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    異槲皮素的制備及研究進(jìn)展

    2020-06-02 05:19:42房仙穎章祎唯趙林果

    房仙穎,章祎唯,蕭 偉,趙林果,3*

    1南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,南京 210037;2江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司,連云港 222001;3南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210037

    異槲皮素(槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和蘆丁(槲皮素-3-O-蕓香糖苷)都是天然黃酮醇(3,5,7,3′,4′-五羥基黃酮)的主要糖苷形式(圖1)。異槲皮素不僅生物活性廣泛,在安全性、生物利用度和某些活性上較槲皮素和蘆丁有一定的優(yōu)勢(shì)[1-3]?!懊阜ㄐ揎?α-葡萄糖基化)的異槲皮素”(enzymatically modified isoquercitrin,EMIQ)是利用環(huán)糊精葡糖轉(zhuǎn)移酶對(duì)異槲皮素進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基化獲得的異槲皮素衍生物(圖2)。EMIQ不僅著色效果好、天然無(wú)毒,而且水溶性較好,并具有廣泛的生物活性,已獲得FDA的批準(zhǔn),可用于食品添加[4,5]。所以異槲皮素具有很好的研究和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

    圖1 蘆丁、異槲皮素和槲皮素的結(jié)構(gòu)

    近幾十年來(lái),關(guān)于蘆丁和槲皮素的研究報(bào)道非常多,而對(duì)異槲皮素的研究則相對(duì)較少。一方面,異槲皮素雖然在天然界中分布廣泛,但含量很低,通過(guò)提取分離手段制備難度大、產(chǎn)率低、成本高,從而限制了異槲皮素的活性及其應(yīng)用的研究;另一方面,蘆丁在天然界中不僅分布廣泛而且含量遠(yuǎn)高于其他黃酮類(lèi)化合物[6],應(yīng)用生物催化方法由蘆丁制備異槲皮素引起了食品和醫(yī)藥行業(yè)的興趣。其關(guān)鍵技術(shù)就是需要篩選、制備特異性催化蘆丁轉(zhuǎn)化為異槲皮素的高效α-L-鼠李糖苷酶。本文在實(shí)驗(yàn)室的研究基礎(chǔ)上,對(duì)PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了文獻(xiàn)檢索,綜述了與異槲皮素的分布、生產(chǎn)、理化性質(zhì)、藥理學(xué)活性、安全性和應(yīng)用等方面相關(guān)的內(nèi)容。

    圖2 EMIQ的結(jié)構(gòu)及制備方法

    1 分布

    異槲皮素,作為最豐富的天然黃酮化合物槲皮素的單葡萄糖苷,廣泛存在于水果、蔬菜、谷物和多種植物源的飲料。異槲皮素最早是從加拿大紫荊的種子莢中分離出來(lái)的,近年來(lái)已被報(bào)道存在于羅莎黃柏花、楊梅的葉片、多種蔥屬、莧菜、開(kāi)心果、杜仲葉、木芙蓉葉、三葉崖爬藤、矮桃、蓮子外果皮、杭菊、椴樹(shù)屬、金葉子、芙蓉玫瑰茄、佛甲草、蘋(píng)果葉、南非紅葉茶樹(shù)、蛇莓、桑葉等植物中。大量研究顯示,許多植物的生物活性與其中所含的異槲皮素相關(guān)。例如,杜仲抗氧化[7],羅布麻治療肝損傷和抗血小板凝集[8,9],金絲桃屬抗炎[10],青錢(qián)柳治療高血脂[11],魚(yú)腥草抗病毒和抑制NF-κB活化[12],黃檳榔青的抗焦慮抗抑郁作用[13]等。第一個(gè)有關(guān)食物中多酚類(lèi)物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)Phenol-Explorer列出了36項(xiàng)含量介于0.000 067‰(獼猴桃汁)和0.419 5‰(金櫻子的果實(shí))(平均0.023 8‰,中值0.005 9‰)的品種。基于這些數(shù)據(jù),按照每日建議果蔬食用量500 g計(jì)算,異槲皮素的平均每日攝入量估計(jì)為3~12 mg[14]。

    2 異槲皮素的生產(chǎn)/制備

    雖然異槲皮素分布很廣,由于其在植物原料中的含量極低,很難利用提取方法得到足夠多的純品用于食品和制藥工業(yè)[15]。而且,由于工藝相對(duì)復(fù)雜,目前尚無(wú)通過(guò)化學(xué)合成法制備異槲皮素的研究報(bào)道。另一方面,蘆丁在天然植物中含量很高,可以從蕎麥、槐米、紅豆等植物中獲取。比色法和液相色譜法測(cè)得,苦蕎麩皮乙醇粗提物的主要成分為苦蕎黃酮,黃酮含量為74.0%,其中86.5%為蘆丁,槲皮素和異槲皮素微量;乙醇粗提物經(jīng)高壓水解后,總黃酮含量為76.2%,其中,蘆丁、槲皮素和異槲皮素分別占60.6%、25.2%和13.5%[16]?;瘜W(xué)法水解蘆丁不僅選擇性差,無(wú)法控制糖苷鍵斷裂的位置,水解得到的異槲皮素會(huì)進(jìn)一步被水解為槲皮素(苷元形式),而且反應(yīng)條件劇烈,環(huán)境污染大。相比之下,生物法可以在溫和條件下催化水解反應(yīng),具有較高的立體和區(qū)域選擇性。因此,通過(guò)選擇性去除蘆丁分子中的鼠李糖制備異槲皮素將是更好的方法(圖3)。

    圖3 蘆丁制備異槲皮素轉(zhuǎn)化圖

    2.1 提取法制備異槲皮素

    通過(guò)提取法制備異槲皮素的研究較少。據(jù)報(bào)道,Li等[17]采用蝸牛酶水解法提取羅布麻花中異槲皮素,最佳提取工藝為酶解溫度60 ℃、酶用量0.2 mg/mL、酶解時(shí)間1 h、pH 5.0,該法提取測(cè)得異槲皮素含量為4.06%;Zhao等[18]采用高速逆流色譜法,對(duì)棉花花提取物進(jìn)行一步分離純化,經(jīng)波譜法結(jié)構(gòu)鑒定、薄層色譜、高效液相色譜法測(cè)定產(chǎn)品的純度,獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%的異槲皮素對(duì)照品。雖然提取法制備異槲皮素的原料來(lái)源多,但因含量普遍很低,存在提取效率低、成本高、分離純化困難、不具備擴(kuò)大生產(chǎn)條件等問(wèn)題,一定程度上限制了異槲皮素的開(kāi)發(fā)利用。

    2.2 柚皮苷酶/橙皮苷酶制備異槲皮素

    Hasumura等[19]使用柚皮苷酶/橙皮苷酶水解蘆丁,隨后進(jìn)行純化得到了以異槲皮素為主的“酶解的蘆丁”;Gong等[20]建立了一個(gè)利用橙皮苷酶同步反應(yīng)和分離制備異槲皮素的系統(tǒng);Wang等[21]建立了一個(gè)有效提高橙皮苷酶催化蘆丁轉(zhuǎn)化生成異槲皮素反應(yīng)的雙向體系。但柚皮苷酶/橙皮苷酶中通常既含有α-L-鼠李糖苷酶活性又含有β-D-葡萄糖苷酶活性,水解時(shí)容易產(chǎn)生槲皮素,從而影響異槲皮素的純度和得率。Jo等[22]發(fā)現(xiàn)棗汁提取物中可能存在β-D-葡糖糖苷酶抑制劑,提示可以將這類(lèi)抑制劑用于柚皮苷酶/橙皮苷酶中β-D-葡糖糖苷酶的活性,從而提高異槲皮素的制備得率。上述酶制劑雖然能夠用于異槲皮素的制備,但酶的專(zhuān)一性不強(qiáng),導(dǎo)致產(chǎn)物純度不高、酶解條件難以調(diào)控或反應(yīng)體系復(fù)雜等問(wèn)題。

    2.3 專(zhuān)一性鼠李糖苷酶的開(kāi)發(fā)

    Zhang等[23]利用雙歧桿菌來(lái)源的鼠李糖苷酶將蘆丁生物轉(zhuǎn)化為異槲皮素;Wu等[24]篩選得到一株可以產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的黑曲霉,所產(chǎn)酶最適溫度為55 ℃,最適pH為5.5,利用該酶轉(zhuǎn)化蘆丁制備異槲皮素,在最適條件下反應(yīng)45 min,蘆丁轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%;Yadav等[25]從灰青霉PenicilliumgreoroseumMTCC-9224中分離得到一種α-L-鼠李糖苷酶,能特異性地催化蘆丁生成異槲皮素,最適pH 6.5,最適反應(yīng)溫度57 ℃。但利用傳統(tǒng)菌株制備的鼠李糖苷酶活性低,于是人們把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了基因工程菌。Lv等[26]從岸濱芽孢桿菌(Bacilluslitoralis)中克隆并表達(dá)了一個(gè)能特異性轉(zhuǎn)化蘆丁生成異槲皮素的α-L-鼠李糖苷酶,重組酶最適溫度為60 ℃,于20~55 ℃使用時(shí)穩(wěn)定,最適pH值是6.0,且僅在pH 6.0附近保持穩(wěn)定。Gerstorferová等[27,28]使用在巴斯德畢赤酵母中異源表達(dá)的耐堿性的土曲霉α-鼠李糖苷酶,開(kāi)發(fā)了一種生物催化法由蘆丁生產(chǎn)高純度異槲皮素(約99.5%)的有效方法。但是,上述基因工程菌生產(chǎn)的α-L-鼠李糖苷酶普遍存在表達(dá)量不高、酶活低等問(wèn)題,且至今為止還沒(méi)有用于商業(yè)化的純鼠李糖苷酶產(chǎn)品。

    為獲得能高效轉(zhuǎn)化含有鼠李糖基的天然黃酮類(lèi)化合物,本實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)了一系列α-L-鼠李糖苷酶[29,30]。其中,來(lái)源于AspergillusterreusCCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶(AtRha)具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、良好的pH穩(wěn)定性和較廣的適宜反應(yīng) pH,最高酶活可達(dá)1 000 U/ml。目前發(fā)現(xiàn)的糖苷酶多數(shù)只能在水相體系中進(jìn)行催化反應(yīng),有機(jī)溶劑耐受度低,黃酮類(lèi)化合物在水溶液中溶解度低的問(wèn)題也限制了其大規(guī)模制備。通過(guò)多次電轉(zhuǎn)篩選到了高拷貝的PichiapastorisKM71H基因工程菌,通過(guò)添加山梨醇,顯著提高了AtRha的熱穩(wěn)定性,添加適量的山梨醇能使AtRha在65、70和75 ℃的半衰期分別提高4.5、17.2和30.3倍,在相同條件的酶解過(guò)程下,添加1.5 mol/L的山梨醇后,異槲皮素的得率由60.01%提高到96.43%[29]。采用B-factor飽和突變策略對(duì)AtRha進(jìn)行了改造,獲得了兩個(gè)熱穩(wěn)定性更好的突變體D594Q和G827K-D594Q,成功提高了AtRha的熱穩(wěn)定性以及蘆丁催化轉(zhuǎn)化制備異槲皮素的產(chǎn)量,在相同條件下,與突變前AtRha相比,異槲皮素的產(chǎn)量分別提高了13.5%和11.0%[31]。目前,該酶正在進(jìn)行高密度發(fā)酵研究,有望用于異槲皮素的工業(yè)化生產(chǎn)。

    3 理化性質(zhì)及生物利用度

    3.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)

    黃酮是酚類(lèi)和吡喃環(huán)組成的苯并-γ-吡喃酮衍生物,并根據(jù)其基本骨架上取代基的不同進(jìn)行分類(lèi)。在自然界中,黃酮類(lèi)化合物主要以3-O-糖苷和聚合物形式存在。在異槲皮素分子中,葡萄糖連接到槲皮素C-3位;蘆丁,L-α-吡喃鼠李糖-(1,6)-β-吡喃葡萄糖(蕓香糖)取代基位于相同的位置(圖1)。以下結(jié)構(gòu)元件對(duì)于黃酮清除自由基活性起著重要作用:B環(huán)中的O-二羥基(兒茶酚)結(jié)構(gòu)具有顯著的抗自由基活性;C環(huán)中2,3-雙鍵與4-O基團(tuán)的共軛可促使π-電子離域并穩(wěn)定H-abstraction后的黃酮基團(tuán);C-3(C環(huán)),C-5和C-7(A環(huán))位的羥基對(duì)自由基的清除具有重要意義[32]。

    3.2 親水/親脂性

    黃酮是弱酸,因此它們的溶解度隨pH上升而增加[28]。黃酮醇在水中溶解性通常較差,黃酮醇的糖基化能增加它們?cè)谒械娜芙舛?。與EMIQ的“自由”溶解度相比,槲皮素、異槲皮素和蘆丁的溶解度分別為50、206和196 μmol/L(分別相當(dāng)于15、95和120 mg/L)[3]。相比之下,異槲皮素和蘆丁在極性有機(jī)溶劑中的溶解性比槲皮素差。對(duì)于在水溶液中開(kāi)展的實(shí)驗(yàn),通常用DMSO助溶將其配制成高濃度儲(chǔ)備液(1 000倍濃度)后再使用;體內(nèi)則將其配制成水懸浮液使用[3]。

    化合物在體內(nèi)的生物利用度和生物學(xué)活性,不僅取決于單純的溶解度,還跟相間分配有關(guān)。親脂性和親水性控制著蛋白質(zhì)和膜的相互作用、轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合活性,影響化合物的吸收和排泄。異槲皮素的辛醇-水(緩沖液)分配系數(shù)(logP值)為0.76~0.77,與之相比,槲皮素為1.82,EMIQ為-0.25,蘆丁為-0.45 ~-0.64,糖苷配基比任何綴合物都更具親脂性[33]。近期一項(xiàng)研究通過(guò)對(duì)大鼠連續(xù)8天灌胃給予槲皮素(12 mg/kg/d)和異槲皮素(18 mg/kg/d),比較二者的生物利用度。與槲皮素相比,喂食了異槲皮素大鼠的肝、肺、心臟、腎、腦和血漿中的代謝產(chǎn)物含量一致高出槲皮素2~5倍[34]。

    3.3 光譜性質(zhì)

    植物黃酮的主要生理功能之一是著色,聯(lián)同其防止褪色的功能,這個(gè)特性也被用于食品生產(chǎn)。黃酮的吸收光譜由介于240~400 nm間兩個(gè)不同的頻段組成。帶I出現(xiàn)在300和380 nm之間,歸功于B環(huán)(kmax約在350~370 nm附近),而帶II覆蓋了240~280 nm的范圍(kmax約在260~270 nm),歸功于A-C苯甲酰體系。最大吸收在300 nm左右有一個(gè)很弱的帶,歸功于單獨(dú)的C環(huán)。對(duì)于甲醇溶的異槲皮素,kmax在257和352或353 nm發(fā)現(xiàn)吸收帶[35]。

    4 異槲皮素的藥理活性

    4.1 抗氧化

    抗氧化是黃酮類(lèi)化合物普遍具備的活性之一,目前已有大量研究從多個(gè)角度闡明了異槲皮素的抗氧化作用機(jī)制[14]。例如,異槲皮素可以清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧自由基并且抑制黃嘌呤氧化酶的活性;在酵母多糖活化的巨噬細(xì)胞RAW264.7中,異槲皮素能夠抑制p47phox蛋白的磷酸化,進(jìn)而抑制超氧化物的產(chǎn)生;異槲皮素也被認(rèn)為是髓過(guò)氧化物酶的抑制劑,該酶在呼吸鏈中利用過(guò)氧化氫和Cl產(chǎn)生次氯酸;在分離得到的人淋巴細(xì)胞中,異槲皮素減少了H2O2誘導(dǎo)的DNA損傷;在H2O2處理的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)RGC-5細(xì)胞中,異槲皮素降低了胞內(nèi)ROS水平、谷胱甘肽耗竭和脂質(zhì)過(guò)氧化;對(duì)CdCl2處理的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),異槲皮素能夠螯合Cd2+并減弱其毒性作用(超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活力降低,脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高,產(chǎn)生NO,蛋白質(zhì)羰基和DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)),因此對(duì)鎘引起的脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化損傷有保護(hù)作用。

    4.2 免疫調(diào)節(jié)

    在大鼠體內(nèi)局部給予異槲皮素(10 mg/kg)可以預(yù)防角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[36]。異槲皮素還可以通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的釋放,從而發(fā)揮抗炎活性[37]。一項(xiàng)Balb/c小鼠過(guò)敏性哮喘模型實(shí)驗(yàn)表明,異槲皮素降低了卵清蛋白誘導(dǎo)的支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目,并且能夠降低肺勻漿中IL-5的水平,表現(xiàn)為有效的抗炎試劑,具備用于治療過(guò)敏癥的潛力[38]。另一方面,異槲皮素能增加免疫動(dòng)物后B淋巴細(xì)胞的體外增殖,為免疫系統(tǒng)發(fā)揮特異性體液免疫應(yīng)答、分泌抗體做準(zhǔn)備[39]。

    4.3 抑菌和抗病毒

    異槲皮素能夠通過(guò)破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抗病原真菌(白色念珠菌)的作用,并且?guī)缀鯖](méi)有溶血現(xiàn)象發(fā)生[40]。在另一項(xiàng)研究中,異槲皮素對(duì)病原細(xì)菌糞腸球菌和病原真菌煙曲霉、白色念珠菌和新型隱球菌表現(xiàn)出抑制活性[41]。異槲皮素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的藥物作用靶標(biāo)Sortase A具有輕微的抑制作用[42]。Gaudry等研究表明異槲皮素可以抑制ZikA病毒對(duì)人細(xì)胞的感染[43]。此外,異槲皮素還可以通過(guò)抑制NF-κB活化抑制單純孢疹病毒感染導(dǎo)致的炎癥[12]。

    4.4 抗腫瘤

    異槲皮素可以減少人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中TNF-α刺激產(chǎn)生的IL-6的表達(dá);抑制人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中PMA誘導(dǎo)的AP-1的轉(zhuǎn)錄活性,并上調(diào)MMP-9[14]。異槲皮素通過(guò)調(diào)控鴉片受體和MAPK途徑抑制前列腺癌和肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖[44];通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)[45]。異槲皮素體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力較槲皮素弱,體內(nèi)抑制結(jié)腸癌增長(zhǎng)能力相當(dāng),在消化道被水解為槲皮素,可作為藥物前體[46]。異槲皮素作為半枝蓮中的主要成分,能夠抑制HGF/SF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[47]。異槲皮素還可以通過(guò)激活A(yù)MPK活化蛋白激酶途徑誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡[48]。

    4.5 對(duì)脂代謝及相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)

    異槲皮素具備的抗氧化能力有利于降低肝細(xì)胞脂肪量;其脂肪酸?;苌锬軌蛟鰪?qiáng)異槲皮素抗脂質(zhì)過(guò)氧化的活性[49]。通過(guò)活化AMPK途徑,異槲皮素可預(yù)防脂代謝紊亂和非酒精性脂肪肝[50]。此外,異槲皮素還可以誘導(dǎo)肝臟載脂蛋白A-I的表達(dá),具備用于治療低α-脂蛋白血癥的可能性[51]。異槲皮素在小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞中,能活化Wnt/β-catenin途徑,抑制3T3-L1細(xì)胞的分化[14];還可以增強(qiáng)對(duì)脂肪生成的抑制作用,有望用于肥胖及相關(guān)疾病的防治[52]。

    4.6 神經(jīng)保護(hù)作用

    在小鼠/大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤雜交NG108-15細(xì)胞中,異槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)Rho GTP酶的表達(dá)、活性和細(xì)胞定位促進(jìn)突起的延伸,可用于防治神經(jīng)系統(tǒng)紊亂;異槲皮素能誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(SREBP-2)的表達(dá)和活性,促進(jìn)SREBP-2介導(dǎo)的甾醇合成和對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù),保護(hù)脂質(zhì)過(guò)氧化造成的細(xì)胞損傷;從貫葉連翹中分離出的異槲皮素(0.6 mg/kg,口服)純化合物在大鼠被動(dòng)游泳實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗抑郁活性;通過(guò)測(cè)量小鼠孔板測(cè)試實(shí)驗(yàn)中的鎮(zhèn)靜行為,異槲皮素(30 mg/kg,腹腔注射)顯著減少后腳站起次數(shù)[14]。異槲皮素對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用,具有治療帕金森的潛質(zhì)[53]。帕金森疾病中,參與泛素化途徑和多巴胺合成的基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變,異槲皮素通過(guò)改變這類(lèi)基因的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用[54]。在自然界中,異槲皮素存在于許多安神植物,可能與其它黃酮類(lèi)物質(zhì)一起表現(xiàn)出神經(jīng)藥理學(xué)活性。

    4.7 治療糖尿病

    異槲皮素(15 mg/kg/d,口服給藥10天)抑制四氧嘧啶Aloxan誘導(dǎo)的高血糖,肝和腎的脂質(zhì)過(guò)氧化和肝葡萄糖-6-磷酸酶的活性,同時(shí)提高過(guò)氧化氫酶和SOD的活性和谷胱甘肽的含量;在口服葡萄糖耐受試驗(yàn)中,異槲皮素(單劑量100 mg/kg,口服)使血糖峰值延遲了30 min,從而表現(xiàn)出時(shí)間依賴性抗高血糖活性;然而,50和200 mg/kg劑量組在該模型中則無(wú)效;連續(xù)11天給予異槲皮素(3或9 mg/kg,口服)對(duì)大鼠空腹血糖水平?jīng)]有顯著影響[14]。Jayachandran等[55]的研究表明異槲皮素可以通過(guò)胰島素信號(hào)通路改善糖尿病大鼠高血糖及調(diào)節(jié)糖代謝關(guān)鍵酶(己糖激酶、丙酮酸激酶等),作用方式與臨床用藥格列本脲類(lèi)似,揭示異槲皮素有望成為糖尿病的治療藥物。臨床數(shù)據(jù)顯示,糖尿病患者除了病癥本身,還應(yīng)注意因長(zhǎng)期血糖增高帶來(lái)的血管受損和心、肝、腦、腎等器官損傷。異槲皮素對(duì)II型糖尿病造成的大鼠肝損傷有保護(hù)作用,在10和30 mg/kg的劑量下能夠劑量依賴性地改善臨床癥狀,如FBG和葡萄糖耐受,降低血清ALT、AST、IR的水平,增加TP、Alb、SOD等[56]。

    4.8 心肌保護(hù)

    異槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌損傷大鼠具有保護(hù)作用,可能的作用機(jī)制是保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,該研究系首次發(fā)現(xiàn)異槲皮素的心肌保護(hù)功能[57]。異槲皮素通過(guò)抗炎、抗凋亡因子和調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB信號(hào)通路改善心肌梗塞[58]。Huang等[59]研究表明,異槲皮素可以通過(guò)激活A(yù)MPKα通路,減輕LPS誘導(dǎo)的促炎作用,減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠心臟功能紊亂。

    4.9 治療心血管疾病

    異槲皮素能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性,具有與標(biāo)準(zhǔn)利尿藥螺內(nèi)酯相當(dāng)?shù)睦蜃饔茫梢栽黾泳徏る?、前列環(huán)素和NO的生物利用度,抑制Na(+)/K(+)-ATP酶活性,因此表現(xiàn)出降壓作用[14]。Gasparotto等[60]隨后的一項(xiàng)研究表明,異槲皮素誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴型和非依賴型的動(dòng)脈血管擴(kuò)張與內(nèi)皮NO釋放和Kir6.1鉀通道開(kāi)放有關(guān)。Dai等[61]揭示異槲皮素通過(guò)Nrf2介導(dǎo)的NOX4/ROS/NF-κB途徑抑制缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡。

    4.10 阿爾茨海默癥防治

    Carmona等[62]的一項(xiàng)研究表明,異槲皮素具有抑制β-和γ-分泌酶的活性以及抑制Aβ聚集和促進(jìn)其分解的能力。

    4.11 其他活性

    除了上述活性,還有研究表明異槲皮素對(duì)體內(nèi)外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化都起積極作用,提示異槲皮素可能是預(yù)防腭裂縫線術(shù)后復(fù)發(fā)的潛在候選藥物[63]。異槲皮素可以抑制細(xì)胞膜上腎上腺素刺激的腺苷酸環(huán)化酶活性[64]。大鼠被給予霍亂弧菌毒素后,異槲皮素(ID5019.2 μmol/kg)適度地減少了腸液分泌;此外異槲皮素還具有抗阿米巴原蟲(chóng)作用(IC5014.7 μg/mL)和抗Giargia鞭毛蟲(chóng)的作用(IC5047.5 μg/mL)[14]。Zhang等[65]研究表明,異槲皮素通過(guò)抑制PASMC增殖、阻斷PDGF-Rβ信號(hào)通路改善MCT誘導(dǎo)的肺血管重塑,防治肺動(dòng)脈高壓。值得注意的是,異槲皮素在細(xì)胞水平的有效濃度通常為10 μM及以上的濃度。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血漿中并沒(méi)有檢測(cè)到如此高的異槲皮素濃度,但不能排除在腸道內(nèi)或在肝臟等部位可以達(dá)到這個(gè)濃度[14]。

    除了相對(duì)非特異性的抗氧化作用,目前已有許多特定的黃酮分子靶標(biāo)得到確定。黃酮可以與其它生物分子相互作用,尤其是與蛋白類(lèi)物質(zhì),因此它們可調(diào)節(jié)酶、細(xì)胞受體或轉(zhuǎn)錄因子的功能。異槲皮素被報(bào)道能在體外抑制多種酶的活性,例如大鼠肝臟微粒體的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶,大鼠腸道α-葡糖苷酶,釀酒酵母來(lái)源的α-葡糖苷酶和人α-淀粉酶[14]。異槲皮素抑制糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能被證明是由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)GLUT2介導(dǎo)的[66]。隨著新藥理活性的發(fā)現(xiàn),異槲皮素在細(xì)胞內(nèi)將有更多的分子靶點(diǎn)被揭示。

    作為獲得FDA批準(zhǔn)的異槲皮素衍生物,EMIQ也有許多生物活性。EMIQ可以顯著抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的鼠耳被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)[3]。在人類(lèi)受試者中,通過(guò)預(yù)防性或治療性地服用的EMIQ(100 mg/d,連續(xù)8周),能夠有效緩解日本柳杉花粉造成的眼部癥狀;EMIQ通過(guò)依賴于內(nèi)皮NO合成酶的機(jī)制,抑制病理性的血管生成,也可以刺激生理性的血管生成;經(jīng)22天口服給藥(3和26 mg/kg)后,EMIQ劑量依賴性抑制了自發(fā)性高血壓大鼠的平均血壓和心率的增加;動(dòng)脈粥樣硬化apoE缺陷小鼠給予高脂飲食,若在高脂飼料中添加EMIQ(0.026%),連續(xù)喂食14周后能顯著抑制主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)以及在脈斑中的巨噬細(xì)胞和4-羥基-2-壬烯醛的含量[14]。Kangawa等[67]的研究表明,EMIQ具有抗炎作用,能減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠肌肉損傷,可能對(duì)IBD的治療有幫助。多項(xiàng)研究表明,異槲皮素和EMIQ能夠預(yù)防或抑制肝癌病變[68,69]。減小接種了小鼠源結(jié)腸癌細(xì)胞的小鼠體內(nèi)腫瘤大小,改善氮氧基甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌和花青素的預(yù)后[70]。

    5 安全性

    作為一類(lèi)天然物質(zhì),少量異槲皮素是人類(lèi)日常飲食的常見(jiàn)組分。基于異槲皮素的有益屬性,將它作為食品添加劑引起了越來(lái)越多的關(guān)注。將異槲皮素用于食品/藥品添加之前,其安全性需要得到確定。此外,槲皮素的安全性問(wèn)題與異槲皮素是息息相關(guān)的,因?yàn)樗赡苁钱愰纹に氐囊粋€(gè)代謝產(chǎn)物或者不想要的摻入成分[5]。大量研究表明,高純度的槲皮素通常被認(rèn)為是安全的,不存在遺傳毒性或致癌性等方面的問(wèn)題[71]。

    5.1 遺傳毒性

    近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),純異槲皮素可以保護(hù)DNA不受氧化損傷的破壞,并且具有顯著的抗突變作用[39]。Hasumura和Tamura等[19,72]引用了日本衛(wèi)生部、勞工及福利局未公布的數(shù)據(jù),在使用鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98和TA1537進(jìn)行Ames試驗(yàn)時(shí),異槲皮素表現(xiàn)出很弱的致突變作用;但在使用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行染色體畸變?cè)囼?yàn)或用小鼠進(jìn)行微核試驗(yàn)時(shí),則沒(méi)有表現(xiàn)出遺傳毒性。異槲皮素增強(qiáng)了2-乙酰氨基芴對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的誘變效應(yīng),但也對(duì)黃曲霉毒素B1[73]、叔丁基過(guò)氧化氫[74]的誘變起到保護(hù)作用。異槲皮素在體外哺乳動(dòng)物微核和染色體畸變?cè)囼?yàn)、雄性和雌性B6C3F1小鼠和Sprague Dawley大鼠的微核和彗星試驗(yàn)、以及評(píng)價(jià)多個(gè)潛在靶組織的MutaTM小鼠突變?cè)囼?yàn)中均表現(xiàn)為陰性,進(jìn)一步支持了異槲皮素在食品和飲料產(chǎn)品中的安全使用[75]。

    5.2 動(dòng)物臨床表現(xiàn)

    在Wistar大鼠的日常飲食中分別添加0.2%、1%和5%的異槲皮素(蘆丁水解所得,含量95%),連續(xù)喂食13周后考察其毒性。接受5%異槲皮素添加飲食的雄性大鼠組表現(xiàn)出輕微的體重下降,甘油三酯、總膽紅素、無(wú)機(jī)磷、血紅蛋白和紅細(xì)胞比容明顯下降,肺和睪丸的相對(duì)重量略有增加。接受同樣飲食的雌性大鼠組單核細(xì)胞比率增加。對(duì)Wistar大鼠而言,該類(lèi)異槲皮素的無(wú)可見(jiàn)不良反應(yīng)水平(no observable adverse effect levels,NOAEL)在雄性中估值為1%(相當(dāng)于539 mg/kg/d),在雌性中估值為5%(相當(dāng)于3 227 mg/kg/d)[19]。另外一項(xiàng)研究針對(duì)同樣的產(chǎn)品開(kāi)展了為期52周的慢性毒性研究。Wistar大鼠在接受0.04%,0.2%,1%和5%的上述產(chǎn)品作為日常飲食添加后,通過(guò)觀察死亡率、臨床生化和器官重量指標(biāo),并未發(fā)現(xiàn)有毒性作用。在高劑量組,雌雄性大鼠出現(xiàn)了色尿癥和尿鈣排泄增加的現(xiàn)象,雄性大鼠的腎骨盆還出現(xiàn)了礦化、炎性細(xì)胞碎片、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和移行細(xì)胞增生的情況。NOAEL值估計(jì)為1%,相當(dāng)于542.4 mg/kg/d[72]。若要求達(dá)到100倍的安全系數(shù),那么NOAEL將轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)可以接受的ADI值5.4 mg/kg/d(相當(dāng)于70 kg的個(gè)體每日食入379 mg)。

    值得注意的是,異槲皮素的衍生物EMIQ是高度可吸收,F(xiàn)DA已確認(rèn)其為公認(rèn)的安全化合物。Nyska A在一項(xiàng)為期90天的研究中,給予Sprague-Dawley大鼠高達(dá)5%EMIQ的飲食劑量,對(duì)EMIQ進(jìn)行安全性和毒性動(dòng)力學(xué)測(cè)試。所有動(dòng)物都存活到計(jì)劃的安樂(lè)死,沒(méi)有任何動(dòng)物的臨床毒性跡象。在所有劑量水平下,EMIQ均被吸收并伴有代謝產(chǎn)物槲皮素和槲皮素葡萄糖醛酸。在一些組織重量和臨床化驗(yàn)物中觀察到了顯著變化,但未發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)毒性。最顯著的發(fā)現(xiàn)是受試動(dòng)物全身劑量依賴性的發(fā)黃,顯微鏡下沒(méi)有觀察到任何變化,這一現(xiàn)象在毒理學(xué)上是微不足道的。服用EMIQ的動(dòng)物總體上未表現(xiàn)出不良臨床癥狀、體重變化、飼料消耗、臨床病理參數(shù)和組織病理學(xué)終點(diǎn),表明NOAEL值為5%(相當(dāng)于在雄性和雌性大鼠飲食中EMIQ添加量分別為3 461和3 867 mg/kg/d)[76]。

    6 結(jié)語(yǔ)

    異槲皮素廣泛分布于天然產(chǎn)物中,與蘆丁和槲皮素相比,具有較好的生物利用度和安全性,也是合成EMIQ的重要前體。EMIQ的潛在活性包括抗氧化、抗炎(過(guò)敏)、腫瘤防治和心腦血管疾病防治等,已經(jīng)獲得FDA的批準(zhǔn)可用于食品添加。異槲皮素的生物活性包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂代謝、神經(jīng)保護(hù)、改善糖尿病、心肌保護(hù)、對(duì)抗心血管疾病和防治老年癡呆等。根據(jù)目前研究結(jié)果看,異槲皮素不會(huì)導(dǎo)致突變、生殖毒性等安全性問(wèn)題,但在高劑量下可能會(huì)引發(fā)色尿癥等不良反應(yīng)。高純度的異槲皮素可以用于食品或藥品,但其安全劑量有待進(jìn)一步研究確定。

    雖然異槲皮素在植物原料中的含量極低,但在結(jié)構(gòu)上比其多一個(gè)鼠李糖基的蘆丁不僅分布廣泛而且可以從廉價(jià)的豆科植物槐米中大量獲取。近年來(lái),隨著生物酶技術(shù)的發(fā)展,包括本課題組在內(nèi)的一系列研究表明,可以利用α-L-鼠李糖苷酶將蘆丁定向轉(zhuǎn)化為異槲皮素。為了滿足實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)需求,鼠李糖苷酶的酶活仍需進(jìn)一步提高,酶的生產(chǎn)成本仍需進(jìn)一步降低。國(guó)內(nèi)外一些課題組正在深入開(kāi)展針對(duì)鼠李糖苷酶的基因改造、固定化、工程菌的高密度發(fā)酵、酶法轉(zhuǎn)化工藝體系和產(chǎn)物分離提取工藝等方面的研究。相信通過(guò)生物催化與轉(zhuǎn)化的技術(shù)創(chuàng)新和集成,可以實(shí)現(xiàn)異槲皮素純品的高效制備,為推進(jìn)異槲皮素在食品、藥品、保健品中的研究和應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

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