圓苞車前子殼粉對酪蛋白酸鈉制備的水包油型乳液穩(wěn)定性和微觀結(jié)構(gòu)的影響

王婷婷，扶慶權(quán)*，張建文， 胡獻(xiàn)麗，王蓉蓉，宋尚新

1(南京曉莊學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京，211107)2(南京櫻桃鴨業(yè)有限公司, 江蘇 南京，210002) 3(江蘇福步食品科技有限公司, 江蘇 南京，211505)

脂肪是決定肉制品感官特性的重要成分之一，在肉制品加工過程中可以降低水分的流失從而增加產(chǎn)率，同時也是風(fēng)味物質(zhì)的主要來源。脂肪也可提高肉制品的營養(yǎng)價值，作為脂溶性維生素和必需脂肪酸的重要來源[1]。然而，由于肉制品中存在高鹽、高脂、高熱量的問題，肉類攝入過量也會增加心血管疾病、冠心病、癌癥、肥胖和高血壓的風(fēng)險(xiǎn)。因此，隨著人們健康膳食觀念的增強(qiáng)，對低脂肉制品的需求也愈來愈強(qiáng)烈。傳統(tǒng)乳化型肉制品可能含有高達(dá)30%的動物脂肪，特別是德國慕尼黑香腸、法蘭克福香腸和中國傳統(tǒng)的臘腸等，具有較高的飽和脂肪和膽固醇含量。為了滿足消費(fèi)者的健康需求，肉類行業(yè)正在發(fā)展高質(zhì)量的低脂肉制品并且不斷增加其產(chǎn)品價值。為了降低肉制品的脂肪含量，可通知添加非肉蛋白、改性脂肪、膠體和水作為脂肪替代品來生產(chǎn)乳化型肉類產(chǎn)品。預(yù)乳化技術(shù)是指添加不同種類的植物油，乳化劑和水制備預(yù)乳化液，或使用功能特性良好的預(yù)乳化液凝膠代替動物脂肪，從而降低飽和脂肪酸和膽固醇含量，提高肉制品的產(chǎn)量[2]。在已有研究中，大豆、酪蛋白酸鈉和乳清蛋白已被用于制備預(yù)乳液，并成功地應(yīng)用于肉類產(chǎn)品加工中替代動物脂肪[3]。

圓苞車前子屬車前科車前屬，目前主要生長在印度、巴基斯坦、伊朗和歐洲一些國家。圓苞車前子殼粉(psyllium husk powder，PHP)是通過機(jī)械研磨篩選出種子的最外層部分。PHP含有豐富的粗蛋白、膳食纖維、碳水化合物、微量元素以及天然黏液物質(zhì)[4]。黏性膳食纖維已被證明有利于人類健康[5]。PHP含有的纖維不僅有助于降低人類高血脂、高血壓和血清總膽固醇水平，而且有助于提高腸道功能，預(yù)防結(jié)腸癌及其他腸胃疾病的罹患病機(jī)率[6]。PHP的主要成分是一種陰離子多糖，其具有一般親水膠體所具備的良好增稠性、保水性和膠凝特性，在食品中可替代傳統(tǒng)的親水膠體[7]。圓苞車前子多糖主要由阿拉伯木聚糖和木糖殘基組成，阿拉伯木聚糖由阿拉伯糖、木糖和其他糖組成。由于阿拉伯木聚糖可以在水中形成強(qiáng)凝膠，因此PHP可以增加連續(xù)相的黏度，抑制聚結(jié)，并提高水包油乳液的一致性和物理穩(wěn)定性[8]。食用圓苞車前子不僅能降低高血脂、高血壓和膽固醇，還能降低糖尿病患者的血糖水平并減少冠心病的發(fā)生[9]。本研究旨在制備穩(wěn)定的PHP-大豆油-酪蛋白酸鈉乳液，通過測定乳化穩(wěn)定性指數(shù)、粒徑、流變性能、表面蛋白含量、激光共聚焦掃描顯微鏡和冷凍掃描電鏡等指標(biāo)對PHP乳液的穩(wěn)定性和乳化性能進(jìn)行評價，探討不同PHP添加量對乳液穩(wěn)定性和微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期為制備蛋白穩(wěn)定乳液替代動物脂肪在肉品工業(yè)應(yīng)用提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圓苞車前子殼粉，上海味慶生物科技有限公司；金龍魚牌大豆油，南京江寧區(qū)蘇果超市；食品級酪蛋白酸鈉，鄭州塔博商貿(mào)有限公司；尼羅紅、尼羅藍(lán)，上海西格瑪-奧利奇公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA C-MAG HS7 磁力攪拌器、Turrax T18 Basic高速勻漿機(jī)，德國IKA公司；Avanti J-E落地式高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Turbiscan分析儀，法國Formulaction公司；Masterizer 3000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；MCR301旋轉(zhuǎn)流變儀，奧地利安東帕(中國)有限公司；LSM 700 META 激光共聚焦顯微鏡，德國卡爾蔡司有限公司；冷凍電鏡，日本日立有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PHP水包油乳液的制備

按照以下方法制備乳液：在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的PHP水包油乳液。將PHP加蒸餾水充分溶脹，得到0.3%、0.5%、0.7%、0.9% PHP水溶液。在PHP水溶液中加入30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)大豆油和2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)酪蛋白酸鈉，并使用高速均質(zhì)機(jī)在4 ℃下12 000 r/min均質(zhì)30 s，均質(zhì)3次，每次中間間隔30 s。

1.3.2 乳液的貯藏穩(wěn)定性

取15 mL新鮮制備乳液置于20 mL透明西林瓶(27 mm×57 mm)內(nèi),加蓋密封，在4 ℃的冰箱內(nèi)貯藏，觀察乳液在2 h、1、3、5、7 d的分層情況，并用數(shù)碼相機(jī)拍照觀察乳液貯藏期間的分層情況。

1.3.3 乳液的乳化穩(wěn)定性指數(shù)(turbiscan stability index，TSI)

根據(jù)WANG等[10]的方法稍作修改，將新鮮制備的乳液置于用于分析乳化穩(wěn)定性指數(shù)的玻璃瓶內(nèi)，在常溫25 ℃下靜置30 min后，使用穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行分析。掃描時間為30 min，分析儀每30 s掃描1次，測量溫度為25 ℃。通過穩(wěn)定性分析儀自帶的TurbiscanEasysoftLab 2.0軟件計(jì)算分析。

1.3.4 乳液粒徑大小及分布

乳液顆粒大小及分布通過Mastersizer 3000激光粒度分析儀測定，記錄乳液中油滴體積質(zhì)量等效平均直徑(D4,3)。分析模式為濕法進(jìn)樣，顆粒折射率為1.520，吸收率為0.001；分散介質(zhì)為水，分散劑折射率為1.330。

1.3.5 乳液流變特性

乳液流變特性由MCR301旋轉(zhuǎn)流變儀測定，轉(zhuǎn)子型號為PP50，測定溫度為25 ℃，間隙設(shè)置為0.5 mm。穩(wěn)態(tài)測定在小幅度范圍內(nèi)進(jìn)行(0.01～10 s-1)。

1.3.6 乳液光學(xué)顯微鏡觀察

取2滴乳液樣品直接滴在玻璃載玻片上，小心地蓋上蓋玻片，確保沒有氣泡。選擇有代表性的區(qū)域在20倍目鏡上觀看，并使用照相機(jī)拍攝圖像。所有樣品均在25 ℃下觀測。

1.3.7 乳液激光共聚焦顯微鏡觀察

根據(jù)龍肇[11]的方法稍作修改，乳液中脂肪與蛋白質(zhì)的分布可通過熒光染料染色觀察。每毫升乳液加入各40 μL 0.01%熒光染料[V(尼羅藍(lán))∶V(尼羅紅)=1∶1]充分混勻，在4 ℃黑暗條件下孵育6 h。隨后滴加到載玻片上，并附上蓋玻片于20×目鏡下觀察。2種染料的激發(fā)波長分別為514 nm (尼羅紅)，633 nm (尼羅藍(lán))。

1.3.8 乳液冷凍電鏡觀察

將新鮮乳液用蒸餾水稀釋10倍，取2滴乳液轉(zhuǎn)移到平板上，使用載玻片覆蓋并立即冷凍在液氮中。然后將乳液升華20 min，最后在加速電壓為3 kV條件下用掃描電鏡采集微觀形貌圖像。

1.3.9 乳液表面蛋白含量測定

水包油乳液表面蛋白含量測定參照LONG等[12]方法并稍作修改。乳液于0 ℃ 10 000×g離心30 min。乳化層中總蛋白含量為乳液制備過程所用蛋白與凱氏定氮法測定的下清液中蛋白含量之差。表面積結(jié)果使用Mastersizer 3000測定。表面蛋白含量計(jì)算如公式(1)所示：

表面蛋白含量=(總蛋白含量/表面積)×1 000

(1)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Origin 8.5軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，采用SAS 8.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個處理組均做4個重復(fù)。平均值的差異比較采用鄧肯的多重比較，差異顯著性通過t-檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液貯藏穩(wěn)定性

乳液分層是從宏觀上反應(yīng)乳液是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)之一，乳液分層反映乳液中水和油的聚集和分離狀態(tài)，較大的分層代表更多的聚集[13]。由圖1可知，在貯藏2 h后，與空白對照組對比，0.3%、0.5%的PHP乳液發(fā)生較小分層，并且隨著濃度的上升，乳液下部的乳清層越來越少。在4 ℃冰箱內(nèi)貯藏7 d后，與低添加量的PHP乳液相比，添加0.7%PHP能顯著降低乳液分層，抑制相分離的發(fā)生，這是由于PHP添加量高于0.7%時，體系內(nèi)黏度顯著上升，乳液內(nèi)部形成了弱凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而抑制流體流動，分層大大降低。含多糖的乳液具有極好的物理穩(wěn)定性，高濃度的PHP有利于乳液的貯藏穩(wěn)定性，可能由于多糖可增加乳液體系的黏度，減少液滴碰撞，抑制絮凝分層現(xiàn)象[14]。

2.2 乳液TSI

通常使用TSI參數(shù)來評估新鮮乳液的整體穩(wěn)定性，較大的TSI值表明乳液不穩(wěn)定[15]。由圖2可知，隨著掃描時間的變化，同一PHP添加量乳液體系的穩(wěn)定性隨著貯存時間的延長而逐漸降低，乳液體系的TSI值逐漸增大。在同一掃描時間下，對比不同PHP添加量的乳液，其TSI值隨著PHP濃度減少而減小，0.7%、0.9%PHP乳液的TSI值很接近。表明相較于低濃度的PHP乳液，高濃度的PHP乳液可以提高乳液的乳化穩(wěn)定指數(shù)。

2.3 乳液粒徑大小及分布

乳液的穩(wěn)定性可以通過乳液粒徑大小和分布來表征，D4,3越小粒徑分布越向較小尺寸移動，其乳化能力越好[16]。由圖3可知，乳液體系的平均粒徑隨著PHP濃度的增加而減小，空白對照組與其他添加PHP的乳液的粒徑大小存在顯著性差異(P<0.05)，0.7%、0.9%PHP乳液的平均粒徑無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 不同濃度的PHP乳液的平均粒徑Fig.3 The particle size of the fresh emulsions with different levels of PHP注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

從圖4粒徑分布圖中可以看到，隨著PHP濃度的增加，乳液粒徑分布的峰值逐漸向左移動，向較小的液滴尺寸靠近。這可能是因?yàn)?，高濃度的PHP可以增加酪蛋白酸鈉對乳液的吸附量，降低油水兩相的界面張力，提高了乳液體系的黏度，并降低了液滴的絮凝速率，限制油滴移動[17]，PHP對減小體系的粒徑大小有積極作用。這一結(jié)果與后文的激光共聚焦表征結(jié)果互相佐證。

圖4 不同濃度的PHP乳液粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of the fresh emulsions with different levels of PHP

2.4 乳液流變特性

由圖5可知，隨著剪切速率的增加，與空白對照組相比，添加PHP乳液的黏度隨著剪切速度的增大，急劇下降，黏度的變化和剪切速度呈現(xiàn)相反的趨勢，說明這是一種典型的假塑性流體[18]。同時可以看到，在相同的剪切速率下，高濃度PHP乳液的黏度比低濃度PHP乳液的黏度高。乳液的黏度和連續(xù)相的黏度成正比，連續(xù)相的黏度變化對整個體系黏度變化有相應(yīng)的影響[19]。PHP能夠顯著增加乳液體系的黏度，這是因?yàn)樵诟邼舛萈HP的作用體系中，其纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會包裹一定量的連續(xù)相水，減少乳液絮凝，引起PHP富集區(qū)的有效體積增大，從而引起表觀黏度增大。添加PHP可以增加乳液的相互作用，使一個小分子油滴同時結(jié)合多個蛋白質(zhì)分子，形成更大的聚集體[20]。

圖5 不同濃度的PHP乳液的表觀黏度Fig.5 The apparent viscosity of the fresh emulsions with different levels of PHP

2.5 乳液的光學(xué)顯微鏡觀察

由圖6可知，0%、0.3% PHP乳液的油滴粒徑較大，兩兩液滴之間距離較大，而0.5%～0.9%PHP乳液的液滴排列較為緊密，并且油滴大小隨著PHP的濃度增大而減小，這一結(jié)果與前文Masterizer 3000激光粒度儀測定的結(jié)果一致。這說明在較低的PHP濃度下，脂肪球重新聚結(jié)是產(chǎn)生大粒徑的主要因素，而PHP的添加增加了酪蛋白酸鈉的界面活性，使其有效依附于新形成的油-水界面抵抗脂肪球聚結(jié)。0.7%、0.9% PHP乳液的液滴粒徑幾乎沒有差別，可以推斷，若再增加PHP濃度，可能會出現(xiàn)液滴絮凝，油滴粒徑增大現(xiàn)象，這可能是由于高濃度的陰離子多糖聚合物的界面共享導(dǎo)致液滴橋連[21]。

a-0%；b-0.3%；c-0.5%；d-0.7%；e-0.9%圖6 不同濃度PHP新鮮乳液在光學(xué)顯微鏡照片(×100倍)Fig.6 The optical micrographs of the fresh emulsions with different levels of PHP

2.6 乳液激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

激光共聚掃描顯微鏡表征了PHP、酪蛋白酸鈉和油脂分布及相互作用。結(jié)果如圖7所示，紅色代表被尼羅紅染色的大豆油，綠色為被尼羅藍(lán)染色的PHP和酪蛋白酸鈉。隨著PHP濃度增大，PHP增加了蛋白質(zhì)在液滴表面的吸附量，且PHP均一的分布在連續(xù)相中，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到，不添加PHP的乳液液滴較大，隨著PHP濃度增加，乳化液滴逐漸減小。值得注意的是，隨著PHP濃度增大，連續(xù)相中的纖維素復(fù)合結(jié)構(gòu)增強(qiáng)，變得更加緊密，PHP和酪蛋白酸鈉包裹著液滴，從而削弱液滴與液滴之間的作用力。有研究報(bào)道，非晶纖維素通過皮克林乳液形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)機(jī)制吸附在液滴表面，防止絮凝和聚結(jié)的發(fā)生從而達(dá)到穩(wěn)定乳液的目的[22]。

a-0%；b-0.3%；c-0.5%；d-0.7%；e-0.9%圖7 不同濃度PHP新鮮乳液激光共聚焦照片F(xiàn)ig.7 The CLSM micrographs of the fresh emulsions with different levels of PHP

2.7 乳液冷凍電鏡觀察

冷凍掃描電子顯微鏡更加細(xì)致地顯示了乳液中油滴與PHP和酪蛋白酸鈉的三維空間關(guān)系。由圖8可知，隨著PHP濃度的增加，三者的空間結(jié)構(gòu)變得更加緊密，相較于其他網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，添加0.7%、0.9%PHP乳液更穩(wěn)定，油滴被包裹在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。這可能是由于酪蛋白酸鈉具有典型兩親結(jié)構(gòu)，因而表現(xiàn)強(qiáng)的界面活性，將PHP添加到蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液中，可通過改變連續(xù)相的連續(xù)特性或形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抑制相分離或重力引起的分層。還有可能是因?yàn)槔业鞍姿徕c與陰離子多糖PHP之間以疏水作用或靜電力主導(dǎo)的相互作用發(fā)生吸附，從而使酪蛋白酸鈉逐個排布于PHP分子鏈的骨架上，這一結(jié)果與KOBORI等[23]的研究的結(jié)果一致。

a-0%；b-0.3%；c-0.5%；d-0.7%；e-0.9%圖8 不同濃度PHP新鮮乳液的冷凍電鏡顯微照片F(xiàn)ig.8 The cryo-SEM micrographs of the fresh emulsions with different levels of PHP

2.8 乳液表面蛋白含量

蛋白通過與乳液體系中其他親水性膠體或者小分子乳化劑發(fā)生競爭吸附或者協(xié)同交互作用，從而影響乳液的穩(wěn)定性。在乳液的乳化過程中，蛋白質(zhì)迅速從連續(xù)相吸附到新形成的小油滴表面上，阻止液滴間重新聚結(jié)，保持乳液穩(wěn)定[24]。表面蛋白含量受乳液表面蛋白吸附含量和表面積的影響。隨著PHP濃度的增加，蛋白吸附含量顯著增加，粒徑顯著減小而表面積顯著增加(圖9)。PHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0%增加到0.9%，表面蛋白含量相應(yīng)的從8.83 mg/m2增加到15.91 mg/m2。同時0.7%、0.9%PHP乳液的表面蛋白含量不存在顯著性差異(P>0.05)?；谝陨涎芯?，添加高于0.5%的PHP可提高蛋白質(zhì)在液滴表面的吸附作用。這可能是由于高濃度的陰離子多糖與酪蛋白酸鈉之間的靜電力作用，減弱了吸附過程分子間的排斥力，從而促使更多蛋白質(zhì)在界面的吸附[25]。此結(jié)果與粒徑分布和微觀觀察結(jié)果均一致。

圖9 不同濃度PHP新鮮乳液的表面蛋白含量Fig.9 The surface protein content of the fresh emulsions with different levels of PHP

3 結(jié)論

PHP具有良好的乳化穩(wěn)定性能。質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.5%時，乳化分層現(xiàn)象得到抑制。PHP濃度為0.7%、0.9%時，PHP的乳化穩(wěn)定性指數(shù)較高、粒徑較小，且0.7%、0.9% PHP乳液的平均粒徑無顯著差異，貯藏1周后乳化穩(wěn)定性保持不變。PHP具有增加連續(xù)相黏度的能力，減少液滴碰撞，從而減少絮凝和聚結(jié)，與酪蛋白酸鈉協(xié)同作用，減弱分層現(xiàn)象的發(fā)生。穩(wěn)定的乳液體系中PHP最佳添加量為0.7%、酪蛋白酸鈉2%、大豆油30%。關(guān)于PHP陰離子多糖與酪蛋白酸鈉相互作用的具體影響機(jī)制尚不明確，兩者相互作用后對乳液乳化穩(wěn)定性的影響有待進(jìn)一步研究。