度、等位基因頻率、覆蓋深度等信息導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)后，利用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得差異性位點(diǎn)，利用IGV[29]軟件進(jìn)行變異位點(diǎn)的可視化和監(jiān)測(cè)。變異位點(diǎn)所在序列導(dǎo)入到GeneStudio（https://sourceforge.net/projects/genestudio/）軟件中產(chǎn)生序列對(duì)齊圖。

2 結(jié)果

2.1 柑橘基因組中SSR的發(fā)掘

利用GMATA軟件在克里曼丁紅橘參考基因組中獲得69 101個(gè)SSR，其中2基序SSR占69.5%，3基序SSR占25.7%，4基序SSR占3.8%，5基序SSR占0.7%，6基序SSR占0.3%。在2基序SSR中，以AT/TA的基序數(shù)量最多，占17.5%；在3基序SSR中，以AAT基序最多（3.9%）（圖1）。

在溫州蜜柑全基因組中獲得的80 193個(gè)SSR，其中2基序SSR占69.8%，3基序SSR占25.6%，4基序SSR占3.7%，5基序SSR占0.7%，6基序SSR占0.3%。在2基序SSR中，以AT/TA基序最多，占17.8%；3基序中以AAT最多，占3.9%（圖2）。從兩個(gè)柑橘品種的全基因組序列中，鑒定到的 SSR類型及比例幾乎一致，均是以2基序的AT/TA重復(fù)所占比例最多。

為尋找能夠鑒定柑橘芽變的SSR標(biāo)記，對(duì)溫州蜜柑和克里曼丁紅橘的SSR序列去除重復(fù)后，再利用BLASTn比對(duì)從中發(fā)掘兩個(gè)品種之間存在差異的SSR位點(diǎn)，這些存在于品種間的差異SSR在理論上屬于胚性突變。進(jìn)一步對(duì)溫州蜜柑基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行SSR的搜索和比對(duì)。發(fā)現(xiàn)其中一些 SSR序列比如BDQV01000095.1_33999 具有 284個(gè)匹配項(xiàng)（hit matches）、BDQV01000126.1_38180具有277個(gè)匹配項(xiàng)、BDQV01000074.1_30393具有170個(gè)匹配項(xiàng)，表明這些序列在溫州蜜柑上的同源序列較多，具有較高的多態(tài)性，且在基因組上分布較廣，暗示這些序列有可能來(lái)源于突變熱點(diǎn)區(qū)域，能夠反映體細(xì)胞突變的差異。而且這些序列中的一些往往具有反向重復(fù)特性且含有SSR，暗示其具有一定的生物學(xué)功能。利用Perl腳本取得其同源序列兩端各150 bp的序列，根據(jù)獲得的序列利用Clustal W進(jìn)行序列對(duì)齊后，發(fā)現(xiàn)其中有SSR的插入和缺失的變異，如圖3所示。利用這些體細(xì)胞突變序列來(lái)區(qū)分柑橘芽變材料時(shí)，可能會(huì)提供更多的多態(tài)信息，從而有助于芽變材料的鑒定。

為此，針對(duì)這些在溫州蜜柑全基因組上存在較多同源序列的位點(diǎn)進(jìn)行了PCR引物設(shè)計(jì)，不僅在全基因組上能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行靶向擴(kuò)增，且SSR的覆蓋程度更高，SSR的多態(tài)性更高，這樣使得測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建效率更加高效。

2.2 22份柑橘材料SSR擴(kuò)增結(jié)果

從53對(duì)SSR引物中篩選出4對(duì)擴(kuò)增效果及重復(fù)性較好、條帶清晰、多態(tài)性較高的引物用于22份柑橘材料的分析。4個(gè)引物共獲得46個(gè)等位條帶，每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因?yàn)?1.913，平均期望雜合率為0.2056，平均PIC值為0.1718。圖4為9號(hào)引物的擴(kuò)增效果圖。

從丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果來(lái)看，4份引物區(qū)分芽變材料的能力均較強(qiáng)，獲得的帶型較多，可用于芽變材料的基因分型。在22份材料中共產(chǎn)生多態(tài)性條帶84條，平均每對(duì)引物檢測(cè)到6.11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。對(duì)比9#母本和3#變異的擴(kuò)增效果圖發(fā)現(xiàn)，9號(hào)引物、30號(hào)引物和53號(hào)引物均能擴(kuò)增出差異性條帶，在圖譜中不僅有較多新條帶的出現(xiàn)，也發(fā)現(xiàn)了部分親本條帶的缺失。

根據(jù)22份柑橘材料的基因型，采用GenAlEx 6.51軟件進(jìn)行 PCoA主坐標(biāo)軸分析，可明顯將一些早熟芽變材料3、9、7、8、10、11、12號(hào)等區(qū)分開（圖5），這些材料位于第一坐標(biāo)軸的右側(cè)，與中晚熟材料能夠明顯地區(qū)分開。

2.3 驗(yàn)證

為驗(yàn)證SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性，取差異條帶進(jìn)行割膠回收后進(jìn)行Sanger測(cè)序。9號(hào)引物的9#1、9#9、9#17等多個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果相同，均為同一基因位點(diǎn)。對(duì)基因進(jìn)行注釋，證實(shí)為編碼柑橘雙功能核黃素生物合成蛋白 RIBA 1的基因，NCBI參考序列為XM_006492553.2，GenBank編號(hào)為NW_006257091.1。根據(jù)基因序列重新設(shè)計(jì)正義引物（5′-GGGATTGCCTGTTGACTC-3′），反義引物（5′-GTTTGAATTGCTGCTTATGT-3′）再次進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到單一條帶，沒(méi)有擴(kuò)增出條帶的為變異株（圖6），結(jié)果與9號(hào)引物的擴(kuò)增結(jié)果吻合。

2.4 深度測(cè)序數(shù)據(jù)分析

為驗(yàn)證從溫州蜜柑基因組上挖掘到的 SSR位點(diǎn)在區(qū)分柑橘芽變材料上的有效性，選擇2個(gè)溫州蜜柑的芽變材料3號(hào)和7號(hào)，利用77對(duì)SSR引物進(jìn)行多路復(fù)用靶向擴(kuò)增來(lái)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，之后在 Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制并去除接頭后，分別獲得40.725 M和38.559 M的短讀序列。

利用NextGENe_v2.4.3與克里曼丁紅橘參考基因組進(jìn)行對(duì)比后，3號(hào)共鑒定到1 208個(gè)與克里曼丁紅橘基因組存在差異的變異位點(diǎn)，平均測(cè)序深度為273.12，最高測(cè)序深度為7 955。7號(hào)材料共鑒定到1 202個(gè)變異位點(diǎn)，平均測(cè)序深度為 269.57，最高測(cè)序深度為6 366。利用兩份材料的vcf文件，采用vcftools提取兩個(gè)文庫(kù)中各個(gè)位點(diǎn)的測(cè)序深度 DP、等位基因頻率AF、等位基因覆蓋度SGACOV以及插入及重復(fù)序列，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中等位基因頻率AF和測(cè)序深度的比對(duì)，可尋找到能夠區(qū)分芽變材料的重要分子標(biāo)記。足夠的測(cè)序深度使SSR和SNP的鑒定更為準(zhǔn)確可靠。在測(cè)序深度較高的序列中或者附近往往含有SSR位點(diǎn)，并且兩個(gè)芽變材料的最高測(cè)序深度均對(duì)應(yīng)在相同的SCAFFOLD位置上，比如在測(cè)序深度較高的SCAFFOLD_2上的9 464 527—9 464 586位置含有GAA重復(fù)，SCAFFOLD_6上23 400 572—23 400 596含有TTA重復(fù)，表明從短讀序列cluster的測(cè)序深度的分布上，能夠確定擴(kuò)增產(chǎn)物的主帶及其位置。從而通過(guò)測(cè)序深度，可以獲得多個(gè)位置SSR的基因型，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)多位點(diǎn) SSR的基因分型。對(duì)相同位點(diǎn)上SSR等位基因的統(tǒng)計(jì)，可發(fā)現(xiàn)在一個(gè)位點(diǎn)上存在多個(gè)等位基因的現(xiàn)象，這為芽變品種的鑒定提供了更多的可選擇標(biāo)記。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中測(cè)序深度DP、等位基因頻率AF、等位基因覆蓋度 SGACOV以及插入及重復(fù)序列的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在SCAFFOLD_6和SCAFFOLD_2兩個(gè)位置上存在顯著的SSR差異（表3），進(jìn)一步用IGV審視后發(fā)現(xiàn)在SCAFFOLD_6的23 400 572—23 400 596上和SCAFFOLD_2位置9 464 550—9 464 651上有重復(fù)單元的插入或缺失差異，另外在SSR位點(diǎn)的側(cè)翼也存在SNP變異（圖7、圖8）。通過(guò)深度測(cè)序，不僅驗(yàn)證了 Target-SSR測(cè)序技術(shù)在區(qū)分芽變材料上的有效性，同時(shí)能夠?qū)SR進(jìn)行精準(zhǔn)的基因分型和定位，尤其是對(duì)SSR中插入或缺失的重復(fù)單元差異數(shù)目進(jìn)行精確的鑒定。

表3 2個(gè)柑橘芽變材料的SSR和SNP基因型差異比較Table 3 The differentiation SSR and SNP variation on two citrus bud sports variants

通過(guò)對(duì)兩個(gè)溫州蜜柑芽變 VCF變異數(shù)據(jù)的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，測(cè)序深度在600以上的差異位點(diǎn)在2個(gè)芽變品種中僅有3個(gè)，其中一個(gè)位于SCAFFOLD_6的23 400 572—23 400 596上，另外一個(gè)位于SCAFFOLD_2位置9 464 550—9 464 651上和5 693 245—5 693 275上。而減少測(cè)序深度的篩選條件，則可以得到更多的差異位點(diǎn)，但在結(jié)果的可靠性上存疑。這進(jìn)一步證實(shí)了利用常規(guī)SSR技術(shù)來(lái)檢測(cè)芽變的效率確實(shí)不高。在2個(gè)芽變品種中，通過(guò)Target-SSR測(cè)序獲得的變異位點(diǎn)并不多，為進(jìn)一步提高芽變品種的分辨力，可以利用更多的SSR引物來(lái)進(jìn)行靶位點(diǎn)的擴(kuò)增建庫(kù)。

3 討論

芽變選種是柑橘品種選育的重要途徑之一，植物形態(tài)學(xué)上的差異往往是芽變鑒定的重要標(biāo)記。但在區(qū)分芽變材料時(shí)，由于外界環(huán)境條件的改變或者受表觀遺傳因素的影響，常導(dǎo)致植物形態(tài)特征出現(xiàn)較大差異，以形態(tài)特征差異來(lái)區(qū)分芽變，其可靠性和準(zhǔn)確性不高，需要進(jìn)一步開展遺傳特異性、穩(wěn)定性和一致性觀測(cè)，來(lái)確定變異的可靠性，而這樣往往會(huì)花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間。分子標(biāo)記技術(shù)作為芽變材料鑒定的輔助手段，在芽變選種中已得到廣泛應(yīng)用。其中SSR標(biāo)記由于穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、呈共顯性遺傳、高多態(tài)性、易于自動(dòng)化檢測(cè)，在芽變材料鑒定、品種區(qū)分、品種權(quán)保護(hù)、遺傳多態(tài)性研究、遺傳圖譜構(gòu)建等多個(gè)方面得到廣泛應(yīng)用。SSR在用于芽變材料檢測(cè)時(shí)，缺點(diǎn)是SSR所能提供的遺傳多態(tài)性水平不高，往往需要對(duì)大量的SSR引物進(jìn)行篩選，用常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳有時(shí)難以找到可區(qū)分標(biāo)記，且由于聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率限制，不能準(zhǔn)確區(qū)分SSR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基個(gè)數(shù)的微小差異，偶爾也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。而以往采用區(qū)分柑橘芽變材料的 AFLP技術(shù)，又存在讀帶困難、自動(dòng)化程度低、耗時(shí)費(fèi)力等問(wèn)題，尤其區(qū)分遺傳背景高度相似的柑橘品種，如區(qū)分臍橙[3,11]、溫州蜜柑[11]、冰糖橙等芽變材料時(shí)，也存在多態(tài)性低而不能有效區(qū)分芽變材料的相同問(wèn)題。比如，李益等[11]利用SSR開展柑橘品種鑒定，從362對(duì)引物中篩選出21對(duì)SSR核心引物，盡管通過(guò)增加引物對(duì)組合可提高品種的區(qū)分能力，但仍有 279個(gè)品種無(wú)法單獨(dú)一一區(qū)分，雖可劃分為87個(gè)小組，但組內(nèi)品種無(wú)法區(qū)分。羅靜等[6]利用RAPD標(biāo)記對(duì)25份柑橘資源及其芽變系進(jìn)行鑒定和多樣性分析，RAPD的多態(tài)性檢出率只有50.7%。在其他果樹上也存在類似問(wèn)題。在桃芽變株系的鑒定中，通過(guò)50對(duì)SSR檢測(cè)，只有對(duì)照C2在CP-PCT022和BPPCT023標(biāo)記上出現(xiàn)了與供試樣品不同的等位基因位點(diǎn)[30]；在梨的芽變檢測(cè)中，10對(duì)EST-SSR引物在4組材料中沒(méi)有擴(kuò)增出差異條帶，不能鑒別芽變材料[31]，說(shuō)明利用常規(guī)手段采用多態(tài)性水平較低的SSR標(biāo)記來(lái)區(qū)分鑒定芽變材料，其效率并不高。

要克服這個(gè)問(wèn)題，一個(gè)辦法是選用基因組上變異熱點(diǎn)區(qū)域中多態(tài)性較高的SSR進(jìn)行相關(guān)區(qū)域的擴(kuò)增，另一個(gè)辦法就是增加 SSR的檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量。利用下一代測(cè)序技術(shù)開展SSR基因分型是目前新興的技術(shù)，按照文庫(kù)構(gòu)建方法的差異可分為Target SSR-seq[21]和AmpSeq-SSR[32]兩類。Target SSR-seq是在構(gòu)建文庫(kù)前對(duì)已有的SSR進(jìn)行篩選，確定目標(biāo)SSR后建庫(kù)測(cè)序。YANG等[21]利用122個(gè)SSR通過(guò)Target SSR-seq技術(shù)對(duì)382個(gè)黃瓜品種進(jìn)行基因分型，獲得16個(gè)核心引物用于黃瓜品種鑒定。AmpSeq-SSR是一種大規(guī)模SSR-seq方法，它通過(guò)設(shè)計(jì)可多重?cái)U(kuò)增的AmpliSeq引物，使用專用的AmpliTaq酶擴(kuò)增，理論上可同時(shí)擴(kuò)增上百萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)，但其引物設(shè)計(jì)要求高、價(jià)格貴。LI等[32]利用3 105個(gè)SSR通過(guò)AmpSeq-SSR技術(shù)構(gòu)建水稻的指紋圖譜。Target SSR-seq相對(duì)于AmpliSeq在小規(guī)模 SSR基因分型應(yīng)用上成本更低，但其操作更加繁瑣，需對(duì)每個(gè) SSR位點(diǎn)單獨(dú)擴(kuò)增。本研究所使用Target SSR-seq技術(shù)在引物設(shè)計(jì)上結(jié)合了Target SSR-seq和AmpSeq-SSR兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，首先通過(guò)對(duì)芽變近似材料基因組的掃描和同源序列比對(duì)，來(lái)獲得基因序列中同源相似度高、匹配數(shù)量多、多態(tài)性高的SSR位點(diǎn)。這些SSR位點(diǎn)在基因組上的匹配度高，一方面說(shuō)明其在基因組上的分布廣，有可能存在高度重復(fù)，因而變異的可能性就更大，相應(yīng)的 SSR多態(tài)性指數(shù)也就提高了。利用其側(cè)翼序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，不僅能大幅減少引物的設(shè)計(jì)數(shù)量，同時(shí)又能保證 SSR的多態(tài)性水平；另一方面，若這些變異的 SSR來(lái)自于同一個(gè)位點(diǎn)，且多態(tài)性水平高，表明存在復(fù)等位基因，在同一材料中存在這種復(fù)等位變異，就證明了有部分細(xì)胞產(chǎn)生了變異，從而為芽變形態(tài)的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

一般情況下，SSR在整個(gè)基因組上均有分布，但近年來(lái)利用基因組序列開展SSR鑒定時(shí)，發(fā)現(xiàn)在不同染色體上的SSR數(shù)量并不是均勻分布[33-35]。在禾本科不同種類植物中，SSR在基因組上的分布密度在種間存在較大差異[34]，著絲粒附近的密度往往小于染色體臂上的密度，非編碼區(qū)（UTRs）SSR的覆蓋率比編碼區(qū)、外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)更高，SSR的豐度與重組率呈顯著的線形正相關(guān)[34]。為提高SSR區(qū)分芽變品種的能力，往往需要篩選多態(tài)性高的SSR用于靶向測(cè)序，本研究通過(guò)同源序列的比較，以發(fā)現(xiàn)匹配數(shù)量多且多態(tài)性水平高的SSR位點(diǎn)，進(jìn)而設(shè)計(jì)引物。這與以往通過(guò)基因組序列來(lái)鑒定 SSR位點(diǎn)有本質(zhì)區(qū)別，以往SSR的生物信息學(xué)挖掘只是對(duì)SSR位點(diǎn)和模式的鑒定，缺少同源序列的比較，因此不能提供SSR多態(tài)性方面的信息。本研究利用BLASTn發(fā)現(xiàn)了一些在基因組上同源匹配數(shù)量很高的SSR序列，表明這些SSR位點(diǎn)來(lái)自于序列重復(fù)區(qū)域或者是變異熱點(diǎn)區(qū)域，這些位點(diǎn)除了與基因組上的多次復(fù)制事件有關(guān)外，還可能與染色體的多次重排事件有關(guān)，因此這些SSR能夠提供更多的遺傳變異信息，因此有助于芽變材料的鑒定。MA等[33]采用對(duì)4個(gè)物種基因組開展SSR引物的e-PCR比較，來(lái)評(píng)價(jià)不同物種之間SSR的多態(tài)性和SSR產(chǎn)物在物種之間的特異性，顯著提高了SSR引物區(qū)分不同物種的能力。

本研究利用溫州蜜柑和克里曼丁橘全基因組序列發(fā)掘SSR位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在基因組上AT/TA二單元是最多的串聯(lián)重復(fù)，而3基序中以AAT最多，這與PAVAN KUMAR等[36]在葉子花中的結(jié)果相似。利用同源序列比對(duì)的方式來(lái)獲得多態(tài)性SSR位點(diǎn)，采用在全基因組序列中同源比對(duì)匹配度高、數(shù)量多的SSR位點(diǎn)的側(cè)翼序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)了53對(duì)引物，篩選到能夠區(qū)分芽變材料的4對(duì)引物，其效率比其他方式利用SSR來(lái)區(qū)分柑橘芽變材料的效率更高。4對(duì)引物就可對(duì)22份柑橘種質(zhì)材料進(jìn)行有效區(qū)分，并且對(duì)有差異性的條帶進(jìn)行回收和Sanger測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)了這些引物在區(qū)分柑橘品種上的可靠性、穩(wěn)定性及分辨能力，同樣這些引物還能夠用于柑橘其他種類及品種的區(qū)分和鑒定。本研究中Target-SSR Miseq的測(cè)序結(jié)果也證實(shí)，在測(cè)序深度較高的擴(kuò)增位點(diǎn)中，往往存在多個(gè)SSR等位基因，這些等位基因有可能來(lái)自于基因組上的不同位點(diǎn)，代表著基因的復(fù)制或者跳躍事件，有一定的生物學(xué)功能；也有可能來(lái)自于基因組上的同一位點(diǎn)，若是存在于同一位點(diǎn)上的復(fù)等位基因，則暗示有個(gè)別細(xì)胞產(chǎn)生了變異從而形成混合的細(xì)胞亞群，因此根據(jù)不同SSR等位基因的比例差異，能夠?qū)崿F(xiàn)柑橘芽變品種的區(qū)分。

另外，增加 SSR的檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量，也能有效提高鑒別區(qū)分芽變材料的能力。本研究采用靶位點(diǎn)的多路復(fù)用擴(kuò)增來(lái)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)18個(gè)組合，對(duì)2個(gè)溫州蜜柑芽變材料采用 77對(duì) SSR進(jìn)行了有效擴(kuò)增，構(gòu)建了測(cè)序文庫(kù)，并采用Illumina Miseq的深度測(cè)序一次性獲得了1 202—1 208個(gè)變異位點(diǎn)，平均每對(duì)引物獲得了 15.6個(gè)變異位點(diǎn)，顯著高于凝膠電泳的檢測(cè)能力。并且能對(duì)變異位點(diǎn)獲得了準(zhǔn)確的基因分型，同時(shí)還可獲得SSR側(cè)翼的SNP基因型，進(jìn)一步提高信息量和芽變材料的鑒定能力。該方法還克服了凝膠電泳存在的讀帶困難，可組合的SSR基因座的個(gè)數(shù)受熒光種類限制，檢測(cè)的變異位點(diǎn)少，一次難以進(jìn)行多個(gè) SSR位點(diǎn)的基因分型的問(wèn)題。YANG等[21]利用 Target-SSR測(cè)序開展黃瓜品種的SSR基因分型，表明該技術(shù)不僅經(jīng)濟(jì)高效，測(cè)序深度較高（～1 000×），同時(shí)基因分型的成功率高達(dá)100%。利用群體材料進(jìn)行SSR基因分型時(shí)，發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)上的等位基因數(shù)量與觀察雜和度、PIC值呈顯著正相關(guān)。在進(jìn)行 SSR基因分型開展黃瓜遺傳群體的劃分時(shí)，作者采用了遺傳多樣性高而等位基因數(shù)最少的SSR位點(diǎn)用于基因分型。而本研究中Target-SSR測(cè)序技術(shù)主要用于2個(gè)芽變材料的區(qū)分，因此采用遺傳多態(tài)性高而等位基因數(shù)較多的SSR，能夠顯著提高芽變材料的鑒別能力。

本研究中 Target-SSR深度測(cè)序的結(jié)果表明，2份溫州蜜柑芽變材料間的SSR基因型至多在3個(gè)等位基因上出現(xiàn)了差異，有差異的 SSR位點(diǎn)數(shù)并不多。這一方面印證了SSR技術(shù)區(qū)分柑橘芽變的能力有限，另一方面也表明通過(guò)PCR擴(kuò)增建庫(kù)，由于引物的特異性強(qiáng)，建庫(kù)較為成功。對(duì)于同一位點(diǎn)SSR基因型中3等位基因的出現(xiàn)，還需要進(jìn)一步區(qū)分是否存在基因組上的多位點(diǎn)擴(kuò)增。只有通過(guò)測(cè)序深度、等位基因覆蓋度、等位基因頻率等多個(gè)指標(biāo)的結(jié)合，才能更精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)芽變導(dǎo)致的SSR位點(diǎn)差異。由于這些有差異的SSR位點(diǎn)往往來(lái)源于體細(xì)胞變異而非胚性變異，因此存在變異細(xì)胞數(shù)量少，在測(cè)序深度低、PCR擴(kuò)增建庫(kù)存在偏向性時(shí)，這種一個(gè)位點(diǎn)上存在多等位基因變異的現(xiàn)象，往往難以被檢測(cè)到。本研究為提高柑橘芽變品種的區(qū)分能力，在進(jìn)行 SSR靶位點(diǎn)的深度測(cè)序前，使用了較多數(shù)量的SSR引物進(jìn)行多路復(fù)用靶位點(diǎn)PCR擴(kuò)增，增加了檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量，同時(shí)選用覆蓋度高、同源序列多、多態(tài)性高的SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使文庫(kù)構(gòu)建更加高效，也更加容易發(fā)現(xiàn)芽變材料中的突變位點(diǎn)。深度測(cè)序結(jié)果不僅準(zhǔn)確探明了芽變材料的 SSR基因型，同時(shí)也定位了SSR在基因組上的位置，利用SSR的測(cè)序深度和等位基因頻率兩個(gè)參數(shù)結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了在芽變材料間具有差異的SNP和SSR位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)了芽變材料的準(zhǔn)確區(qū)分，也為芽變材料目標(biāo)性狀變異的遺傳機(jī)理研究提供了更多有用信息。鑒于Target-SSR靶位點(diǎn)的深度測(cè)序技術(shù)能夠在24 h內(nèi)對(duì)多個(gè)樣本中的數(shù)百個(gè)目標(biāo)SSR位點(diǎn)進(jìn)行快速基因分型，不僅成本更低，而且發(fā)掘變異的能力更強(qiáng)，未來(lái)還可通過(guò)進(jìn)一步增加SSR擴(kuò)增靶位點(diǎn)的數(shù)量來(lái)提高芽變材料的鑒別能力。該技術(shù)除了用于芽變材料的鑒定外，一次能夠獲得覆蓋全基因組的大量位點(diǎn)的SSR基因型，更有利于柑橘資源的遺傳演化及多樣性研究。

4 結(jié)論

本研究采用基因組數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘和比對(duì)，發(fā)掘突變熱點(diǎn)位置的SSR，利用優(yōu)選出的靶位點(diǎn)SSR設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多路擴(kuò)增構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，采用 Miseq二代測(cè)序技術(shù)，成功鑒定了溫州蜜柑的芽變材料及其親本，同時(shí)對(duì)玉溪地區(qū)的22份優(yōu)異柑橘材料進(jìn)行了多樣性研究。本研究綜合了芽變檢測(cè)的兩種技術(shù)，選用來(lái)源于變異熱點(diǎn)的多態(tài)性較高的SSR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，增加SSR的檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量，并基于深度測(cè)序技術(shù)獲得了精準(zhǔn)的SSR靶位點(diǎn)及其基因型，為今后的柑橘芽變品種鑒定、資源遺傳多樣性研究奠定了重要基礎(chǔ)。