NRG1β對腦缺血再灌注大鼠P35/P25表達(dá)和細(xì)胞凋亡影響

南寶,王悅,朱琳,劉翠,張睿

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合中心,山東 青島 266021；2 淄博市第一醫(yī)院病案科；3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院ICU)

神經(jīng)調(diào)節(jié)素1β(NRG1β)可以通過抑制腦缺血后基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)等炎性因子的表達(dá)，下調(diào)水通道蛋白4(AQP4)水平而參與神經(jīng)細(xì)胞存活以及功能修復(fù)[1-3]。大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MCAO/R)損傷表現(xiàn)出神經(jīng)功能障礙，預(yù)防性應(yīng)用NRG1β干預(yù)可顯著減小腦梗死體積以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量[4]，其機(jī)制可能與NRG1β的抗炎作用有關(guān)，但具體機(jī)制有待研究證實。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長分化過程中，細(xì)胞周期素依賴性激酶-5(Cdk5)可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生存、移行和突觸功能等[5-7]。其中，MCAO/R后缺血半影區(qū)的細(xì)胞凋亡與Cdk5的過度激活有密切關(guān)系，Cdk5抑制劑Roscovitine可阻斷其作用[8]。MCAO/R損傷發(fā)生時，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高而激活鈣蛋白酶，導(dǎo)致Cdk5特定調(diào)節(jié)亞單位p35裂解成p25[9]，其活性存在的主要形式為Cdk5/p25，許多細(xì)胞凋亡相關(guān)底物均可與Cdk5/p25結(jié)合而啟動細(xì)胞凋亡[10]。張睿等[11-12]研究顯示，大鼠MCAO/R后應(yīng)用NRG1β可顯著改善其神經(jīng)行為功能，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究試圖探討NRG1β對MCAO/R后大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其與Cdk5信號通路的關(guān)系，進(jìn)一步闡明其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠50只，購自山東省實驗動物中心，SPF級，體質(zhì)量240～260 g。室溫(23±2)℃條件下分籠飼養(yǎng)，12 h/12 h晝夜自然光照，自由飲食。術(shù)前禁食12 h，不禁水。

1.2 模型制備及實驗分組

隨機(jī)取10只大鼠作為假手術(shù)組(Sham組)，其余40只應(yīng)用線栓法制備MCAO/R模型[13]。Sham組大鼠線栓置入頸內(nèi)動脈(ICA)10 mm，不入顱。行改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)[14]，評分>10分視為造模成功，不成功的10只大鼠剔除。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組(MCAO組)、治療組(NRG組)和抑制劑組(Ros組)，每組10只。

1.3 各組處理方法

MCAO組：缺血2 h后拔除線栓，經(jīng)頸外動脈(ECA)殘端向ICA內(nèi)注射0.1 mol/L PBS 5 μL；NRG組：缺血2 h后拔除線栓，經(jīng)ECA向ICA內(nèi)注射NRG1β(R&D Systems，USA)5 μL(2 μg/kg)；Ros組：缺血2 h后拔除線栓，經(jīng)ECA向ICA注射Roscovitine 5 μL；Sham組拔除線栓后同步注射0.1 mol/L PBS 5 μL。所有大鼠均于再灌注22 h取材檢測。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1神經(jīng)行為功能評價 各組大鼠取材前均采用mNSS評分評定神經(jīng)行為功能[14]，評分最低為0分，最高18分；得分越高，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.4.2甲苯胺藍(lán)染色檢測神經(jīng)細(xì)胞形態(tài) 以100 g/L水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠(每組隨機(jī)取5只)，經(jīng)心臟灌注固定取腦。常規(guī)脫水、透明、包埋，自視交叉后方連續(xù)冠狀位切片(厚度5 μm)，貼片；甲苯胺藍(lán)染色。每張切片在高倍光鏡(400倍)下隨機(jī)觀察頂-額葉皮質(zhì)缺血半影區(qū)4個不重疊的視野，根據(jù)細(xì)胞的輪廓、膜完整性、染色深度、胞核固縮、尼氏體等指標(biāo)判斷細(xì)胞損傷變性程度，計數(shù)損傷的變性細(xì)胞數(shù)，計算變性細(xì)胞指數(shù)(DCI,DCI =變性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.4.3TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡 石蠟切片脫蠟入水，按TUNEL試劑盒(Roche公司，美國)說明操作，HRP-抗體孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。光鏡下呈棕黃色者視為凋亡細(xì)胞。陰性對照切片以PBS替代TdT探針染色，不著色。在頂-額葉皮質(zhì)缺血半影區(qū)隨機(jī)選4個視野，高倍光鏡(400倍)下計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù),計算凋亡指數(shù)(ACI,ACI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.4.4免疫組化方法檢測P35/P25陽性細(xì)胞 石蠟切片脫蠟、水化；熱修復(fù)抗原，以體積分?jǐn)?shù)0.03的H2O2孵育，PBS沖洗；然后滴加p35/p25兔單抗(C64B10，CST Co.Ltd.USA，1∶300)，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗；滴加山羊抗兔IgG/HRP二抗(PV-6001，北京中杉金橋公司)，37 ℃孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，胞漿或(和)胞核呈棕黃色者為陽性細(xì)胞。陰性對照切片不加一抗，以PBS替代染色，不出現(xiàn)陽性著色。在頂-額葉皮質(zhì)缺血半影區(qū)隨機(jī)選4個高倍(400倍)視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞指數(shù)(PCI，PCI=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.4.5Western blot檢測P35/P25表達(dá) 取大鼠頂-額葉皮質(zhì)缺血半影區(qū)腦組織100 mg，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按SDS-PAGE試劑盒(碧云天生物研究所)方法制備100 g/L分離膠和50 g/L積層膠，加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后加兔抗鼠一抗p35/p25(稀釋度為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜。加入山羊抗兔二抗IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜顯影，用Bio-Rad 2000型成像系統(tǒng)掃描，Image J軟件分析p35/p25及內(nèi)參照β-actin灰度。計算目的蛋白相對含量(目的蛋白灰度/內(nèi)參灰度值×100%)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠mNSS評分比較

與Sham組相比較，MCAO組、NRG組、Ros組mNSS評分顯著升高，NRG組、Ros組mNSS評分較MCAO組均顯著下降，差異有顯著意義(F=151.31,P<0.05)；NRG組mNSS評分較Ros組略有下降，但差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷程度比較

MCAO組的神經(jīng)細(xì)胞DCI較Sham組升高，NRG組和Ros組DCI較MCAO組顯著降低，差異有顯著性(F=128.21,P<0.05)；NRG組與Ros組DCI比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖1和表1。

A：Sham組；B：MCAO組;C：NRG組；D：Ros組。箭頭(↑)所示為變性細(xì)胞。甲苯胺藍(lán)染色，400倍。

2.3 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較

MCAO組ACI較Sham組顯著升高，NRG組和Ros組ACI較MCAO組明顯下降，差異均有顯著性(F=136.79，P<0.01)；NRG組與Ros組ACI比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖2和表1。

A：Sham組；B：MCAO組;C：NRG組；D：Ros組。箭頭(↑)所示為凋亡細(xì)胞。TUNEL染色，400倍。

2.4 各組大鼠P35/P25陽性細(xì)胞數(shù)比較

MCAO組P35/P25 PCI較Sham組明顯升高，NRG組較MCAO組明顯減少，差異有顯著性(F=105.00,P<0.01);MCAO組與Ros組PCI比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖3和表1。

A：Sham組；B：MCAO組;C：NRG組；D：Ros組。箭頭(↑)所示為P35/P25陽性細(xì)胞。免疫組化染色，400倍。

2.5 各組P35/P25表達(dá)比較

Western blot結(jié)果顯示，MCAO組P35/P25表達(dá)較Sham組明顯增強，NRG組較MCAO組明顯降低，差異有顯著性(F=74.34,P<0.01);MCAO組與Ros組P35/P25表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表1。

表1 各組大鼠各指標(biāo)檢測結(jié)果比較

圖4 大鼠頂-額葉皮質(zhì)缺血半影區(qū)P35/P25表達(dá)的Western blot檢測

3 討 論

腦缺血再灌注引起的神經(jīng)損傷主要包括興奮性氨基酸釋放、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、膠質(zhì)反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等病理機(jī)制。腦缺血中心區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞死亡以壞死為主，半影區(qū)則以凋亡為主。因此，抑制凋亡可以挽救處于早期凋亡狀態(tài)的神經(jīng)元，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。神經(jīng)調(diào)節(jié)素(NRGs)對腦缺血損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和膠質(zhì)反應(yīng)具有顯著的抑制作用[4]。XU等[16]的研究顯示，在永久性MCAO大鼠模型，腦缺血半影區(qū)的NRG1β表達(dá)顯著增強。NRG1β激活其功能性受體酪氨酸激酶受體ErbB3或ErbB4，繼而激活酪氨酸激酶，催化多肽鏈中的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而激活下游信號分子，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

在神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)的病理生理過程中，Cdk5分子的活性失調(diào)[17-18]，繼而引起其底物蛋白過度磷酸化，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和死亡[19]。RASHIDIAN等[20]對腦缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Cdk5過度激活，Cdk5通路過度激活可以解聚細(xì)胞骨架，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。LOVE[21]的研究發(fā)現(xiàn)，p25較p35更能促進(jìn)腦卒中后Cdk5的過度激活。因此，TAN等[22]提出，通過阻斷Cdk5信號通路可能減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而為保護(hù)腦卒中損傷提供可行的治療策略。本文研究結(jié)果顯示，大鼠腦缺血2 h再灌注22 h后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為功能障礙，缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增加，神經(jīng)細(xì)胞P35/P25表達(dá)顯著增強；應(yīng)用NRG1β干預(yù)治療后，神經(jīng)細(xì)胞P35/P25表達(dá)以及細(xì)胞凋亡率均有下降，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯著改善，mNSS評分顯著下降，這與應(yīng)用Cdk5特異性抑制劑Roscovitine的結(jié)果相似。表明NRG1β的作用機(jī)制可能是：通過降低P35/P25表達(dá)，進(jìn)而抑制Cdk5的異常活化，從而發(fā)揮其抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中具有重要作用，Nrg1-ErbB信號可能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而導(dǎo)致環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的膀胱炎的機(jī)械性超敏化，調(diào)節(jié)Nrg1-ErbB信號可能對治療膀胱疼痛綜合征/間質(zhì)性膀胱炎(BPS/IC)疼痛癥狀具有治療價值，而且這一作用機(jī)制與神經(jīng)纖維髓鞘修復(fù)有密切關(guān)系[23]。DING等[24]研究認(rèn)為，NRG-1可以通過PI3K-AKT-mTOR信號通路促使星形膠質(zhì)細(xì)胞反向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而修復(fù)脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維髓鞘的損傷。由此推測，NRG-1的釋放呈遞對中樞神經(jīng)髓鞘再生過程有重要作用，與Cdk5調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生存、移行和突觸功能有一定關(guān)系，但其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NRG1β通過降低P35/P25的表達(dá)而抑制Cdk5信號通路的異?；罨?，從而發(fā)揮一定的抗凋亡以及神經(jīng)保護(hù)作用。