痛風(fēng)湯作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討

溫新麗,賀玉偉,薛曉梅,吳欣,賈兆通

(青島大學(xué),山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科；2 附屬醫(yī)院山東省代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 代謝病研究院)

近年來痛風(fēng)已經(jīng)成為繼糖尿病之后的第二大代謝系統(tǒng)疾病[1]。相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，痛風(fēng)病人已超過8 000萬人，而且病人人數(shù)以9.7%的年增長率增加[2]。痛風(fēng)的病理特征是尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)和組織中，進(jìn)而觸發(fā)免疫細(xì)胞引發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。其主要危險(xiǎn)因素是高尿酸血癥，即血清尿酸鹽水平升高。對于大多數(shù)痛風(fēng)病人來說，排泄不足是高尿酸血癥的主要原因[4]。痛風(fēng)如得不到及時(shí)有效的治療可能累及腎臟，導(dǎo)致痛風(fēng)性腎病，嚴(yán)重者出現(xiàn)腎功能不全等[5]。目前西醫(yī)治療可產(chǎn)生諸多副作用，如胃腸道反應(yīng)、皮疹、肝腎功能損傷等。此外，此類藥物不能預(yù)防、阻止或逆轉(zhuǎn)痛風(fēng)的進(jìn)程。中藥復(fù)方和從中草藥分離出的某些化合物已被用于治療痛風(fēng)，效果令人滿意[6]，并且不良反應(yīng)低于西藥[7]。痛風(fēng)湯是以土茯苓、萆薢、蒼術(shù)、生薏苡仁、威靈仙、蠶沙、地龍、澤瀉、桃仁、紅花組合形成基礎(chǔ)方，病人合并不同痛風(fēng)癥狀時(shí)加減不同藥材以控制癥狀[8]。痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)效果良好，無顯著毒副作用，復(fù)發(fā)率低[9]。目前尚無系統(tǒng)研究痛風(fēng)湯物質(zhì)基礎(chǔ)及其治療痛風(fēng)機(jī)制的報(bào)道。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示痛風(fēng)湯活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)，以探討其治療痛風(fēng)的機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 痛風(fēng)湯活性成分和對應(yīng)靶點(diǎn)的獲取

分別以“威靈仙”、“蒼術(shù)”、“薏苡仁”、“澤瀉”、“桃仁”、“紅花”、“土茯苓”、“粉萆薢”、“蠶沙”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php)[10]中，檢索獲得其化學(xué)成分；在檢索結(jié)果中限定口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為條件進(jìn)行篩選。同時(shí)在中國中藥整合數(shù)據(jù)庫(TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid)[11]平臺中以“地龍”為關(guān)鍵詞，檢索獲得其化學(xué)成分“蚯蚓素”。“蚯蚓素”的相應(yīng)靶點(diǎn)通過Similarity Ensemble Approach數(shù)據(jù)庫(SEA，http://sea.bkslab.org)[12]進(jìn)行預(yù)測。使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建痛風(fēng)湯的“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.2 痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)基因的獲取

在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(Genecards，https://www.genecards.org)中以“gout”為關(guān)鍵詞檢索與痛風(fēng)相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.3 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

所有的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)均來自STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)的分析結(jié)果。首先將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建痛風(fēng)湯靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)、痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)、痛風(fēng)湯和痛風(fēng)共同涉及的關(guān)鍵通路的PPI網(wǎng)絡(luò)。然后用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)預(yù)測痛風(fēng)湯某些成分的真實(shí)靶點(diǎn)。

1.4 KEGG信號通路富集分析

將痛風(fēng)湯靶點(diǎn)和痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)的基因名導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[13]進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，保存結(jié)果。選取滿足FDR<0.05的通路，并根據(jù) FDR值的大小繪制氣泡圖。

1.5 分子對接

應(yīng)用SwissDock(http://www.swissdock.ch)將FLT3(PDB ID:4rt7)、MAOA(PDB ID:2Z5X)分別與槲皮素、木犀草素進(jìn)行分子對接；選取NOS2(PDB ID:4NOS)、PTGS2(PDB ID:5ikq)與漢黃芩素進(jìn)行分子對接。對接結(jié)果通過PyMOL 1.7.0(美國Schr?dinger,LLC)展示。

2 結(jié) 果

2.1 痛風(fēng)湯“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

共從痛風(fēng)湯10味藥材中篩選出痛風(fēng)湯活性成分82個(gè)，活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)244個(gè)。通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建的痛風(fēng)湯“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見圖1。

綠色節(jié)點(diǎn)()代表痛風(fēng)湯的10味藥材；藍(lán)色節(jié)點(diǎn)()代表痛風(fēng)湯中的活性成分；紅色節(jié)點(diǎn)()代表痛風(fēng)湯活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。

2.2 痛風(fēng)湯作用靶點(diǎn)和痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將痛風(fēng)湯作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，獲取其PPI網(wǎng)絡(luò)的原始數(shù)據(jù)并保存，使用Cytoscape 3.7.1繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。剔除未與網(wǎng)絡(luò)連接的3個(gè)作用靶點(diǎn)，此網(wǎng)絡(luò)共包含了241個(gè)節(jié)點(diǎn)(圖2A)。靶點(diǎn)與靶點(diǎn)的連接度越高，重要性越強(qiáng)，顏色越趨向于紅色，且靶點(diǎn)的面積較大。因此，痛風(fēng)湯靶點(diǎn)中連接度最高的5個(gè)靶點(diǎn)分別為AKT1、ALB、IL-6、TP53和MAPK-3。對978個(gè)痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得了痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2B)。該網(wǎng)絡(luò)減去未結(jié)合的180個(gè)作用靶點(diǎn)，共包含798個(gè)痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)基因。痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)中連接度最高的5個(gè)靶點(diǎn)分別為IL-6、INS、GAPDH、TNF和ALB。

A：痛風(fēng)湯作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)；B：痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。靶點(diǎn)與靶點(diǎn)的連接度越高，重要性越強(qiáng)，顏色越趨向于紅色，且靶點(diǎn)的面積較大。

2.3 痛風(fēng)湯和痛風(fēng)涉及的細(xì)胞信號通路

通過KEGG通路富集分析找到痛風(fēng)湯涉及的26個(gè)重要信號通路(圖3A)和痛風(fēng)發(fā)病涉及的14個(gè)細(xì)胞信號通路(圖3B)。痛風(fēng)湯靶點(diǎn)通路與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)通路相互重疊的共同通路為4個(gè)，分別為Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。由于KEGG分析中Pathway in cancer的-Log10FDR值最大，因此Pathway in cancer對于痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)的機(jī)制是最重要的。

A：痛風(fēng)湯涉及的26個(gè)重要信號通路；B:痛風(fēng)發(fā)病涉及的14個(gè)細(xì)胞信號通路。

2.4 痛風(fēng)湯與痛風(fēng)涉及共同細(xì)胞信號通路的PPI網(wǎng)絡(luò)

從Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway共4個(gè)細(xì)胞信號通路中找到痛風(fēng)湯和痛風(fēng)均涉及的靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，找到各PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)(圖4)。Cytoscape分析中，靶點(diǎn)顏色越趨向紅色，且靶點(diǎn)面積越大，即被認(rèn)為關(guān)鍵程度越高。因此，Pathway in cancer通路中涉及的排名前5位的最關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為TP53、PTGS2、IL6、MAPK1和RELA。

靶點(diǎn)顏色越趨向紅色，且靶點(diǎn)面積越大，關(guān)鍵程度越高。

2.5 TP53及其對應(yīng)藥物活性成分真實(shí)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

痛風(fēng)湯中對應(yīng)TP53靶點(diǎn)的活性成分是土茯苓和紅花中的槲皮素(Quercetin)、紅花中的木犀草素(Luteolin)和蒼術(shù)中的漢黃芩素(Wogonin)。通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測到槲皮素的59個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)、木犀草素的25個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)和漢黃芩素的2個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)。分別利用這些化合物的真實(shí)靶點(diǎn)構(gòu)建了與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖5)，顯示出槲皮素、木犀草素、漢黃芩素等痛風(fēng)湯活性成分調(diào)控TP53基因的機(jī)制。

A:木犀草素真實(shí)靶點(diǎn)與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)；B:漢黃芩素真實(shí)靶點(diǎn)與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)；C:槲皮素真實(shí)靶點(diǎn)與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.6 分子對接

選取FLT3、MAOA分別與木犀草素、槲皮素進(jìn)行分子對接，選取NOS2、PTGS2與漢黃芩素進(jìn)行了分子對接，揭示了痛風(fēng)湯的特定活性成分與其靶點(diǎn)的結(jié)合模式(圖6)。

圖6 分子對接結(jié)果

3 討 論

痛風(fēng)的臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥及其引發(fā)的急性炎癥[14]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為高尿酸血癥是因濕濁、熱毒、血瘀、痰凝所致，需以祛濕通絡(luò)、泄?jié)峤舛緸橹委熢瓌t[15]。國醫(yī)大師朱良春認(rèn)為濕濁瘀滯內(nèi)阻，才是痛風(fēng)發(fā)病的主要原因，并將其命名為“濁瘀痹”[16]。痛風(fēng)湯是治療“濁瘀痹”的專病專方。因此有必要深入研究其組方規(guī)律和作用機(jī)制。

痛風(fēng)湯的基礎(chǔ)方(土茯苓、萆薢、蒼術(shù)、生薏苡仁、威靈仙、蠶沙、地龍、澤瀉、桃仁、紅花)可促進(jìn)濁毒泄化、瘀結(jié)解除。在此基礎(chǔ)上可加入其他藥材，做到辨證論治，個(gè)體化給藥[8]。由于中藥復(fù)方具有藥效的整體性和成分的復(fù)雜性，揭示復(fù)方中有效成分與靶點(diǎn)、信號途徑之間的關(guān)系，是研究中藥復(fù)方的關(guān)鍵[17]。同樣，深入理解痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)的作用需要一種揭示成分-靶點(diǎn)-通路關(guān)系的系統(tǒng)生物學(xué)方法。中藥復(fù)方的藥理作用可能是由于多種成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控多個(gè)細(xì)胞信號途徑的過程。系統(tǒng)生物學(xué)中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也許能解決中藥作用機(jī)制復(fù)雜性的問題。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的目的不是確定單個(gè)候選化合物，而是全面分析復(fù)雜體系，構(gòu)建復(fù)雜成分與其藥理學(xué)作用之間的網(wǎng)絡(luò)[18]，其整體和系統(tǒng)特征與中藥發(fā)揮作用的原理一致。

本研究中KEGG分析結(jié)果顯示，痛風(fēng)湯的藥理作用涉及27個(gè)信號通路，而與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵通路共有14個(gè)。痛風(fēng)湯藥理作用與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)通路均涉及的共同通路為4個(gè)，分別為Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。這樣的思路與大部分中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究不同。細(xì)胞信號通路包含了多種靶點(diǎn)，而且每個(gè)靶點(diǎn)被不同的化合物所影響。但是，每個(gè)信號通路所代表的生物學(xué)效應(yīng)是固定的，這樣的生物學(xué)效應(yīng)不會(huì)因?yàn)椴煌衔锇邢蛴谕分胁煌陌悬c(diǎn)而發(fā)生改變。因此，不同化合物作用于不同的蛋白靶點(diǎn)時(shí)，很可能具有相同的生物學(xué)效應(yīng)。只要這些蛋白靶點(diǎn)涉及同一信號通路即可。因此，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究過程中，可以預(yù)先忽略中藥復(fù)方的靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)中共同靶點(diǎn)，分別尋找相關(guān)靶信號通路，進(jìn)而得到共同信號通路。這可能是中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的改進(jìn)。

本文研究結(jié)果還顯示，痛風(fēng)湯涉及的最重要通路是Pathways in cancer，其中TP53為關(guān)鍵靶點(diǎn)。可影響TP53的化合物分別是土茯苓和紅花中的槲皮素、紅花中的木犀草素、蒼術(shù)中的漢黃芩素。槲皮素是日常飲食中含量最豐富的類黃酮之一，它可抑制黃嘌呤氧化酶(XOD)催化的尿酸和超氧自由基的生成，可以作為預(yù)防痛風(fēng)和過氧化損傷的潛在化合物[19]。木犀草素是芹菜和青椒的主要成分之一，可競爭性地抑制XOD[20]。在高尿酸血癥小鼠中，槲皮素與木犀草素的這種作用有助于增強(qiáng)尿酸排泄并改善高尿酸血癥引起的腎功能不全。此外，還有研究顯示，木犀草素和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷還可減輕單鈉尿酸鹽晶體引起的小鼠足腫脹和炎癥，其機(jī)制可能與它們降低IL-1β和TNF-α的水平有關(guān)[21]。漢黃芩素對XOD也有較強(qiáng)的抑制作用[22]，其IC50=157.38 μmol/L[23]。因此有研究指出，漢黃芩素可能是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在化合物[24]。

該研究也存在一些網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究存在的共性問題。例如本研究中使用的痛風(fēng)湯活性成分來自TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選標(biāo)準(zhǔn)則是根據(jù)化合物的OB和DL的大小來決定是否候選為活性成分。但是本研究中動(dòng)物藥材地龍的唯一候選成分蚯蚓素，來自TCMID數(shù)據(jù)庫，沒有按照OB和DL的標(biāo)準(zhǔn)來篩選。因此，在今后的研究中需要統(tǒng)一篩選標(biāo)準(zhǔn)，且需要更多來自地龍的候選成分。另外在研究過程中還發(fā)現(xiàn)，許多文獻(xiàn)報(bào)道的活性化合物未達(dá)到數(shù)據(jù)庫的OB和DL大小標(biāo)準(zhǔn)而被從活性成分的列表中剔除。在今后的研究中需要對這部分化合物進(jìn)行重新評價(jià)，納入活性成分列表進(jìn)行深入發(fā)掘。未來在解決以上共性問題的基礎(chǔ)上，需要在細(xì)胞水平驗(yàn)證活性成分-靶點(diǎn)、成分-通路的關(guān)系，這樣才能驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，這對于闡明痛風(fēng)湯作用機(jī)制、篩選其中的活性成分具有重要意義。