甜菜褐斑病菌分離培養(yǎng)及病程分子鑒定

王錄紅，周翔，李王勝，興旺，譚文勃

（1.黑龍江大學國家甜菜種質(zhì)中期庫，哈爾濱 150080；2.黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院/黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

由植物病原真菌引起的病害，約占植物病害的70%～80%[1]。在一種作物上可同時發(fā)生幾種真菌病害，嚴重影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。其中，由甜菜生尾孢菌（Cercospora beticola）引起的褐斑病是世界范圍內(nèi)最具破壞性的甜菜葉部病害，嚴重影響著三分之一以上的甜菜種植區(qū)[2]。發(fā)病葉片最初呈現(xiàn)褐色或紫色小圓斑，以后斑點逐漸擴大，直徑達2～5 mm，斑點周圍呈褐色邊緣。后期病斑中央呈現(xiàn)灰白色霉層，即為病菌的分生孢子叢。病斑因發(fā)病程度、葉片大小而不同，每片病葉上病斑可達數(shù)十個至上千個，病斑連片后，葉片干枯死亡。一般褐斑病先侵染外層生理成熟的葉片，逐漸向中層葉片發(fā)展，發(fā)病重的外層、中層葉片陸續(xù)枯死，影響甜菜的光合作用和養(yǎng)分輸送，導致植株生長勢衰弱，甜菜塊根產(chǎn)量下降，含糖降低，塊根中灰分和有害氮增加，原料產(chǎn)量和質(zhì)量下降[3]。在中國，甜菜褐斑病一般可使塊根減產(chǎn)15%～20%，含糖率下降0.8～2.0個百分點，病情指數(shù)每增加1個單位，根重減少1.3 g，含糖率降低0.046個百分點[4]。使用殺菌劑抗病，在生產(chǎn)中不僅需要多種殺菌劑聯(lián)合輪換使用，而且在病害嚴重區(qū)域需要多次噴施殺菌劑處理，大量長期地使用藥劑勢必增加經(jīng)濟成本并污染環(huán)境。甜菜抗褐斑病的遺傳育種研究一直是科學家們關(guān)注的重點。1997 年，SMITH 和GASKILL 明確提出甜菜對甜菜生尾孢菌的抗性是數(shù)量遺傳的，主要由4～5 個主要基因控制[5-6]。甜菜的高度抗性和低產(chǎn)基因型相關(guān)，將高抗性和高產(chǎn)結(jié)合起來非常困難，品種的抗性研究有一定局限性[7]。但是，經(jīng)過科研工作者的不懈努力，已經(jīng)獲得了高抗性的單胚和細胞質(zhì)雄性不育系等，為進一步的遺傳育種研究奠定了基礎。因此，從分子生物學入手，通過挖掘真菌病害抗性基因，分子輔助培育抗褐斑病甜菜品種，具有重要的理論意義與經(jīng)濟價值。

針對甜菜褐斑病給制糖產(chǎn)業(yè)帶來的巨大損失，科研工作者一直致力于防治甜菜褐斑病的研究。分子生物學輔助育種需要明確甜菜褐斑病的發(fā)病機理、甜菜生尾孢菌的效應因子和甜菜對病原的免疫反應。為高效開展以上研究，需在實驗室環(huán)境中建立一套成熟的甜菜生尾孢菌產(chǎn)孢和發(fā)病體系。在目前的研究中，關(guān)于誘導甜菜生尾孢菌產(chǎn)生分生孢子和甜菜褐斑病發(fā)病的方法比較模糊，缺乏具體的科學描述和數(shù)據(jù)支撐。在本研究中，針對甜菜生尾孢菌的產(chǎn)孢條件和接種及發(fā)病方法進行探索，成功建立甜菜褐斑病發(fā)病模型，為通過分子生物學技術(shù)研究甜菜褐斑病防治方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜菜生尾孢菌株HL001分離純化來自于黑龍江大學呼蘭校區(qū)試驗田的甜菜褐斑病葉，供試甜菜材料為‘IVms33’。

1.2 試驗方法

1.2.1 甜菜生尾孢菌的分離培養(yǎng)

將取自田間的甜菜褐斑病葉置于體式顯微鏡下，用解剖針挑取病斑部位的孢子。取無菌離心管，加入0.5 mL無菌去離子水，將挑取分離的孢子收集于離心管中。用移液器將收集的孢子懸液滴加在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)觀察。將得到的單孢培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接，得到純培養(yǎng)。

1.2.2 甜菜生尾孢菌的產(chǎn)孢條件試驗

西紅柿培養(yǎng)基：將500 g西紅柿切塊之后放在粉碎機中進行充分粉碎，將得到的西紅柿汁用150 mL的去離子水進行稀釋，用8 層紗布進行過濾。每100 mL的濾液中加入0.3 g CaCO3、2.0 g瓊脂，121 ℃滅菌15 min備用。V8 培養(yǎng)基：每100 mL V8 培養(yǎng)基包含20 mL V8 蔬菜汁、0.3 g CaCO3、2.0 g 瓊脂，去離子水定容后121 ℃滅菌15 min備用。

取直徑為1 cm 的菌餅置于培養(yǎng)基上，用涂抹法將菌絲涂滿整個培養(yǎng)基表面，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中，在25 ℃、14 h 光照/10 h 黑暗光周期條件下培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基分別進行3 次重復。培養(yǎng)72 h 后，培養(yǎng)基上出現(xiàn)白色菌絲。取10 mL 濃度為0.05%的Tween 80溶液，加到培養(yǎng)基上，用三角涂棒刮取菌絲，將懸浮液移入10 mL離心管中，放在平板振蕩器上高速振蕩15 min，振蕩后放在試管架上靜置10 min，吸取上層懸浮液進行多次離心，制備成孢子懸浮液。將孢子懸浮液制片后，用光學顯微鏡觀察。

1.2.3 甜菜褐斑病的發(fā)病條件試驗

將孢子濃縮液倒入噴霧瓶中，加入4 mL濃度為0.05%的Tween 80溶液，充分混合后噴灑于盆栽生長的甜菜葉片的正反面。盆栽病原接種試驗進行3次重復。將甜菜植株放置于植物光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，濕度90%，光周期為14 h光照/10 h黑暗。培養(yǎng)72 h后將植株置于常規(guī)環(huán)境條件進行培養(yǎng)。

1.2.4 科赫氏法則驗證

將發(fā)病的盆栽甜菜葉片取下，在體式顯微鏡下挑取孢子至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。當菌落擴展至整個平板時，刮取菌絲體，提取菌絲基因組DNA。采用引物ITS1 和ITS4，利用菌絲基因組DNA 為模板，進行PCR 反應。反應結(jié)束后，對真菌的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）擴增產(chǎn)物進行測序，得到測序結(jié)果后通過比對進行分子生物學鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜生尾孢菌分生孢子的產(chǎn)生

甜菜生尾孢菌HL001 培養(yǎng)72 h 后，菌苔呈黑灰色，邊緣不規(guī)則；氣生菌絲稀疏，呈灰白色；在西紅柿和V8 培養(yǎng)基上HL001的形態(tài)特征無明顯差異（圖1）。

圖1 甜菜生尾孢菌HL001在西紅柿培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.1 Morphology of Cercospora beticola HL001 on tomato culture medium

在西紅柿培養(yǎng)基上，經(jīng)25 ℃光照培養(yǎng)72 h 得到的甜菜生尾孢菌在顯微鏡下可以觀察到大量分生孢子。在V8 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的甜菜生尾孢菌，沒有分生孢子產(chǎn)生。甜菜生尾孢菌HL001 的分生孢子梗密集成簇，基部顏色較深，上端顏色變淺，有隔膜，不分枝，筆直或略彎曲，前端比較尖。分生孢子單生、透明、披針狀、筆直或略彎曲，隔膜處無縮縊，頂端鈍狀或尖銳狀（圖2）。

圖2 甜菜生尾孢菌HL001的分生孢子和孢子梗形態(tài)Fig.2 Morphology of conidia and conidiophore of Cercospora beticola HL001

2.2 甜菜褐斑病發(fā)病條件的建立

接種甜菜生尾孢菌HL001 的孢子10 d 后，甜菜葉片上開始出現(xiàn)直徑約3 mm 的圓形斑點，中心為灰色，周圍為深褐色（圖3A）。隨著病情的發(fā)展，病斑數(shù)量不斷增加，最終連結(jié)在一起，使得整片葉子干枯并收縮（圖3B 和3C）。病斑從接種葉片逐漸擴散發(fā)展到植株的其他葉片，最終導致整個植株患?。▓D3D），甜菜褐斑病發(fā)病條件成功建立。

圖3 接種甜菜尾孢菌HL001后發(fā)病癥狀Fig.3 Symptom after inoculation of Cercospora beticola HL001

2.3 病原真菌的分子生物學鑒定

測序結(jié)果表明：通過PCR 反應，得到了長度為509 bp 的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（圖4）。序列比對結(jié)果表明：此段序列與接種菌株甜菜生尾孢菌HL001 的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列相似度為100%，這表明盆栽甜菜葉片褐斑病發(fā)病是由接種甜菜生尾孢菌HL001引起的，符合病原學科赫氏法則。

圖4 發(fā)病葉片病原真菌的ITS序列Fig.4 ITS sequence of pathogenic fungus from diseased leaf

3 討論與結(jié)論

尾孢菌是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在的重要病原，危害大豆、玉米等主要糧食作物以及甜菜等多種經(jīng)濟作物。通過分子生物學研究，闡釋病原與作物互作及免疫過程的基因通路，進而對作物進行分子基因輔助育種，是作物病害防治的有效手段。進行以上試驗研究的基礎是建立一套成熟的病原真菌產(chǎn)孢及接種、發(fā)病條件體系，因此植物保護研究人員一直在這方面進行不斷的探索。已有研究表明引起玉米灰斑病的玉蜀尾胞菌在玉米葉粉碳酸鈣瓊脂和玉米瓊脂培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生大量孢子，大豆尾孢菌在利馬豆瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量較高[8-9]。此外，光照和黑暗條件也是影響尾孢菌產(chǎn)孢的重要條件[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，西紅柿培養(yǎng)基適合甜菜生尾孢菌產(chǎn)孢。用西紅柿培養(yǎng)基光照條件下培養(yǎng)甜菜生尾孢菌72 h就可產(chǎn)生分生孢子而且孢子數(shù)量可以滿足接種和發(fā)病的研究需要。研究表明玉米灰斑病菌分生孢子的最適萌發(fā)溫度為25 ℃[12-13]，變灰尾孢菌和黃草褐斑病菌的分生孢子在水滴中即可萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度也為25 ℃[11,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫度和濕度是甜菜生尾孢菌孢子萌發(fā)并致病的關(guān)鍵因素，當接種后前期溫度為28 ℃，濕度90%時能夠?qū)е掳l(fā)病，且后續(xù)表現(xiàn)出明顯的甜菜褐斑病發(fā)病癥狀。

本研究采用甜菜生尾孢菌HL001在西紅柿培養(yǎng)基上使用涂抹方法接種，經(jīng)25 ℃光照培養(yǎng)72 h可以得到大量分生孢子。分生孢子單生、透明、披針狀、筆直或略彎曲，隔膜處無縮縊，頂端鈍狀或尖銳狀。用孢子懸浮液噴灑接種甜菜葉片，溫度28 ℃、濕度90%、光照培養(yǎng)72 h 轉(zhuǎn)入常規(guī)培養(yǎng)，接種10 d 后葉片開始發(fā)病并迅速蔓延到整個植株。本方法可以成功建立甜菜褐斑病發(fā)病條件，為進一步利用分子生物學技術(shù)研究甜菜褐斑病防治奠定基礎。