高效液相色譜法檢測辣椒、花椒粉中五種合成色素

鈕怡清

(上海市食品研究所，上海，200235)

香辛料主要是指一類具有芳香、辛辣等典型風味的天然植物制品。在古時，人們就開始在飲食中使用一些具有刺激性的芳香植物，其精油含量較高，有強烈的呈味、呈香作用，不僅能促進食欲，改善食品風味，還具有抗氧化的作用。香辛味香料種類繁多，其中，有熱感和辛辣感的香料主要包含辣椒、胡椒、花椒等。食用色素又稱食品著色劑，消費者可適量食用，其在一定程度上能改變食品原有顏色的食品添加劑，分為天然著色劑和合成著色劑兩大類[1]。合成著色劑由苯、甲苯和萘等化工產(chǎn)品經(jīng)化學合成而制成[2]，因其具有色澤鮮艷、著色力強、顏色多樣、價格低廉等優(yōu)點，在現(xiàn)代食品工業(yè)中應用廣泛。然而，合成色素中含砷、鉛、銅、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸鹽，大量食用會對人體造成不同程度的危害，可能導致生育力下降，增加人體的致癌率，加重或惡化多動癥癥狀。近年來，因非法添加合成色素而引發(fā)的食品安全事件屢見不鮮，如辣椒制品中的蘇丹紅、香辛料中的羅丹明B[3]、香腸中的胭脂紅等。

目前，食品中非法使用合成色素的現(xiàn)象主要包括3種情況，即超標、超范圍和非法使用添加物，為此，各國都建立了嚴格的法律法規(guī)加以規(guī)范。我國GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》對食品中允許使用的合成色素種類、使用范圍和限量進行了詳細的規(guī)定。食品中合成色素的檢測技術多種多樣，包括分光光度法[4]、酶聯(lián)免疫法[5-6]、薄層色譜法[7]、拉曼光譜法[8-9]、毛細管電泳法[10-11]、示波極譜法[12]、以及HPLC[13-14]。相較于其他方法，HPLC分離效果好、靈敏度高、應用范圍廣[15]、檢測低限低。國內(nèi)對檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃及誘惑紅這5種色素主要依據(jù)標準GB/T 5009.35—2016、SN/T 1743—2016，采用HPLC法進行檢測。香辛料產(chǎn)品基質(zhì)復雜，油脂含量高，粉末細膩，常用的前處理方法為溶劑提取法[16-17]、聚酰胺吸附法[18-20]和固相萃取法[21-24]。溶劑提取法操作簡單，但提取率低，對復雜基質(zhì)的樣品提取不完全；聚酰胺吸附法操作繁瑣，含大量脂肪和大分子的物質(zhì)還需要經(jīng)葡聚糖凝膠色譜進一步凈化。更為重要的是，這2種方法均不適用于香辛料類產(chǎn)品，因此，有必要建立一種簡單、準確、有效的樣品前處理方法對香辛料中合成色素進行檢測。

本文結(jié)合樣品基質(zhì)特點，通過研究香辛料中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅5種合成著色劑的前處理方法，建立了由正己烷脫脂，乙腈-水除雜，聚酰胺固相萃取柱凈化富集，乙醇-氨水-水提取色素的前處理方法。本檢測方法高效、準確、可操作性強，為今后復雜基質(zhì)中多種合成著色劑的提取檢測和標準制定提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標準品

檸檬黃、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、亮藍標準品，中國計量科學研究院，質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL。

1.2 材料與儀器

實驗材料：香辛料來源于市售，均質(zhì)后室溫貯藏；甲醇、乙腈(色譜純)，德國默克公司；乙酸銨(色譜純)、聚酰胺粉小柱，美國Cleanert；所有實驗室用水為一級水。

實驗儀器：U3000高效液相色譜儀，Thermo Fisher公司；CT14RD高速冷凍離心機，TECHCOMP公司；氮吹儀，ANPEL公司。

1.3 儀器條件

高效液相色譜條件：色譜柱：Waters Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：35 ℃；檢測器：二極管陣列檢測器，掃描范圍：400～800 nm；流動相A為乙酸銨溶液(0.2 mol/L)，流動相B為甲醇；流速：1.0 mL/min，進樣量10 μL；采用的梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program of LC

1.4 樣品提取

稱取2.000 g樣品置于50 mL刻度離心管中，加入20 mL正己烷，渦旋振蕩5 min，4 000 r/min離心 5 min，棄去正己烷層，再用正己烷重復脫脂3次。脫脂后的樣品置于70 ℃水浴揮干殘留的正己烷。向樣品中加入10 mL乙腈-水(體積比,9∶1)溶液，超聲30 min，離心取上清液，用乙腈-水溶液重復提取2次，合并提取液，70 ℃水浴氮吹干；向上述樣品中再加入10 mL水提取，重復提取直至提取液無色或近無色，將水層合并至氮吹干的乙腈提取液離心管中，渦旋混勻。將上述溶液全部置于聚酰胺固相萃取小柱凈化，待試樣全部流出后，依次用 6 mL 0.5%(體積分數(shù))甲酸-甲醇溶液，6 mL水清洗，棄去全部流出液，抽干。用6 mL乙醇-氨水-水(體積比，7∶2∶1)洗脫，收集洗脫液，置80 ℃水浴氮吹至干，用1 mL水渦旋定容，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后供液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

由于香辛料基質(zhì)復雜，油脂含量大，粉末細膩，對后期聚酰胺小柱過柱效率影響極大，提取液的選擇對5種色素的提取效率影響顯著。本實驗以花椒粉(n=30)為預實驗對象，考察了：(1)丙酮-水(體積比，8∶2)；(2)乙腈-水(體積比，9∶1)；(3)純水；(4)丙酮-水和水2次提??；(5)乙腈-水和水2次提取對加標回收樣品的提取效果。5種提取方法對檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅的加標回收見表2。

表2 不同提取方法對5種合成色素的加標回收率 單位：%Table 2 Recoveries of five synthetic pigments by different extraction methods

由表2可見，水對檸檬黃、日落黃的提取效果較好，乙腈水對莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅的提取效果最優(yōu)，因此，選取乙腈水+水2次提取的方式進行優(yōu)化研究。

2.2 檢測波長的選擇

使用二極管陣列檢測器，被測物質(zhì)的定性分析不僅可以通過保留時間進行確定，還可通過光譜吸收曲線的模式圖形狀、最大吸收波長、峰純度分析等參數(shù)進行輔助定性分析，以提高高效液相色譜的定性分析能力，采用分段掃描的方式，使每一種合成色素出峰處都處于其最大吸收波長處。各組分的最大吸收波長如表3所示，液相色譜圖如圖1所示。

表3 五種合成色素的最大吸收波長Table 3 The maximum absorbance wavelength of five synthetic pigments

圖1 五種合成色素的混合標準品色譜圖(質(zhì)量濃度為10 μg/mL)Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard (10 μg/mL)

2.3 方法驗證

采用空白基質(zhì)(辣椒、花椒粉)加標回收的方式對上述樣品前處理過程及液相條件進行方法驗證。依照GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[25]從檢出限(limits of detection，LOD)、定量限(limit of quantitation，LOQ)、線性(r)、準確度(加標回收率)、精密度(重現(xiàn)性，RSD)對方法進行評估。其中，以定性離子通道信噪比(S/N)為3時樣品溶液種目標化合物的質(zhì)量濃度為LOD。

2.3.1 線性關系與檢測低限

由于本研究方法為外標定量法，以峰面積為縱坐標，目標化合物濃度為橫坐標進行線性回歸，結(jié)果如表4所示，5種合成色素的相關性系數(shù)(r)均大于0.999，濃度范圍內(nèi)線性關系良好。表4中同樣列出了方法的LOD。

表4 五種合成色素線性相關系數(shù)和檢出限Table 4 r values of the matrix-matched calibration curves, supplemented with limits of detection (LOD) for all analytes

2.3.2 回收率與精密度

在空白辣椒、花椒粉樣品中添加3個濃度水平的合成色素混合標準溶液，每個添加水平6個平行樣品，計算回收率和精密度，結(jié)果見表5。辣椒樣品中色素添加量為0.5～5 mg/kg時，回收率為66%～92%、相對偏差(RSD)為1.5%～7.7%，說明方法準確性、精密度良好。

表5 方法、回收率及精密度(n=6)Table 5 Relative abundance ratio deviatio, recovery and precision of the method (n=6)

2.4 市售香辛料中5種合成色素含量分析

在優(yōu)化、驗證了前處理方法和儀器條件后，對市售辣椒、花椒粉(n=70+35)進行了采樣并處理分析。結(jié)果表明，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅在105個樣本中均未檢出，暴露水平低。通過平行樣品的測定發(fā)現(xiàn)，此方法重現(xiàn)性好、準確度高、靈敏度強，能滿足日常對于香辛料中合成色素檢測的需求。

2.5 本文方法與國標方法的差異性討論

目前，對食品中合成色素的檢測主要依據(jù)GB 5009.35—2016[26]，但該法適用的食品種類不包含辣椒、花椒粉，故前處理過程無脫脂、去油的過程，僅使用溫水溶解，采用聚酰胺粉吸附色素，最后用水定容。圖2為空白辣椒樣品(圖2-a)、加標樣品按國標法提取(圖2-b)、相同加標量加標樣品按本文前處理方法提取(圖2-c)的液相色譜圖。由圖2可知，按照國標法處理辣椒樣品，回收率僅有20%，對5種合成色素的提取率極低，同時雜質(zhì)提取不完全也會對檢測器和色譜柱產(chǎn)生較大的損傷；而使用本文的前處理方法則能很好地去除樣品中的雜質(zhì)，采用聚酰胺小柱替代聚酰胺粉，使實驗過程更簡單，避免了重復洗脫的過程，縮短了實驗時長，同時大大提高了5種合成色素的回收率(70%～80%)。

a-樣品；b-國標法加標回收；c-本方法加標回收圖2 樣品、國標法加標回收、本方法加標回收的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample, extracted by GB 5009.35—2016, extracted by n-hexane, CN and water

3 結(jié)論

本研究采用HPLC法對國產(chǎn)市售辣椒、花椒粉中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅5種合成色素進行了檢測，使用正己烷脫脂的方法，降低油脂對小柱凈化的影響，以乙腈-水和水2次提取合并提取液的方法，提高了提取效率，采用外標法定量，效果良好。本方法可以準確檢測香辛料中合成色素的含量水平，方法檢出限為0.5 mg/kg，滿足國內(nèi)外的檢測要求，并可適用于其他復雜基質(zhì)的多種合成色素的檢測，為食品安全檢測和風險監(jiān)測工作提供技術支持。