異槲皮素的制備及研究進(jìn)展

房仙穎，章祎唯，蕭 偉，趙林果,3*

1南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210037；2江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港 222001；3南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037

異槲皮素(槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和蘆丁(槲皮素-3-O-蕓香糖苷)都是天然黃酮醇(3，5，7，3′，4′-五羥基黃酮)的主要糖苷形式(圖1)。異槲皮素不僅生物活性廣泛，在安全性、生物利用度和某些活性上較槲皮素和蘆丁有一定的優(yōu)勢[1-3]?！懊阜ㄐ揎?α-葡萄糖基化)的異槲皮素”(enzymatically modified isoquercitrin，EMIQ)是利用環(huán)糊精葡糖轉(zhuǎn)移酶對異槲皮素進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基化獲得的異槲皮素衍生物(圖2)。EMIQ不僅著色效果好、天然無毒，而且水溶性較好，并具有廣泛的生物活性，已獲得FDA的批準(zhǔn)，可用于食品添加[4,5]。所以異槲皮素具有很好的研究和開發(fā)利用價值。

圖1 蘆丁、異槲皮素和槲皮素的結(jié)構(gòu)

近幾十年來，關(guān)于蘆丁和槲皮素的研究報道非常多，而對異槲皮素的研究則相對較少。一方面，異槲皮素雖然在天然界中分布廣泛，但含量很低，通過提取分離手段制備難度大、產(chǎn)率低、成本高，從而限制了異槲皮素的活性及其應(yīng)用的研究；另一方面，蘆丁在天然界中不僅分布廣泛而且含量遠(yuǎn)高于其他黃酮類化合物[6]，應(yīng)用生物催化方法由蘆丁制備異槲皮素引起了食品和醫(yī)藥行業(yè)的興趣。其關(guān)鍵技術(shù)就是需要篩選、制備特異性催化蘆丁轉(zhuǎn)化為異槲皮素的高效α-L-鼠李糖苷酶。本文在實(shí)驗(yàn)室的研究基礎(chǔ)上，對PubMed等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了文獻(xiàn)檢索，綜述了與異槲皮素的分布、生產(chǎn)、理化性質(zhì)、藥理學(xué)活性、安全性和應(yīng)用等方面相關(guān)的內(nèi)容。

圖2 EMIQ的結(jié)構(gòu)及制備方法

1 分布

異槲皮素，作為最豐富的天然黃酮化合物槲皮素的單葡萄糖苷，廣泛存在于水果、蔬菜、谷物和多種植物源的飲料。異槲皮素最早是從加拿大紫荊的種子莢中分離出來的，近年來已被報道存在于羅莎黃柏花、楊梅的葉片、多種蔥屬、莧菜、開心果、杜仲葉、木芙蓉葉、三葉崖爬藤、矮桃、蓮子外果皮、杭菊、椴樹屬、金葉子、芙蓉玫瑰茄、佛甲草、蘋果葉、南非紅葉茶樹、蛇莓、桑葉等植物中。大量研究顯示，許多植物的生物活性與其中所含的異槲皮素相關(guān)。例如，杜仲抗氧化[7]，羅布麻治療肝損傷和抗血小板凝集[8,9]，金絲桃屬抗炎[10]，青錢柳治療高血脂[11]，魚腥草抗病毒和抑制NF-κB活化[12]，黃檳榔青的抗焦慮抗抑郁作用[13]等。第一個有關(guān)食物中多酚類物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫Phenol-Explorer列出了36項(xiàng)含量介于0.000 067‰(獼猴桃汁)和0.419 5‰(金櫻子的果實(shí))(平均0.023 8‰，中值0.005 9‰)的品種?；谶@些數(shù)據(jù)，按照每日建議果蔬食用量500 g計(jì)算，異槲皮素的平均每日攝入量估計(jì)為3～12 mg[14]。

2 異槲皮素的生產(chǎn)/制備

雖然異槲皮素分布很廣，由于其在植物原料中的含量極低，很難利用提取方法得到足夠多的純品用于食品和制藥工業(yè)[15]。而且，由于工藝相對復(fù)雜，目前尚無通過化學(xué)合成法制備異槲皮素的研究報道。另一方面，蘆丁在天然植物中含量很高，可以從蕎麥、槐米、紅豆等植物中獲取。比色法和液相色譜法測得，苦蕎麩皮乙醇粗提物的主要成分為苦蕎黃酮，黃酮含量為74.0%，其中86.5%為蘆丁，槲皮素和異槲皮素微量；乙醇粗提物經(jīng)高壓水解后，總黃酮含量為76.2%，其中，蘆丁、槲皮素和異槲皮素分別占60.6%、25.2%和13.5%[16]?；瘜W(xué)法水解蘆丁不僅選擇性差，無法控制糖苷鍵斷裂的位置，水解得到的異槲皮素會進(jìn)一步被水解為槲皮素(苷元形式)，而且反應(yīng)條件劇烈，環(huán)境污染大。相比之下，生物法可以在溫和條件下催化水解反應(yīng)，具有較高的立體和區(qū)域選擇性。因此，通過選擇性去除蘆丁分子中的鼠李糖制備異槲皮素將是更好的方法(圖3)。

圖3 蘆丁制備異槲皮素轉(zhuǎn)化圖

2.1 提取法制備異槲皮素

通過提取法制備異槲皮素的研究較少。據(jù)報道，Li等[17]采用蝸牛酶水解法提取羅布麻花中異槲皮素，最佳提取工藝為酶解溫度60 ℃、酶用量0.2 mg/mL、酶解時間1 h、pH 5.0，該法提取測得異槲皮素含量為4.06%；Zhao等[18]采用高速逆流色譜法，對棉花花提取物進(jìn)行一步分離純化，經(jīng)波譜法結(jié)構(gòu)鑒定、薄層色譜、高效液相色譜法測定產(chǎn)品的純度，獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%的異槲皮素對照品。雖然提取法制備異槲皮素的原料來源多，但因含量普遍很低，存在提取效率低、成本高、分離純化困難、不具備擴(kuò)大生產(chǎn)條件等問題，一定程度上限制了異槲皮素的開發(fā)利用。

2.2 柚皮苷酶/橙皮苷酶制備異槲皮素

Hasumura等[19]使用柚皮苷酶/橙皮苷酶水解蘆丁，隨后進(jìn)行純化得到了以異槲皮素為主的“酶解的蘆丁”；Gong等[20]建立了一個利用橙皮苷酶同步反應(yīng)和分離制備異槲皮素的系統(tǒng)；Wang等[21]建立了一個有效提高橙皮苷酶催化蘆丁轉(zhuǎn)化生成異槲皮素反應(yīng)的雙向體系。但柚皮苷酶/橙皮苷酶中通常既含有α-L-鼠李糖苷酶活性又含有β-D-葡萄糖苷酶活性，水解時容易產(chǎn)生槲皮素，從而影響異槲皮素的純度和得率。Jo等[22]發(fā)現(xiàn)棗汁提取物中可能存在β-D-葡糖糖苷酶抑制劑，提示可以將這類抑制劑用于柚皮苷酶/橙皮苷酶中β-D-葡糖糖苷酶的活性，從而提高異槲皮素的制備得率。上述酶制劑雖然能夠用于異槲皮素的制備，但酶的專一性不強(qiáng)，導(dǎo)致產(chǎn)物純度不高、酶解條件難以調(diào)控或反應(yīng)體系復(fù)雜等問題。

2.3 專一性鼠李糖苷酶的開發(fā)

Zhang等[23]利用雙歧桿菌來源的鼠李糖苷酶將蘆丁生物轉(zhuǎn)化為異槲皮素；Wu等[24]篩選得到一株可以產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的黑曲霉，所產(chǎn)酶最適溫度為55 ℃，最適pH為5.5，利用該酶轉(zhuǎn)化蘆丁制備異槲皮素，在最適條件下反應(yīng)45 min，蘆丁轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%；Yadav等[25]從灰青霉PenicilliumgreoroseumMTCC-9224中分離得到一種α-L-鼠李糖苷酶，能特異性地催化蘆丁生成異槲皮素，最適pH 6.5，最適反應(yīng)溫度57 ℃。但利用傳統(tǒng)菌株制備的鼠李糖苷酶活性低，于是人們把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了基因工程菌。Lv等[26]從岸濱芽孢桿菌(Bacilluslitoralis)中克隆并表達(dá)了一個能特異性轉(zhuǎn)化蘆丁生成異槲皮素的α-L-鼠李糖苷酶，重組酶最適溫度為60 ℃，于20～55 ℃使用時穩(wěn)定，最適pH值是6.0，且僅在pH 6.0附近保持穩(wěn)定。Gerstorferová等[27,28]使用在巴斯德畢赤酵母中異源表達(dá)的耐堿性的土曲霉α-鼠李糖苷酶，開發(fā)了一種生物催化法由蘆丁生產(chǎn)高純度異槲皮素(約99.5%)的有效方法。但是，上述基因工程菌生產(chǎn)的α-L-鼠李糖苷酶普遍存在表達(dá)量不高、酶活低等問題，且至今為止還沒有用于商業(yè)化的純鼠李糖苷酶產(chǎn)品。

為獲得能高效轉(zhuǎn)化含有鼠李糖基的天然黃酮類化合物，本實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)了一系列α-L-鼠李糖苷酶[29,30]。其中，來源于AspergillusterreusCCF 3059的α-L-鼠李糖苷酶(AtRha)具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、良好的pH穩(wěn)定性和較廣的適宜反應(yīng) pH，最高酶活可達(dá)1 000 U/ml。目前發(fā)現(xiàn)的糖苷酶多數(shù)只能在水相體系中進(jìn)行催化反應(yīng)，有機(jī)溶劑耐受度低，黃酮類化合物在水溶液中溶解度低的問題也限制了其大規(guī)模制備。通過多次電轉(zhuǎn)篩選到了高拷貝的PichiapastorisKM71H基因工程菌，通過添加山梨醇，顯著提高了AtRha的熱穩(wěn)定性，添加適量的山梨醇能使AtRha在65、70和75 ℃的半衰期分別提高4.5、17.2和30.3倍，在相同條件的酶解過程下，添加1.5 mol/L的山梨醇后，異槲皮素的得率由60.01%提高到96.43%[29]。采用B-factor飽和突變策略對AtRha進(jìn)行了改造，獲得了兩個熱穩(wěn)定性更好的突變體D594Q和G827K-D594Q，成功提高了AtRha的熱穩(wěn)定性以及蘆丁催化轉(zhuǎn)化制備異槲皮素的產(chǎn)量，在相同條件下，與突變前AtRha相比，異槲皮素的產(chǎn)量分別提高了13.5%和11.0%[31]。目前，該酶正在進(jìn)行高密度發(fā)酵研究，有望用于異槲皮素的工業(yè)化生產(chǎn)。

3 理化性質(zhì)及生物利用度

3.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)

黃酮是酚類和吡喃環(huán)組成的苯并-γ-吡喃酮衍生物，并根據(jù)其基本骨架上取代基的不同進(jìn)行分類。在自然界中，黃酮類化合物主要以3-O-糖苷和聚合物形式存在。在異槲皮素分子中，葡萄糖連接到槲皮素C-3位；蘆丁，L-α-吡喃鼠李糖-(1，6)-β-吡喃葡萄糖(蕓香糖)取代基位于相同的位置(圖1)。以下結(jié)構(gòu)元件對于黃酮清除自由基活性起著重要作用：B環(huán)中的O-二羥基(兒茶酚)結(jié)構(gòu)具有顯著的抗自由基活性；C環(huán)中2，3-雙鍵與4-O基團(tuán)的共軛可促使π-電子離域并穩(wěn)定H-abstraction后的黃酮基團(tuán)；C-3(C環(huán))，C-5和C-7(A環(huán))位的羥基對自由基的清除具有重要意義[32]。

3.2 親水/親脂性

黃酮是弱酸，因此它們的溶解度隨pH上升而增加[28]。黃酮醇在水中溶解性通常較差，黃酮醇的糖基化能增加它們在水中的溶解度。與EMIQ的“自由”溶解度相比，槲皮素、異槲皮素和蘆丁的溶解度分別為50、206和196 μmol/L(分別相當(dāng)于15、95和120 mg/L)[3]。相比之下，異槲皮素和蘆丁在極性有機(jī)溶劑中的溶解性比槲皮素差。對于在水溶液中開展的實(shí)驗(yàn)，通常用DMSO助溶將其配制成高濃度儲備液(1 000倍濃度)后再使用；體內(nèi)則將其配制成水懸浮液使用[3]。

化合物在體內(nèi)的生物利用度和生物學(xué)活性，不僅取決于單純的溶解度，還跟相間分配有關(guān)。親脂性和親水性控制著蛋白質(zhì)和膜的相互作用、轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合活性，影響化合物的吸收和排泄。異槲皮素的辛醇-水(緩沖液)分配系數(shù)(logP值)為0.76～0.77，與之相比，槲皮素為1.82，EMIQ為-0.25，蘆丁為-0.45 ～-0.64，糖苷配基比任何綴合物都更具親脂性[33]。近期一項(xiàng)研究通過對大鼠連續(xù)8天灌胃給予槲皮素(12 mg/kg/d)和異槲皮素(18 mg/kg/d)，比較二者的生物利用度。與槲皮素相比，喂食了異槲皮素大鼠的肝、肺、心臟、腎、腦和血漿中的代謝產(chǎn)物含量一致高出槲皮素2～5倍[34]。

3.3 光譜性質(zhì)

植物黃酮的主要生理功能之一是著色，聯(lián)同其防止褪色的功能，這個特性也被用于食品生產(chǎn)。黃酮的吸收光譜由介于240～400 nm間兩個不同的頻段組成。帶I出現(xiàn)在300和380 nm之間，歸功于B環(huán)(kmax約在350～370 nm附近)，而帶II覆蓋了240～280 nm的范圍(kmax約在260～270 nm)，歸功于A-C苯甲酰體系。最大吸收在300 nm左右有一個很弱的帶，歸功于單獨(dú)的C環(huán)。對于甲醇溶的異槲皮素，kmax在257和352或353 nm發(fā)現(xiàn)吸收帶[35]。

4 異槲皮素的藥理活性

4.1 抗氧化

抗氧化是黃酮類化合物普遍具備的活性之一，目前已有大量研究從多個角度闡明了異槲皮素的抗氧化作用機(jī)制[14]。例如，異槲皮素可以清除黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧自由基并且抑制黃嘌呤氧化酶的活性；在酵母多糖活化的巨噬細(xì)胞RAW264.7中，異槲皮素能夠抑制p47phox蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制超氧化物的產(chǎn)生；異槲皮素也被認(rèn)為是髓過氧化物酶的抑制劑，該酶在呼吸鏈中利用過氧化氫和Cl產(chǎn)生次氯酸；在分離得到的人淋巴細(xì)胞中，異槲皮素減少了H2O2誘導(dǎo)的DNA損傷；在H2O2處理的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)RGC-5細(xì)胞中，異槲皮素降低了胞內(nèi)ROS水平、谷胱甘肽耗竭和脂質(zhì)過氧化；對CdCl2處理的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，異槲皮素能夠螯合Cd2+并減弱其毒性作用(超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力降低，脂質(zhì)過氧化水平升高，產(chǎn)生NO，蛋白質(zhì)羰基和DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián))，因此對鎘引起的脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化損傷有保護(hù)作用。

4.2 免疫調(diào)節(jié)

在大鼠體內(nèi)局部給予異槲皮素(10 mg/kg)可以預(yù)防角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[36]。異槲皮素還可以通過抑制MAPK信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的釋放，從而發(fā)揮抗炎活性[37]。一項(xiàng)Balb/c小鼠過敏性哮喘模型實(shí)驗(yàn)表明，異槲皮素降低了卵清蛋白誘導(dǎo)的支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目，并且能夠降低肺勻漿中IL-5的水平，表現(xiàn)為有效的抗炎試劑，具備用于治療過敏癥的潛力[38]。另一方面，異槲皮素能增加免疫動物后B淋巴細(xì)胞的體外增殖，為免疫系統(tǒng)發(fā)揮特異性體液免疫應(yīng)答、分泌抗體做準(zhǔn)備[39]。

4.3 抑菌和抗病毒

異槲皮素能夠通過破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抗病原真菌(白色念珠菌)的作用，并且?guī)缀鯖]有溶血現(xiàn)象發(fā)生[40]。在另一項(xiàng)研究中，異槲皮素對病原細(xì)菌糞腸球菌和病原真菌煙曲霉、白色念珠菌和新型隱球菌表現(xiàn)出抑制活性[41]。異槲皮素對革蘭氏陽性菌的藥物作用靶標(biāo)Sortase A具有輕微的抑制作用[42]。Gaudry等研究表明異槲皮素可以抑制ZikA病毒對人細(xì)胞的感染[43]。此外，異槲皮素還可以通過抑制NF-κB活化抑制單純孢疹病毒感染導(dǎo)致的炎癥[12]。

4.4 抗腫瘤

異槲皮素可以減少人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中TNF-α刺激產(chǎn)生的IL-6的表達(dá)；抑制人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中PMA誘導(dǎo)的AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，并上調(diào)MMP-9[14]。異槲皮素通過調(diào)控鴉片受體和MAPK途徑抑制前列腺癌和肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖[44]；通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體外生長[45]。異槲皮素體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力較槲皮素弱，體內(nèi)抑制結(jié)腸癌增長能力相當(dāng)，在消化道被水解為槲皮素，可作為藥物前體[46]。異槲皮素作為半枝蓮中的主要成分，能夠抑制HGF/SF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[47]。異槲皮素還可以通過激活A(yù)MPK活化蛋白激酶途徑誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡[48]。

4.5 對脂代謝及相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)

異槲皮素具備的抗氧化能力有利于降低肝細(xì)胞脂肪量；其脂肪酸?；苌锬軌蛟鰪?qiáng)異槲皮素抗脂質(zhì)過氧化的活性[49]。通過活化AMPK途徑，異槲皮素可預(yù)防脂代謝紊亂和非酒精性脂肪肝[50]。此外，異槲皮素還可以誘導(dǎo)肝臟載脂蛋白A-I的表達(dá)，具備用于治療低α-脂蛋白血癥的可能性[51]。異槲皮素在小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，能活化Wnt/β-catenin途徑，抑制3T3-L1細(xì)胞的分化[14]；還可以增強(qiáng)對脂肪生成的抑制作用，有望用于肥胖及相關(guān)疾病的防治[52]。

4.6 神經(jīng)保護(hù)作用

在小鼠/大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤雜交NG108-15細(xì)胞中，異槲皮素通過調(diào)節(jié)Rho GTP酶的表達(dá)、活性和細(xì)胞定位促進(jìn)突起的延伸，可用于防治神經(jīng)系統(tǒng)紊亂；異槲皮素能誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(SREBP-2)的表達(dá)和活性，促進(jìn)SREBP-2介導(dǎo)的甾醇合成和對過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)，保護(hù)脂質(zhì)過氧化造成的細(xì)胞損傷；從貫葉連翹中分離出的異槲皮素(0.6 mg/kg，口服)純化合物在大鼠被動游泳實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗抑郁活性；通過測量小鼠孔板測試實(shí)驗(yàn)中的鎮(zhèn)靜行為，異槲皮素(30 mg/kg，腹腔注射)顯著減少后腳站起次數(shù)[14]。異槲皮素對6-OHDA誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用，具有治療帕金森的潛質(zhì)[53]。帕金森疾病中，參與泛素化途徑和多巴胺合成的基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平會發(fā)生改變，異槲皮素通過改變這類基因的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用[54]。在自然界中，異槲皮素存在于許多安神植物，可能與其它黃酮類物質(zhì)一起表現(xiàn)出神經(jīng)藥理學(xué)活性。

4.7 治療糖尿病

異槲皮素(15 mg/kg/d，口服給藥10天)抑制四氧嘧啶Aloxan誘導(dǎo)的高血糖，肝和腎的脂質(zhì)過氧化和肝葡萄糖-6-磷酸酶的活性，同時提高過氧化氫酶和SOD的活性和谷胱甘肽的含量；在口服葡萄糖耐受試驗(yàn)中，異槲皮素(單劑量100 mg/kg，口服)使血糖峰值延遲了30 min，從而表現(xiàn)出時間依賴性抗高血糖活性；然而，50和200 mg/kg劑量組在該模型中則無效；連續(xù)11天給予異槲皮素(3或9 mg/kg，口服)對大鼠空腹血糖水平?jīng)]有顯著影響[14]。Jayachandran等[55]的研究表明異槲皮素可以通過胰島素信號通路改善糖尿病大鼠高血糖及調(diào)節(jié)糖代謝關(guān)鍵酶(己糖激酶、丙酮酸激酶等)，作用方式與臨床用藥格列本脲類似，揭示異槲皮素有望成為糖尿病的治療藥物。臨床數(shù)據(jù)顯示，糖尿病患者除了病癥本身，還應(yīng)注意因長期血糖增高帶來的血管受損和心、肝、腦、腎等器官損傷。異槲皮素對II型糖尿病造成的大鼠肝損傷有保護(hù)作用，在10和30 mg/kg的劑量下能夠劑量依賴性地改善臨床癥狀，如FBG和葡萄糖耐受，降低血清ALT、AST、IR的水平，增加TP、Alb、SOD等[56]。

4.8 心肌保護(hù)

異槲皮素對H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌損傷大鼠具有保護(hù)作用，可能的作用機(jī)制是保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，該研究系首次發(fā)現(xiàn)異槲皮素的心肌保護(hù)功能[57]。異槲皮素通過抗炎、抗凋亡因子和調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB信號通路改善心肌梗塞[58]。Huang等[59]研究表明，異槲皮素可以通過激活A(yù)MPKα通路，減輕LPS誘導(dǎo)的促炎作用，減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠心臟功能紊亂。

4.9 治療心血管疾病

異槲皮素能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性，具有與標(biāo)準(zhǔn)利尿藥螺內(nèi)酯相當(dāng)?shù)睦蜃饔茫梢栽黾泳徏る?、前列環(huán)素和NO的生物利用度，抑制Na(+)/K(+)-ATP酶活性，因此表現(xiàn)出降壓作用[14]。Gasparotto等[60]隨后的一項(xiàng)研究表明，異槲皮素誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴型和非依賴型的動脈血管擴(kuò)張與內(nèi)皮NO釋放和Kir6.1鉀通道開放有關(guān)。Dai等[61]揭示異槲皮素通過Nrf2介導(dǎo)的NOX4/ROS/NF-κB途徑抑制缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡。

4.10 阿爾茨海默癥防治

Carmona等[62]的一項(xiàng)研究表明，異槲皮素具有抑制β-和γ-分泌酶的活性以及抑制Aβ聚集和促進(jìn)其分解的能力。

4.11 其他活性

除了上述活性，還有研究表明異槲皮素對體內(nèi)外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化都起積極作用，提示異槲皮素可能是預(yù)防腭裂縫線術(shù)后復(fù)發(fā)的潛在候選藥物[63]。異槲皮素可以抑制細(xì)胞膜上腎上腺素刺激的腺苷酸環(huán)化酶活性[64]。大鼠被給予霍亂弧菌毒素后，異槲皮素(ID5019.2 μmol/kg)適度地減少了腸液分泌；此外異槲皮素還具有抗阿米巴原蟲作用(IC5014.7 μg/mL)和抗Giargia鞭毛蟲的作用(IC5047.5 μg/mL)[14]。Zhang等[65]研究表明，異槲皮素通過抑制PASMC增殖、阻斷PDGF-Rβ信號通路改善MCT誘導(dǎo)的肺血管重塑，防治肺動脈高壓。值得注意的是，異槲皮素在細(xì)胞水平的有效濃度通常為10 μM及以上的濃度。在實(shí)驗(yàn)動物的血漿中并沒有檢測到如此高的異槲皮素濃度，但不能排除在腸道內(nèi)或在肝臟等部位可以達(dá)到這個濃度[14]。

除了相對非特異性的抗氧化作用，目前已有許多特定的黃酮分子靶標(biāo)得到確定。黃酮可以與其它生物分子相互作用，尤其是與蛋白類物質(zhì)，因此它們可調(diào)節(jié)酶、細(xì)胞受體或轉(zhuǎn)錄因子的功能。異槲皮素被報道能在體外抑制多種酶的活性，例如大鼠肝臟微粒體的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，大鼠腸道α-葡糖苷酶，釀酒酵母來源的α-葡糖苷酶和人α-淀粉酶[14]。異槲皮素抑制糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能被證明是由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)GLUT2介導(dǎo)的[66]。隨著新藥理活性的發(fā)現(xiàn)，異槲皮素在細(xì)胞內(nèi)將有更多的分子靶點(diǎn)被揭示。

作為獲得FDA批準(zhǔn)的異槲皮素衍生物，EMIQ也有許多生物活性。EMIQ可以顯著抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的鼠耳被動皮膚過敏反應(yīng)[3]。在人類受試者中，通過預(yù)防性或治療性地服用的EMIQ(100 mg/d，連續(xù)8周)，能夠有效緩解日本柳杉花粉造成的眼部癥狀；EMIQ通過依賴于內(nèi)皮NO合成酶的機(jī)制，抑制病理性的血管生成，也可以刺激生理性的血管生成；經(jīng)22天口服給藥(3和26 mg/kg)后，EMIQ劑量依賴性抑制了自發(fā)性高血壓大鼠的平均血壓和心率的增加；動脈粥樣硬化apoE缺陷小鼠給予高脂飲食，若在高脂飼料中添加EMIQ(0.026%)，連續(xù)喂食14周后能顯著抑制主動脈粥樣硬化病變區(qū)以及在脈斑中的巨噬細(xì)胞和4-羥基-2-壬烯醛的含量[14]。Kangawa等[67]的研究表明，EMIQ具有抗炎作用，能減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠肌肉損傷，可能對IBD的治療有幫助。多項(xiàng)研究表明，異槲皮素和EMIQ能夠預(yù)防或抑制肝癌病變[68,69]。減小接種了小鼠源結(jié)腸癌細(xì)胞的小鼠體內(nèi)腫瘤大小，改善氮氧基甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌和花青素的預(yù)后[70]。

5 安全性

作為一類天然物質(zhì)，少量異槲皮素是人類日常飲食的常見組分。基于異槲皮素的有益屬性，將它作為食品添加劑引起了越來越多的關(guān)注。將異槲皮素用于食品/藥品添加之前，其安全性需要得到確定。此外，槲皮素的安全性問題與異槲皮素是息息相關(guān)的，因?yàn)樗赡苁钱愰纹に氐囊粋€代謝產(chǎn)物或者不想要的摻入成分[5]。大量研究表明，高純度的槲皮素通常被認(rèn)為是安全的，不存在遺傳毒性或致癌性等方面的問題[71]。

5.1 遺傳毒性

近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，純異槲皮素可以保護(hù)DNA不受氧化損傷的破壞，并且具有顯著的抗突變作用[39]。Hasumura和Tamura等[19,72]引用了日本衛(wèi)生部、勞工及福利局未公布的數(shù)據(jù)，在使用鼠傷寒沙門氏菌TA98和TA1537進(jìn)行Ames試驗(yàn)時，異槲皮素表現(xiàn)出很弱的致突變作用；但在使用培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行染色體畸變試驗(yàn)或用小鼠進(jìn)行微核試驗(yàn)時，則沒有表現(xiàn)出遺傳毒性。異槲皮素增強(qiáng)了2-乙酰氨基芴對鼠傷寒沙門氏菌的誘變效應(yīng)，但也對黃曲霉毒素B1[73]、叔丁基過氧化氫[74]的誘變起到保護(hù)作用。異槲皮素在體外哺乳動物微核和染色體畸變試驗(yàn)、雄性和雌性B6C3F1小鼠和Sprague Dawley大鼠的微核和彗星試驗(yàn)、以及評價多個潛在靶組織的MutaTM小鼠突變試驗(yàn)中均表現(xiàn)為陰性，進(jìn)一步支持了異槲皮素在食品和飲料產(chǎn)品中的安全使用[75]。

5.2 動物臨床表現(xiàn)

在Wistar大鼠的日常飲食中分別添加0.2%、1%和5%的異槲皮素(蘆丁水解所得，含量95%)，連續(xù)喂食13周后考察其毒性。接受5%異槲皮素添加飲食的雄性大鼠組表現(xiàn)出輕微的體重下降，甘油三酯、總膽紅素、無機(jī)磷、血紅蛋白和紅細(xì)胞比容明顯下降，肺和睪丸的相對重量略有增加。接受同樣飲食的雌性大鼠組單核細(xì)胞比率增加。對Wistar大鼠而言，該類異槲皮素的無可見不良反應(yīng)水平(no observable adverse effect levels，NOAEL)在雄性中估值為1%(相當(dāng)于539 mg/kg/d)，在雌性中估值為5%(相當(dāng)于3 227 mg/kg/d)[19]。另外一項(xiàng)研究針對同樣的產(chǎn)品開展了為期52周的慢性毒性研究。Wistar大鼠在接受0.04%，0.2%，1%和5%的上述產(chǎn)品作為日常飲食添加后，通過觀察死亡率、臨床生化和器官重量指標(biāo)，并未發(fā)現(xiàn)有毒性作用。在高劑量組，雌雄性大鼠出現(xiàn)了色尿癥和尿鈣排泄增加的現(xiàn)象，雄性大鼠的腎骨盆還出現(xiàn)了礦化、炎性細(xì)胞碎片、炎性細(xì)胞浸潤和移行細(xì)胞增生的情況。NOAEL值估計(jì)為1%，相當(dāng)于542.4 mg/kg/d[72]。若要求達(dá)到100倍的安全系數(shù)，那么NOAEL將轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€可以接受的ADI值5.4 mg/kg/d(相當(dāng)于70 kg的個體每日食入379 mg)。

值得注意的是，異槲皮素的衍生物EMIQ是高度可吸收，F(xiàn)DA已確認(rèn)其為公認(rèn)的安全化合物。Nyska A在一項(xiàng)為期90天的研究中，給予Sprague-Dawley大鼠高達(dá)5%EMIQ的飲食劑量，對EMIQ進(jìn)行安全性和毒性動力學(xué)測試。所有動物都存活到計(jì)劃的安樂死，沒有任何動物的臨床毒性跡象。在所有劑量水平下，EMIQ均被吸收并伴有代謝產(chǎn)物槲皮素和槲皮素葡萄糖醛酸。在一些組織重量和臨床化驗(yàn)物中觀察到了顯著變化，但未發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)毒性。最顯著的發(fā)現(xiàn)是受試動物全身劑量依賴性的發(fā)黃，顯微鏡下沒有觀察到任何變化，這一現(xiàn)象在毒理學(xué)上是微不足道的。服用EMIQ的動物總體上未表現(xiàn)出不良臨床癥狀、體重變化、飼料消耗、臨床病理參數(shù)和組織病理學(xué)終點(diǎn)，表明NOAEL值為5%(相當(dāng)于在雄性和雌性大鼠飲食中EMIQ添加量分別為3 461和3 867 mg/kg/d)[76]。

6 結(jié)語

異槲皮素廣泛分布于天然產(chǎn)物中，與蘆丁和槲皮素相比，具有較好的生物利用度和安全性，也是合成EMIQ的重要前體。EMIQ的潛在活性包括抗氧化、抗炎(過敏)、腫瘤防治和心腦血管疾病防治等，已經(jīng)獲得FDA的批準(zhǔn)可用于食品添加。異槲皮素的生物活性包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂代謝、神經(jīng)保護(hù)、改善糖尿病、心肌保護(hù)、對抗心血管疾病和防治老年癡呆等。根據(jù)目前研究結(jié)果看，異槲皮素不會導(dǎo)致突變、生殖毒性等安全性問題，但在高劑量下可能會引發(fā)色尿癥等不良反應(yīng)。高純度的異槲皮素可以用于食品或藥品，但其安全劑量有待進(jìn)一步研究確定。

雖然異槲皮素在植物原料中的含量極低，但在結(jié)構(gòu)上比其多一個鼠李糖基的蘆丁不僅分布廣泛而且可以從廉價的豆科植物槐米中大量獲取。近年來，隨著生物酶技術(shù)的發(fā)展，包括本課題組在內(nèi)的一系列研究表明，可以利用α-L-鼠李糖苷酶將蘆丁定向轉(zhuǎn)化為異槲皮素。為了滿足實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)需求，鼠李糖苷酶的酶活仍需進(jìn)一步提高，酶的生產(chǎn)成本仍需進(jìn)一步降低。國內(nèi)外一些課題組正在深入開展針對鼠李糖苷酶的基因改造、固定化、工程菌的高密度發(fā)酵、酶法轉(zhuǎn)化工藝體系和產(chǎn)物分離提取工藝等方面的研究。相信通過生物催化與轉(zhuǎn)化的技術(shù)創(chuàng)新和集成，可以實(shí)現(xiàn)異槲皮素純品的高效制備，為推進(jìn)異槲皮素在食品、藥品、保健品中的研究和應(yīng)用提供技術(shù)支撐。