藍(lán)莓花青素對油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性小鼠Plin5蛋白表達(dá)的影響*

李晨馳，韓蕭蕭，楊柳，張景允，劉冉陽，楊勤

（貴州醫(yī)科大學(xué)1.病理生理學(xué)教研室，2.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550000）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）指除酒精和其他明確損傷肝臟的因素之外，發(fā)生的以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要病理特征的臨床病理綜合征[1]。目前研究認(rèn)為，在一定程度上，肝臟脂肪變性是有可能逆轉(zhuǎn)的；而一旦進(jìn)展為肝炎、肝纖維化，治療難度將會增大。因此，近年來許多研究都致力于通過不同的手段，包括食療、藥物等改善NAFLD[2]。本課題組前期研究及其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓具有一定的預(yù)防和改善脂肪肝的作用，這為NAFLD 的非藥物療法提供了新思路，但其機(jī)制尚未完全闡明[3-4]。

脂滴包被蛋白5（Perilipin5, Plin5）是Perilipin 家族的最新成員。已有研究顯示，Plin5 作為脂滴形成的關(guān)鍵蛋白之一，在維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和代謝平衡中具有重要作用[5]，且Plin5 的表達(dá)受PI3K/Akt 信號通路的影響[6]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，富含黃酮類化合物的碧蘿芷能夠影響油酸誘導(dǎo)的Plin5蛋白表達(dá)[7]，而藍(lán)莓中含有大量黃酮類化合物——花青素[8]。由此推測藍(lán)莓改善肝脂肪變性的作用可能與藍(lán)莓富含的花青素調(diào)節(jié)肝細(xì)胞Plin5 蛋白的表達(dá)有關(guān)。

故本研究以油酸（oleic acid, OA）誘導(dǎo)AML12 小鼠肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，復(fù)制NAFLD 模型，在此基礎(chǔ)上觀察藍(lán)莓花青素對油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性及損傷是否具有改善作用，并觀察Plin5 蛋白表達(dá)與脂滴形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料與儀器

AML12 小鼠正常肝細(xì)胞株購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫，藍(lán)莓花青素購自陜西萃雅佳生物科技有限公司，油酸購自美國Sigma 公司，胎牛血清購自美國Scien Cell 公司，DMEM/F12 培養(yǎng)基購自美國Gbico 公司，油紅O 細(xì)胞專用染色試劑盒購自北京Solarbio 公司， 甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗體購自武漢ABclonal 公司，Plin5 多克隆抗體購自美國Proteintech 公司， 磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）、磷酸化蛋白激酶（phospho-protein kinase B, Akt）抗體購自美國CST 公司，甘油三酯（Triglyceride, TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase, AST）檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司，xCELLigence RTCA DP 型實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀（real time cellular analysis,RTCA）購自杭州艾森生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最佳藍(lán)莓花青素終濃度的確定 AML12 小鼠肝細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)檢測藍(lán)莓花青素對AML12 細(xì)胞增殖的影響。取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種密度為5×103個(gè)/孔（150 μl/孔），設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。接種細(xì)胞24 h后，以不同終濃度的藍(lán)莓花青素（0 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、150 μg/ml、200 μg/ml）培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別設(shè)置為0 μg/ml 組、50 μg/ml 組、100 μg/ml 組、150 μg/ml 組、200 μg/ml 組。連續(xù)動態(tài)監(jiān)測≥65 h，每15 min 記錄1 次。抑制率（%）=（0 μg/ml 組-不同濃度藍(lán)莓花青素組）/0 μg/ml 組×100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇對細(xì)胞生長抑制非常低的藍(lán)莓花青素濃度（50 μg/ml）作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。

1.2.2 細(xì)胞分組及肝細(xì)胞脂肪變性模型復(fù)制 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按照每孔1.25×105個(gè)/ml 細(xì)胞密度接種于6 孔板，分別設(shè)置對照組、油酸誘導(dǎo)組、維生素C 組、藍(lán)莓花青素組。對照組常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，油酸誘導(dǎo)組、維生素C 及藍(lán)莓花青素組，根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇含0.75 mmol/L 油酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，復(fù)制小鼠肝細(xì)胞脂肪變性模型。復(fù)制成功后，維生素C 組及藍(lán)莓花青素組分別更換含50 μg/ml 維生素C 及50μg/ml 藍(lán)莓花青素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 ALT、AST、TG 水平檢測 細(xì)胞按照7.5×105個(gè)/ml 密度培養(yǎng)于直徑60 mm 培養(yǎng)皿。收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行加樣，測定各孔光密度（OD）值。按照液體樣本計(jì)算公式：絕對OD 值=測定孔OD 值-對照孔OD 值，參考試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測ALT、AST 活力單位。收集細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，留細(xì)胞沉淀，分別加入等量PBS 清洗2 次。再次加入PBS，在冰浴條件下將細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，制備好勻漿后不離心，按照操作表進(jìn)行加樣，每組重復(fù)3 次，測定各孔OD 值。并以BCA 法測定蛋白濃度。按照細(xì)胞計(jì)算公式：TG 濃度=[（樣本OD 值-空白OD 值）/（校準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）]×校準(zhǔn)品濃度（mmol/L）/待測樣本蛋白濃度（g/L），檢測細(xì)胞內(nèi)TG 含量。

1.2.4 油紅O染色 細(xì)胞按照每孔1.25×105個(gè)/ml密度培養(yǎng)于6 孔板。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定50 min 后PBS 漂洗，油紅O 染色1 h，60%異丙醇漂洗10 s，PBS 漂洗，染色。顯微鏡下拍照。采用ImageJ-ProPlus 6.0 圖像分析軟件，每組隨機(jī)選取3 個(gè)高倍視野，計(jì)算脂滴表達(dá)的紅色積分光密度（IOD）值。

1.2.5 Western blotting 細(xì)胞按照7.5×105個(gè)/ml 密度培養(yǎng)于直徑60 mm 培養(yǎng)皿。使用RIPA 蛋白裂解液裂解細(xì)胞，按照BCA 蛋白定量法計(jì)算并制備蛋白樣品，向蛋白液中加入5×SDS 蛋白上樣緩沖液，取10 μl 上樣并使用SDS-PAGE 分離后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉液封閉1.5 h。TBST 洗膜后，加入稀釋后的I 抗[Plin5 為1∶4 000，GAPDH為1∶2 000，PI3K為1∶1 000，P-Akt為1∶2 000]孵育，4℃過夜。次日用TBST 洗凈后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。之后使用ECL 工作液曝光。以IMAGELAB 軟件計(jì)算陰影值，Plin5、PI3K、P-Akt 與GAPDH 表達(dá)量陰影面積的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)莓花青素對細(xì)胞增殖的影響

用不同濃度的藍(lán)莓花青素培養(yǎng)基處理后，0 μg/ml組和50 μg/ml 組的細(xì)胞指數(shù)逐漸升高，100 μg/ml、150 μg/ml 組緩慢升高，200 μg/ml 組緩慢升高后下降。0 μg/ml 組、50 μg/ml 組、100 μg/ml 組、150 μg/ml組、200 μg/ml 組細(xì)胞指數(shù)分別為（2.49±0.07）、（2.45±0.06）、（2.14±0.04）、（1.51±0.060）和（1.42±0.02），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=275.573，P=0.000），100 μ g/ml、150 μ g/ml、200 μ g/ml 組 較0 μg/ml 組下降（P＜0.05）。藍(lán)莓花青素處理24 h 后100 μg/ml 組抑制率為14.18%；而50 μg/ml 組 為1.60%，未顯示出明顯抑制率。因此選擇50 μg/ml的藍(lán)莓花青素作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。見圖1。

圖1 不同濃度藍(lán)莓花青素處理AML12細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)變化趨勢

2.2 各組AML12細(xì)胞AST、ALT、TG水平比較

各組AML12 細(xì)胞ALT、AST、TG 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），油酸誘導(dǎo)組較對照組升高（P＜0.05），維生素C 組、藍(lán)莓花青素組較油酸誘導(dǎo)組降低（P＜0.05），藍(lán)莓花青素組較維生素C 組降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組AML12細(xì)胞AST、ALT、TG水平比較（±s）

表1 各組AML12細(xì)胞AST、ALT、TG水平比較（±s）

組別對照組油酸誘導(dǎo)組維生素C組藍(lán)莓花青素組F 值P 值A(chǔ)LT/（u/L）2.32±0.19 8.55±0.24 4.94±0.79 3.47±0.74 68.682 0.000 AST/（u/L）2.84±0.76 8.34±1.51 5.98±0.35 4.86±0.15 21.037 0.000 TG/（mmol/g）0.09±0.01 0.47±0.01 0.38±0.04 0.28±0.06 54.350 0.000

2.3 脂滴染色結(jié)果

對照組細(xì)胞幾乎沒有被油紅染料染成紅色的脂滴。油酸誘導(dǎo)組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量被油紅染料染成紅色的脂滴，并散在分布于細(xì)胞核周圍。維生素C 組、藍(lán)莓花青素組可見脂滴不同程度地減少。對照組、油酸誘導(dǎo)組、維生素C 組、藍(lán)莓花青素組的IOD 值分別為（0.04±0.04）、（4.00±0.20）、（2.63±0.21）、（1.17±0.15），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=329.990，P=0.000），油酸誘導(dǎo)組較對照組升高（P＜0.05），維生素C 組、藍(lán)莓花青素組較油酸誘導(dǎo)組降低（P＜0.05），藍(lán)莓花青素組較維生素C 組降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組AML12細(xì)胞中脂滴分布 （油紅O染色）

2.4 各組Plin5、PI3K、P-Akt蛋白相對表達(dá)量比較

各組Plin5、PI3K、P-Akt 蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。油酸誘導(dǎo)組較對照組升高（P＜0.05），維生素C 組、藍(lán)莓花青素組較油酸誘導(dǎo)組降低（P＜0.05），藍(lán)莓花青素組較維生素C 組降低（P＜0.05）。見圖3、4 和表2。

表2 各組AML12細(xì)胞Plin5、PI3K和P-Akt蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表2 各組AML12細(xì)胞Plin5、PI3K和P-Akt蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

組別對照組油酸誘導(dǎo)組維生素C組藍(lán)莓花青素組F 值P 值Plin5 0.85±0.08 1.41±0.34 1.03±0.08 0.68±0.03 9.240 0.006 PI3K 0.75±0.10 1.27±0.20 0.87±0.04 0.58±0.07 18.431 0.001 P-Akt 0.45±0.13 0.63±0.03 0.38±0.07 0.32±0.10 7.067 0.012

圖3 各組AML12細(xì)胞Plin5、PI3K和P-Akt蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

圖4 各組AML12細(xì)胞Plin5、PI3K和P-Akt蛋白的表達(dá)

3 討論

肝臟作為調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)平衡的主要器官之一，其脂肪酸主要有兩種代謝方式：一是線粒體β 氧化；二是游離脂肪酸與甘油進(jìn)行酯化形成TG，儲存在脂滴[10]。當(dāng)肝細(xì)胞攝入脂肪酸過量時(shí)，β 氧化途徑受到抑制，脂質(zhì)沉積加劇，導(dǎo)致脂肪變性[11]。本實(shí)驗(yàn)采用較高濃度油酸誘導(dǎo)AML12 細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中肝功能損傷指標(biāo)ALT 和AST 水平、細(xì)胞內(nèi)TG 含量、脂滴數(shù)量均顯著高于對照組；上述結(jié)果提示油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生明顯脂肪變性及損傷，模型復(fù)制成功。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃酮類化合物可以提高細(xì)胞抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，并減少脂質(zhì)沉積[12]。藍(lán)莓富含多種抗氧化活性物質(zhì)如黃酮類、多酚類化合物，其中抗氧化主要活性物質(zhì)——花青素，屬黃酮類化合物，是一種水溶性天然色素[8]，本實(shí)驗(yàn)采用具有抗氧化活性的水溶性維生素C 作為陽性對照，經(jīng)維生素C 及藍(lán)莓花青素處理后，維生素C 組、藍(lán)莓花青素組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST 水平以及細(xì)胞內(nèi)TG 含量、脂滴數(shù)量較油酸誘導(dǎo)組均降低。提示藍(lán)莓花青素可有效降低肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積并改善肝細(xì)胞損傷，且與維生素C 作用相似。

在肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)以脂滴的形式沉積，而脂滴周圍覆蓋有多種脂滴蛋白，其中Perilipin 家族蛋白是研究比較廣泛的一類脂滴蛋白[13]。目前，Plin1、Plin4 主要表達(dá)于脂肪組織中，Plin2、Plin3 可見于許多細(xì)胞類型。而Plin5 多表達(dá)于脂肪酸氧化代謝旺盛的組織，如心臟、肝臟、骨骼肌等。Plin5 作為新發(fā)現(xiàn)的成員，其亞細(xì)胞定位主要在脂滴表面[14]。Plin5 能夠通過抑制TG 脂解和/或降低脂肪酸氧化，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累[15]。本實(shí)驗(yàn)油酸誘導(dǎo)組Plin5 蛋白表達(dá)較對照組顯著增加，其表達(dá)和脂滴增加一致。LI 等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)油酸刺激后AML12 小鼠肝細(xì)胞中Plin5 的表達(dá)呈濃度及時(shí)間依賴性升高，與其相似，提示油酸誘導(dǎo)Plin5 蛋白表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)沉積。維生素C、藍(lán)莓花青素干預(yù)后，Plin5 蛋白表達(dá)水平相較于油酸誘導(dǎo)組均明顯下降，提示維生素C、藍(lán)莓花青素能夠抑制油酸誘導(dǎo)的Plin5 蛋白表達(dá)，起到減少脂質(zhì)沉積的作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)Plin5 蛋白可通過PI3K/Akt 途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[6]。ZHONG 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PI3K 可以降低油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中Plin5 的表達(dá)及脂滴沉積。以上研究均提示，脂滴蛋白與PI3K/Akt 信號通路的調(diào)控密切相關(guān)。

基于“脂質(zhì)代謝異常加劇肝臟脂肪沉積，進(jìn)一步發(fā)生氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致NAFLD 的發(fā)生”這一共識，PI3K/Akt 信號通路將有望成為改善NAFLD 的靶點(diǎn)[18]。近年來，關(guān)于PI3K/Akt 在脂質(zhì)代謝方面的研究不斷增多，越來越多的學(xué)者認(rèn)為PI3K/Akt 信號通路能促進(jìn)脂質(zhì)合成并抑制脂肪分解，是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要通路[19]。此外，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素能夠影響PI3K/Akt 信號通路蛋白的表達(dá)[20]。本研究中油酸誘導(dǎo)組PI3K、P-Akt 蛋白表達(dá)相較于對照組顯著增加，而維生素C 組、藍(lán)莓花青素組Plin5、PI3K、P-Akt 蛋白表達(dá)較油酸誘導(dǎo)組降低，藍(lán)莓花青素組及維生素C 組下調(diào)結(jié)果一致。由此推測，藍(lán)莓花青素可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路影響Plin5 蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂滴的沉積，但PI3K/Akt 信號通路是直接調(diào)控還是間接調(diào)控Plin5 蛋白的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，藍(lán)莓花青素在一定程度上可以改善油酸誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞脂肪變性。在油酸誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性時(shí)，藍(lán)莓花青素可能通過抑制Plin5 蛋白的表達(dá)減少肝脂肪變性。筆者推測其機(jī)制是通過藍(lán)莓花青素抑制PI3K/Akt 信號通路使Plin5 蛋白表達(dá)下降，減弱Plin5 蛋白促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的功能，達(dá)到改善油酸誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞脂肪變性的目的。但是其詳細(xì)作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步深入研究。