HPLC測定花椒粉中羅丹明B含量的不確定度評定

聶磊　汪永信　殷俊峰

摘要 根據《食品中羅丹明B的測定》（BJS 201905）方法規(guī)定的前處理方式，采用外標法，HPLC進樣，對花椒粉中羅丹明B的含量進行不確定度評定。參照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，建立測量模型，對整個測量過程中不確定度的來源進行了分析。結果表明，不確定度主要來源于樣品稱量、體積的量取、重復性和回收率、標準曲線及標準曲線擬合過程等因素。

關鍵詞 花椒粉;羅丹明B;不確定度;HPLC

中圖分類號 TS 202.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）16-0195-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.055

Uncertainty Evaluation on Determination of Rhodamine B in Pepper Powder by HPLC

NIE Lei1，WANG Yong-xin1，YIN Jun-feng2 （1.Anhui Food and Drug Inspection Institute， Hefei， Anhui 230051;2.Agro-Products Processing Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031）

Abstract According to the pretreatment method specified in the Determination of rhodamine B in Foods （BJS 201905） method， the external standard method and HPLC sampling were used to assess the uncertainty of Rhodamine B content in pepper powder.Refer to JJF 1059.1-2012 Measurement Uncertainty Evaluation and Representation to establish a measurement model and analyze the sources of uncertainty in the entire measurement process.The results showed that the major influential factors of uncertainty were caused by sample weighing， volume measurement， repeatability and recovery rate， standard curve and standard curve fitting process.

Key words Pepper powder;Rhodamine B;Uncertainty;HPLC

作者簡介 聶磊（1970—），男，安徽長豐人，高級工程師，碩士，從事食品安全檢驗技術與研究工作。

收稿日期 2020-07-01

花椒粉是一種由花椒制成的調味料，在人們的日常烹調中經常會使用，特別是紅花椒加工而成的花椒粉，因其獨特的色澤和香味，更加受到青睞。有報道不法分子為追求利潤，使用羅丹明B對花椒染色，以次充好[1]。羅丹明 B（rhodamine B，RB）又稱玫瑰紅 B[2] ，是一種人工合成堿性熒光染料，易溶于水、乙醇，微溶于丙酮、氯仿。有研究表明，攝取、吸入以及皮膚接觸羅丹明 B均會造成急性或慢性的中毒傷害[3-4] ，它會引起不同程度的頭痛、頭暈、惡心等中毒癥狀[5-6] ，有一定致癌性[7]。因此對于花椒粉中羅丹明B的檢測意義重大。然而，在化學分析過程中由于誤差的存在，測量結果與實際值往往存在一定的偏離，因此需要對測量結果的不確定度評定進行評定，使測量結果更加準確可靠。筆者采用《食品中羅丹明B的測定》（BJS 201905）[8]方法，測定花椒粉中羅丹明B的含量，從多個角度分析測量不確定度產生的原因，對測定結果進行評定和表述。

1 材料與方法

1.1 試材 花椒粉，市售商品。 羅丹明B，固體，純度98.6%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司產品。甲醇、乙腈，色譜純，天地公司產品;其他試劑均為分析純;水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。固相萃取柱，Waters公司產品;ZORBAX SB-C18柱，Agilent公司產品。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀，島津LC20-AD（配備熒光檢測器）;AT100電子天平，梅特勒（0.1? mg）;渦旋振蕩儀，IKA MS 3digital;移液器，美國GILSON。

1.3 標準品儲備液及標準系列配制

準確稱取羅丹明B標準物質10.0 mg，用甲醇溶解、定容至100 mL容量瓶中（A級）， 配制100 μg/mL羅丹明B標準儲備液。用移液管準確移取1 mL標準儲備溶液，再用甲醇定容于100 mL A級容量瓶中，配制1 μg/mL羅丹明B標準中間溶液。最后使用20、100、1 000 μL移液器分別移取10、50、100、500、1 000 μL標準中間溶液于10 mL A級容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，得到質量濃度分別為1、5、10、50、100 μg/L的羅丹明B標準系列工作溶液。

1.4 樣品制備

按照BJS 201905的分析方法進行：準確稱取2 g花椒粉樣品，加入約10.0? mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液，于旋渦混勻器上渦旋混勻15 min，于9 000 r/min離心10 min，取提取液層溶液過0.22 μm有機相濾膜后待凈化。準確移取5.0 mL提取液至固相萃取柱凈化，收集洗脫液，氮吹干，用1 mL流動相溶解殘渣，過濾膜，供儀器分析，外標法定量。

1.5 數(shù)學模型的建立 按照BJS 201905的測定方法計算結果，待測物的含量按式（1）計算：

式（1）中，C為從標準工作曲線中讀出的試樣溶液中待測物的質量濃度（μg/L）;V為試樣溶液最終定容體積（mL）;m為稱樣量（g）;X為試樣中待測物的含量（mg/kg）。

由測量模型可看出，影響測定結果不確定度urel（X）的主要因素有待測物濃度產生的不確定度urel（C）、稱量樣品過程中產生的不確定度urel（m）、樣品定容體積產生的不確定度urel（V）、試驗重復性產生的不確定度urel（）、待測物回收率產生的不確定度urel（R）。由此得到試樣中被測物的殘留量的相對標準不確定度urel（X）可由（2）式計算：

2 結果與分析

2.1 試樣稱量過程中產生的不確定度urel（m）

使用去皮稱量，稱取約2.00 g花椒粉樣品，查看天平的檢定證書，最大允許誤差為±0.01 g，按照矩形分布，其不確定度u（m）=最大允許誤差/3=0.005 8 g;urel（m）=u（m）/m=0.000 11。

2.2 體積量取產生的不確定度urel（V）

量取體積產生的不確定度主要原因為最后定容體積引起的不確定度。試樣凈化液經氮吹濃縮后，用1.0? mL分度吸量管吸取1.0? mL的流動相溶解殘渣。A級1.0? mL分度吸量管最大允許誤差為±0.008? mL，按矩形分布考慮，則樣品定容引入的相對標準不確定度為

urel（V）=0.004 62。

2.3 待測物產生的不確定度

待測物產生的不確定度主要來源于2個因素，分別是標準系列溶液配制過程中產生的不確定度和由標準曲線擬合時所產生的不確定度。其中標準系列溶液配制包括儲備液配制、稀釋和標準曲線溶液配制3個部分[9-10]。

2.3.1 儲備液配制過程引入的不確定度urel（C1）。

（1）由標準證書可知，羅丹明B標準品純度為98.6%，最大允許誤差為 ±0.5%，

按均勻分布，k=3，其引入的相對標準不確定度為urel（p）=最大允許誤差/k×98.6%=0.009 3。

（2）根據稱量所使用天平檢定證書，可知其最大允許誤差為±0.2 mg，按均勻分布，k=3，校準物質稱量為10.0 mg，則校準物質稱量引入的不確定度為u（m標）=最大允許誤差/k=0.115 47，則天平稱量過程中引入的相對標準不確定度為urel（m標）=u（m標）/5.0=0.023 09。

（3）標準儲備液是將固體標準物質使用甲醇溶解，并定容至100 mL棕色容量瓶。容量瓶產生的相對不確定度，根據JJG 196—2006《常用玻璃量器 檢定規(guī)程》的要求，100 mL單標容量瓶（A級），允許最大誤差為±0.10 mL，按照均勻分布，k=3，則容量瓶產生的相對不確定度為urel（V標）=最大允許誤差/k×100=0.000 58;甲醇的膨脹系數(shù)為1.1×10-3/℃，允許溫差±5 ℃，溫度產生的相對不確定度為urel（T標）=允許溫差×膨脹系數(shù)/k=0.003 18。

因此，儲備液配制過程產生的不確定度為urel（C1）=[u2rel（p）+ u2rel（m標）+ u2rel（V標）+ u2rel（T標）]1/2=0.009 8。

2.3.2 儲備液稀釋過程引入的不確定度urel（C2）。

分別用1 mL 移液管準確移取1 mL羅丹明B（100 μg/mL）標準儲備溶液于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制質量濃度為1 μg/mL的羅丹明B中間儲備溶液[11]。按照矩形分布來處理，參考GB/T 12806—2011和JJG 196—2006的要求，按A類評定，玻璃器皿及溫度波動產生的不確定度見表1;則儲備液稀釋過程中產生的不確定度按urel（C2）=

urel（V1）2+u（V100）2計算。

2.3.3 標準系列溶液配制過程產生的不確定度urel（C3）。

使用20、100、1 000 μL移液器分別移取10、50、100、500、1 000 μL? 1 μg/mL羅丹明B中間儲備溶液于10 mL容量瓶中，用流動相溶液定容至刻度，得到質量濃度分別為1、5、10、50、100 μg/L 的羅丹明B標準系列工作溶液。移液器的刻度誤差參考JJG 646—2006標準要求，按照A類進行評定，如表2所示。因移液量較小可忽略環(huán)境溫度變化對體積刻度的影響，僅考慮體積校準引入的不確定度。10 mL容量瓶使用了6次，水的膨脹系數(shù)β水=1.8×10-3，溫度引起的不確定度為0.003 16。則標準系列溶液配制過程中產生的不確定度為urel（C3）=[urel（V0.01）2+urel（V0.05）2+urel（V0.1）2+urel（V0.5）2+urel（V1.0）2+urel（V10）2×6]12 =0.005 2。

2.3.4 標準曲線擬合產生的不確定度urel（C4）。將甲醇溶液配制的5種不同質量濃度的羅丹明B標準系列工作溶液，各取10 μL進樣，以標準溶液濃度（Ci）為橫坐標、峰面積（Ai）為縱坐標繪制標準曲線，擬合而成的線性回歸方程（采用最小二乘法）為Ai=aCi+b，測定數(shù)據及計算結果如表3所示。取花椒粉陽性樣品，按BJS 201905方法對樣品中羅丹明B含量（C0）進行重復測定6次，其結果見表4，則由標準曲線擬合產生的不確定度按式（3）計算：

式中，SR為標準溶液待測物峰面積產生的標準差;Ai為羅丹明B標準系列工作溶液中各點的待測物的峰面積;

p為對樣品羅丹明B含量（C0）的測定次數(shù)（p=6）;n為標準曲線的測

定點數(shù)（n=5）;

a為斜率;b為截距;Ci為羅丹明B標準系列

工作溶液各點的質量濃度;C0為樣品溶液中羅丹明B的質量濃度;

為羅丹明B標準系列工作溶液的平均質量濃度，=5i=1Ci/5。

相關數(shù)據見表3和表4，經計算，=213.2 μg/L，（C0-）=26 721.1，則SR=2 282，5i=1（Ci-）2=169 114.8，u（C4）=0.772 8 μg/L，則標準曲線擬合產生的相對不確定度urel（C4）=u（C4）/C0=0.015 5。

2.4 重復性產生的不確定度urel（）

對陽性樣品1花椒粉樣品平行測定6次，見表4。稀釋倍數(shù)為f=1，重復測定的含

量平均值=0.024 mg/kg，標準偏差S（）=0.000 53，不確定度u（）=S（）/6=0.000 22，則由重復性引起的相對不確定度urel（）=u（）/=0.089。

2.5 回收率產生的不確定度urel（R）

在空白花椒粉樣品中添加濃度水平為0.005 0 mg/kg羅丹明B標準物質的樣品2，平行測定6 次，稀釋倍數(shù)為f=1。測量回收率結果列于表5，則平均回收率=92.0%，標準偏差S（R）=0.000 51，不確定度u（R）=S（R）/6=0.000 21，相對不確定度urel（R）=u（R）/=0.000 23。

2.6 合成不確定度 若不考慮各不確定度的相關性，則羅丹明B的合成不確定度urel（X）=[urel（C）2+urel（）2+urel（R）2+urel（m）2+urel（V）2]12

計算，其中，urel（m）=0.000 11，urel（V）=0.004 62，urel（C1）=0.009 8，urel（C2）=0.006 0，urel（C3）=0.005 2，urel（C4）=0.015 5，urel（）=0.089，urel（R）=0.000 23，則urel（X）=0.008 4。

2.7 擴展不確定度

在95%置信區(qū)間，包含因子k=2，擴展不確定度U=urel（X）×2×=0.000 4 mg/kg，由此得到樣品1中羅丹明B含量為（0.024 0±0.000 4） mg/kg。

3 小結與討論

該研究按照《食品中羅丹明B的測定》（BJS 201905）方法，對HPLC法測定花椒粉中羅丹明B結果進行不確定度評定，參照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[12]，建立測量模型，分析了試驗過程中不確定度的來源和影響因素。評定結果顯示，不確定度主要由樣品稱量、體積的量取、重復性和回收率、標準曲線及標準曲線擬合過程等因素引入，其原因包括量具的選擇和使用、實驗室環(huán)境溫度的控制及試驗次數(shù)等。因此，在花椒粉中羅丹明B的檢測工作中，應重點從以下方面降低其不確定度，減少隨機誤差：①使用經檢定校準的天平和量具，并正確使用檢定校準因子;②保持實驗室環(huán)境條件的相對穩(wěn)定;③確定合理的測定次數(shù);④規(guī)范標準溶液配制的操作，減少樣品稱量、體積的量取、稀釋過程中產生的誤差。

該研究通過對花椒粉中羅丹明B檢驗的測量不確定度評定，有助于在依據《食品中羅丹明B的測定》（BJS 201905）開展的檢驗中，降低由誤差帶來的風險，提高檢驗的準確性，也為實驗室實施檢驗過程質量控制提供了必要的參考。

參考文獻

[1] 黎奎.重慶警方查獲上萬斤毒花椒 含致癌物質羅丹明B[N].重慶晚報， 2011-04-29.

[2] 盧士英，鄒明強.食品中常見的非食用色素的危害與檢測[J].中國儀器儀表，2009（8）：45-50.

[3] 陳艷美，于淼.羅丹明B染色食品對人體的危害及檢測[J].科學之友， 2011（18）：153，157.

[4] 林清荷，陳鑫，吳忠興.辣椒粉中羅丹明B液相色譜檢測方法的研究[J].農產品加工（學刊），2012（11）：157-158，164.

[5] MOOSAVI F，MOHABATKAR H，MOHSENZADEH S.Computer-aided analysis of structural properties and epitopes of Iranian HPV-16 E7 oncoprotein[J].Interdiscip Sci Comput Life Sci，2010，2（4）：367-372.

[6] 陳鋼，張紹祥，岳娟娟，等.攜 EGFP 的人Synoviolin基因慢病毒表達載體的構建與鑒定[J].免疫學雜志，2010，26（5）：448-451.

[7] LARSEN J C.Legal and illegal colours[J].Trends in food science & technology， 2008，19：S64-S69.

[8] 國家市場監(jiān)督管理總局.市場監(jiān)管總局關于發(fā)布《食品中羅丹明B的測定》等3項食品補充檢驗方法的公告 （2019年第9號）[A].2019-03-06.

[9] 李靜，張居舟，余曉娟，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定豆芽中植物生長調節(jié)劑殘留量的不確定度評定[J].食品科學，2019，40（10）：292-297.

[10] 劉柱，徐瀟穎，趙超群，等.同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物殘留量的不確定度評定[J].食品工業(yè)科技，2020，41（5）：206-214.

[11] 黃雪英，齊敏，沈丹，等.液質聯(lián)用法測定豬肝中β-受體激動劑殘留的不確定度評定[J].中國獸藥雜志，2015，49（1）：45-51.

[12] 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中國標準出版社，2012.