甘蔗DNA分子指紋圖譜研究進展

張慧，林萍萍，黃潮華，黃國強，徐良年，鄧祖湖，張木清，趙新旺，，3

（1.福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術(shù)研究中心，福州 350002；2.廣西大學廣西甘蔗生物學重點實驗室，南寧 530004；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室，福州 350002）

0 引言

甘蔗是世界第一大糖料作物，廣泛分布在100多個國家，全球種植面積有1 900多萬公頃，年生產(chǎn)甘蔗約1.45億t[1]。中國是“甘蔗屬復合群”中部分資源的起源地和多樣性中心，野生資源十分豐富[2]。我國甘蔗雜交育種起步相對較晚[3]，但也育成了一系列優(yōu)異甘蔗品種，自實施品種登記制度到2021 年2 月，已有79 個甘蔗品種通過新品種登記。甘蔗基因組龐大，十分復雜，具有非整倍、異源多倍體的特性，功能元件探索和全基因組功能注釋工作難度遠超大多數(shù)作物[4-6]。隨著各省、市、自治區(qū)對育種持續(xù)不斷的投入，甘蔗新品種數(shù)量將會不斷增加?！案收岣哔F化育種”的后代大量用于栽培種的培育過程，骨干親本的反復使用，導致新基因資源的缺乏，使得品種間生物學特性差異微小，甚至無法利用表型進行判斷[7-8]。

早期，甘蔗品種（系）鑒定依靠觀察葉芽外形、莖徑等農(nóng)藝性狀，因此受栽培條件與生境影響顯著[9]。此外，多數(shù)甘蔗品種（系）采用雜交、回交的育種方式，骨干親本種質(zhì)資源狹窄，后代遺傳變異微小，僅憑形態(tài)差異難以區(qū)別[10-11]。因此，高效準確地進行品種鑒定對于甘蔗新品種培育推廣和知識產(chǎn)權(quán)保護等具有重要意義。DNA 指紋圖譜技術(shù)為品種鑒別和知識產(chǎn)權(quán)保護提供了有效手段。本文簡述了DNA 指紋圖譜的分類及其原理、特點等，概述了目前國內(nèi)外甘蔗品種（系）分子標記鑒定及指紋圖譜的研究進展，并探討了指紋圖譜在甘蔗種質(zhì)資源區(qū)分與育種研究中的應用，以期為甘蔗的品種（系）鑒定及分子身份證建立提供參考。

1 指紋圖譜的概念、分類及作用

指紋圖譜（Fingerprint）指用遺傳標記鑒別生物個體間差異的色譜圖或光譜圖等[12]。遺傳標記主要分為形態(tài)、細胞學、生化和DNA 標記[13]，指紋圖譜也因此種類很多，主要有化學指紋圖譜和生物指紋圖譜[14]。

化學指紋圖譜是指通過色譜、光譜等方式分析生物個體化學成分特征的圖譜[15]。化學指紋圖譜在衍生產(chǎn)品的品質(zhì)及其產(chǎn)地等方面有一定的掌控和識別作用[16]。如：研究表明高效液相色譜法（HPLC-DAD）指紋圖譜在紅糖質(zhì)量控制上、產(chǎn)品溯源和功效成分的研究方面具有參考價值[17]；構(gòu)建甘蔗的HPLC 指紋圖譜，對其品種（系）的葉片中藥色譜相似度評價具有一定的應用價值[18]。

生物指紋圖譜是具有高度的特異性和穩(wěn)定性，能夠鑒別生物個體或群體的圖譜[19]。主要應用類型有兩種：一種是不受環(huán)境影響、由遺傳決定的同工酶指紋圖譜[20]。如：采用同工酶酶譜分析16 份野生甘蔗‘割手密’，結(jié)果顯示其遺傳多樣性豐富，可分為兩個大類群，表明云南‘割手密’種類豐富與其變化多樣的立體山地環(huán)境密不可分[21]。另一種是由英國遺傳學家JEFFERYS在1985 年提出的分子標記指紋圖譜，即DNA 指紋圖譜[22]（DNA Fingerprinting），是對不同品種基因組DNA序列的不同組成和長度進行識別，獲得其特有的圖紋組成，如人的指紋一樣，因此被稱為DNA指紋圖譜[23]。

DNA 分子指紋圖譜作為主要的品種鑒別手段，近幾年得到了快速發(fā)展。與傳統(tǒng)形態(tài)及化學區(qū)分相比，DNA指紋圖譜優(yōu)勢明顯：①分子標記數(shù)量多，在基因組中廣泛分布；②多態(tài)性高，存在等位基因變異；③在不同的器官組織和發(fā)育階段都能檢測到[24]。如植物種間或種內(nèi)的不同個體，其所含微衛(wèi)星序列中的重復單元以及拷貝數(shù)可能不同，獲得相應圖譜也不同[25]。

2 甘蔗DNA分子指紋圖譜的主要類型

2.1 用于構(gòu)建DNA 指紋圖譜的常用分子標記特點

分子標記是DNA 指紋圖譜的技術(shù)基礎，常用于DNA 指紋圖譜構(gòu)建的分子標記手段，分別具有如下特點（表1）[26-28]：

表1 構(gòu)建指紋圖譜的主要DNA 分子標記特點Table 1 The characteristics of main molecular markers for building a fingerprint map

2.2 分子標記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜在作物分子鑒定的應用

近幾年，分子指紋圖譜在作物分子鑒定上得到了廣泛的應用與發(fā)展。KAMBOURIS 等構(gòu)建馬鈴薯12 種真菌病原體的RFLP 圖譜，并認為該方法將為農(nóng)業(yè)基因組檢測提供思路[29]；KAUR 等構(gòu)建澳大利亞與不同地區(qū)大麥麥芽真菌或細菌16sRNA 基因的末端RFLP 圖譜，有助于高效鑒別并篩選優(yōu)質(zhì)大麥麥芽[30]。ABDELSATTAR等構(gòu)建3 個埃及大豆品種的RAPD指紋圖譜，鑒別得出‘Giza22’品種總酚含量最高[31]；BELLAH等構(gòu)建15 個小麥品種的RAPD 指紋圖譜并篩選到水分脅迫耐受基因型的品種，為小麥抗旱育種提供新思路[32]。SATHYANARAYANA 等構(gòu)建7 個洲25 個黧豆種質(zhì)的AFLP 圖譜并結(jié)合常規(guī)農(nóng)藝性狀，有助于鑒別獲得合適的改良材料[33]。HE 等篩選出48 對SSR 標記順利區(qū)分了33 個標準品種并構(gòu)建了指紋圖譜，為鑒別煙草新品種提供了可靠的技術(shù)支撐[34]；宗凱等順利篩選出3 組SSR引物成功用于‘C 兩優(yōu)513’和‘深兩優(yōu)5814’的種子純度鑒定[35]。ZHAO 等用ISSR 引物探討建立了3 個棉花品種的分子身份證的識別系統(tǒng)及策略[36]；陳志丹等構(gòu)建ISSR指紋圖譜并鑒別了純種鐵觀音和變異鐵觀音茶樹品系[37]。TIAN利用SNP構(gòu)建DNA指紋圖譜并成功區(qū)分了276個玉米雜交種[38]；鄭向華等利用40 個SNP標記鑒定秈粳水稻品種，發(fā)現(xiàn)SNP對水稻有很好的鑒別效果[39]。

2.3 分子標記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜在甘蔗上的應用進展

目前關于甘蔗品種大規(guī)模標準化的分子鑒定鮮有報道，而研究甘蔗遺傳多樣性可以揭示甘蔗的遺傳基礎，了解現(xiàn)有種質(zhì)的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)及品種間的親緣關系，不僅為高效發(fā)掘種質(zhì)資源重要性狀基因打下基礎，而且可為甘蔗標準指紋的構(gòu)建和品種鑒定提供技術(shù)支持。

2.3.1 RFLP圖譜

RFLP（Restriction fragment length polymorphism）是將樣品DNA酶解，再對酶切片段選擇性擴增、電泳、利用放射性標記的探針雜交顯色分型[40]。CHOWDHURY 等利用RFLP 圖譜檢測3 個甘蔗栽培品種與其再生體，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)差異[41]；BESSE等利用RFLP 分子指紋圖譜對13 個來自美國和澳大利亞的甘蔗屬和蔗茅屬材料進行了遺傳多樣性分析[42]，說明了RFLP標記在甘蔗材料鑒定方面具有很大潛力，但使用放射性同位素，對其應用產(chǎn)生較大阻礙。FERRERO 等結(jié)合陰離子交換色譜法構(gòu)建出適用于八倍體甘蔗的非放射性RFLP指紋圖譜[43]，然而，成本較高且步驟依然繁瑣。PERERA 等對甘蔗花葉病相關病毒使用RFLP 指紋圖譜技術(shù)與測序手段分別評估其遺傳多樣性，指出RFLP標記可靠性較低[44]。

2.3.2 RAPD圖譜

RAPD（Random amplified polymorphic DNA）是用隨機引物對基因組DNA 進行PCR 擴增，獲得不連續(xù)的DNA產(chǎn)物的電泳譜帶。具有避免放射性污染、簡潔易行，無需專門設計引物等優(yōu)點。TABASUM 等構(gòu)建了熱帶種和印度種的40 個甘蔗基因型RAPD 指紋圖譜并分析其遺傳多樣性，該研究對當?shù)馗收嵩耘嗥贩N鑒別和種質(zhì)資源保護具有重要意義[45]。NAWAZ 等依據(jù)RAPD 指紋圖譜揭示巴基斯坦甘蔗的系統(tǒng)發(fā)育關系，為RAPD標記在甘蔗指紋圖譜上進一步研究應用提供參考[46]。胡楊等分別構(gòu)建48 種來自不同國家地區(qū)培育的甘蔗品種或親本材料的RAPD 和SSR 指紋圖譜，結(jié)果表明SSR 更好地揭示了品種間的遺傳多樣性和親緣關系的遠近[47]。同時RAPD 技術(shù)的缺點也很明顯，穩(wěn)定性差、重復性低，顯性標記。因此，RAPD技術(shù)在品種鑒定中并未得到廣泛使用。

2.3.3 AFLP圖譜

AFLP（Amplified fragment length polymorphism）將RFLP 的可靠性和PCR 技術(shù)的高效性結(jié)合，有多態(tài)性強、簡單快速和分辨率高的優(yōu)點。LIMA等根據(jù)AFLP指紋圖譜率先分析79個巴西甘蔗栽培種的遺傳相似性和親本系數(shù)呈顯著相關，該結(jié)果為進一步量化甘蔗品種間的相關程度和有效區(qū)分品種（系）提供新思路[48]。劉家勇等構(gòu)建了68 份來自澳大利亞、法國、美國和菲律賓的甘蔗AFLP 甘蔗指紋圖譜[49]；昝逢剛等采用云南省甘蔗育種研究者篩選出的引物組合對98 份甘蔗種質(zhì)材料開展AFLP 指紋圖譜分析[50]，這些結(jié)果都表明AFLP 標記具有多態(tài)性高和可靠性好的特點。然而，AFLP 技術(shù)要求DNA 質(zhì)量、純度較高，需要經(jīng)過酶切、連接接頭、預擴增、選擴增等步驟，過程繁瑣，顯示的是擴增片段長度的多態(tài)性，在區(qū)分長度相同而序列不同的DNA片段中存在困難，因此也沒有大規(guī)模應用。

2.3.4 SSR圖譜

SSR（Simple sequence repeat）又稱微衛(wèi)星DNA，是幾個（一般為1～6 個）堿基組成的簡單串聯(lián)重復序列，重復單元的數(shù)目存在高度變異，這些變異表現(xiàn)為微衛(wèi)星數(shù)目的整倍性變異或重復單元序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多個位點的多態(tài)性。SSR 兩側(cè)的序列一般是相對保守的單拷貝序列，利用這一特性開發(fā)引物，對SSR 位點進行PCR 擴增，即可將區(qū)分該位點的不同等位基因/基因型。SSR 標記具有：(1)數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，多態(tài)性高；(2)多等位基因，信息量大；(3)以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；(4)位點明確，引物開發(fā)簡單，數(shù)據(jù)共享方便等特點，在植物遺傳多樣性分析、品種（系）鑒別方面具有良好的應用前景。

PAN 等構(gòu)建了1 025 份甘蔗種質(zhì)在21 個SSR 位點的分子身份證庫，該結(jié)果為美國甘蔗品種鑒定和種質(zhì)資源的鑒別發(fā)揮了巨大作用[51]；劉新龍等借助8對核心引物分析了27個云南自育甘蔗品種（系），并篩選出了3 對高效核心引物，認為SSR 標記可以很好地區(qū)分甘蔗品種（系）[52]；NAWAZ 等利用50 個SSR 標記對40 份商業(yè)甘蔗材料進行遺傳距離和聚類分析，認為SSR 指紋圖譜可以幫助甘蔗育種者們明確商用甘蔗品種的遺傳譜系和提高育種方法的評估效率[53]。姚春雪等利用SSR技術(shù)構(gòu)建了67份甘蔗與蔗茅雜交不同世代材料的指紋圖譜，探討了甘蔗品系之間同源關系，認為甘蔗與蔗茅雜交后代存在著較為廣泛的遺傳分化[54]。陸鑫等利用SSR 標記對滇蔗茅雜交后代材料進行分子鑒定，確認了62 份雜交后代為‘滇蔗茅’真實雜種，表明SSR 標記對‘滇蔗茅’后代群體鑒別效率較高[55]；HAMEED等利用21個SSR 標記對20個巴基斯坦抗感赤腐病甘蔗材料進行指紋圖譜和遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小部分SSR 衍生出的標記可以幫助識別甘蔗赤腐病抗病和感病品種[56]。劉洪博等以甘蔗骨干親本為參照，構(gòu)建了29 份云南甘蔗創(chuàng)新種質(zhì)的指紋圖譜，展現(xiàn)了創(chuàng)新種質(zhì)與16 份親本間的遺傳基礎差異和多樣性水平，說明云南依賴高山峽谷的特點分布著許多遺傳顯著差異的‘割手密’無性系[57]。賀爾奇等用3 對核心引物構(gòu)建了9 個果蔗品種（系）DNA 指紋圖譜且分析了其遺傳多樣性，3 對引物即可將9個遺傳差異較小的果蔗完全區(qū)分開，表明SSR 遺傳標記在果蔗品種鑒定和分子育種等方面有巨大作用[58]。汪洲濤等分別采用AFLP 和SSR 引物分析了38 個甘蔗新品種的遺傳多樣性，構(gòu)建了甘蔗品種（系）的DNA 分子指紋庫，15對SSR 標記擴增出的位點為9 對AFLP標記擴增的約二分之一，但多態(tài)性比率SSR 標記比AFLP 標記高25.52 個百分點，證實了SSR 標記在甘蔗品種鑒別上具有一定的優(yōu)越性[59]。SIRAREE等分別利用EST-SSR引物和SSR引物對92個印度亞熱帶甘蔗材料進行遺傳多樣性對比分析，發(fā)現(xiàn)兩種類型的標記平均條帶信息量（Average band informativeness）相近，但EST-SSR范圍更大，說明EST-SSR相較SSR 條帶差異更顯著，可能是分子檢測高效工具之一[60]。ALI 等利用21 對熒光標記的SSR 引物對來自甘蔗屬和蔗茅屬的115 份材料進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)SSR 引物在甘蔗屬和蔗茅屬材料的分子鑒定中仍然具有良好的效果[61]。徐超華等使用SSR 引物15 對在92 份‘割手密’初級核心種質(zhì)獲得331個擴增條帶，多態(tài)性條帶比例100%，說明了該SSR標記在核心種質(zhì)之間遺傳多樣性十分豐富[62]。SINGH等利用61對多態(tài)性SSR 引物對139份甘蔗屬、禾本科近緣屬和甘蔗栽培品系進行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)評估，結(jié)果表明SSR 標記在近緣物種鑒別分析中同樣具有良好的效果[63]。周峰等利用80 對SSR 引物對44 個含‘斑茅’血緣的甘蔗回交后代和38 個常規(guī)甘蔗栽培種進行聚類分析，結(jié)果表明SSR 標記能夠很好地區(qū)分‘斑茅’雜交高世代材料[64]。賴小群等篩選父本特異性SSR 標記鑒定‘新臺糖25號’和‘云蔗29-7’F1代群體的真雜種性，為甘蔗遺傳指紋圖譜構(gòu)建和重要性狀的QTL 定位提供可靠材料[65]。這些研究表明，SSR 標記可以很好分析甘蔗遺傳多樣性，也能夠用于品種的鑒定，并且具有良好的應用前景。

2.3.5 ISSR圖譜

ISSR（Inter-simple sequence repeat）是將SSR 序列的3′端或5′端加上2～4 個隨機核苷酸，在PCR 反應中，錨定引物可引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA 片段進行PCR 擴增。王英等使用篩選出7 對多態(tài)性較強的引物對祖親種、栽培種96 份進行分析并構(gòu)建甘蔗ISSR 指紋圖譜[66]；黃河星等用ISSR 標記方法分析了甘蔗栽培種與熱帶種以及‘割手密’之間親緣關系，說明遺傳相似性系數(shù)在0.72 以上時，可以將熱帶種和栽培種歸為一類，‘割手密’和‘斑茅’各一類[67]。程琴等利用10 對ISSR 引物對兩個甘蔗優(yōu)良品系進行分析，明確了兩個品種存在真實性差異，并得出3對核心引物即可用于鑒別兩個品種的結(jié)論[68]。ISSR 克服了AFLP 操作相對繁瑣的缺點，相較SSR、RAPD 多態(tài)性更高，但ISSR 是顯性標記，其基因分型確定性的判別上存在弊端，無法區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型，因此也沒有大規(guī)模的應用。

2.3.6 SNP圖譜

SNP（Single nucleotide polymorphism）是不同個體核苷酸序列上的單個堿基差異，有置換、插入或缺失等不同的形式。作為第三代分子標記，具有密度高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點，已被廣泛用于作物品種的鑒別。檀小輝等利用甘蔗已公布的EST 序列篩選大量SNP 候選位點，為甘蔗SNP 標記的開發(fā)和應用提供一定的參考[69]；GARCIA 等利用分析軟件生成的SNP 去分析評估甘蔗商業(yè)品種F1后代的倍性和等位基因劑量，促進多倍體作物開發(fā)高質(zhì)量遺傳圖譜的構(gòu)建和基因組序列的組裝[70]；Axiom Sugarcane 100K SNP 芯片的設計開發(fā)與高密度遺傳圖譜的建立，為甘蔗高效基因分型與指紋圖譜的構(gòu)建起到推進作用[71-72]；MANIMEKALAI等探討了借助NGS（Next generation sequencing）技術(shù)獲得SNP 陣列對甘蔗品種改良的作用，促進SNP 標記用于指紋圖譜構(gòu)建和品系鑒別[73]?？梢?，SNP已廣泛應用于甘蔗遺傳圖譜繪制和數(shù)量遺傳研究，同時也為甘蔗指紋圖譜構(gòu)建和品種鑒別提供了很好技術(shù)基礎和方向。

以上列舉了最具代表性的6 種分子標記手段，主要基于4 種原理，分別是基于DNA雜交、PCR、限制性酶切和PCR、單核苷酸多態(tài)性（SNP）。其中SSR和SNP優(yōu)勢明顯、應用廣泛，被推薦作為作物品種鑒定和指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的優(yōu)選標記[74]。分子標記種類很多，用于甘蔗指紋圖譜構(gòu)建的標記還有RAMP[75]，而其它的分子標記如：TRAP[76]、SRAP[77]、SCAR[78]、SCoT[79]、InDel[80]在甘蔗上分別用于遺傳多樣性分析、功能驗證、QTL 定位、品種鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建等。而其它開發(fā)的標記如：DAMD、BPS、URP、CBDP、iPBS、CDDP、PAAP 等，由于多態(tài)性效率低、特異性差、數(shù)量有限和開發(fā)成本難度高等，當前基本只用于遺傳研究，而在分子指紋圖譜構(gòu)建及品種鑒定方面應用較少。目前，隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，其中KASP（Kompetitive allele-specific PCR）標記已經(jīng)在水稻[81]、小麥[82]、玉米[83]、大豆[84]等作物上有著大量的研究報道，為甘蔗指紋圖譜構(gòu)建和分子鑒定提供了借鑒。總之，利用分子標記構(gòu)建甘蔗DNA 指紋圖譜為甘蔗品種鑒定和真實性檢測提供了一種有效的手段，可為我國蔗種市場規(guī)范管理和品種權(quán)保護提供技術(shù)保障。

3 甘蔗種質(zhì)分子身份證與指紋圖譜庫的構(gòu)建

3.1 甘蔗種質(zhì)分子身份證與指紋圖譜庫的構(gòu)建

標準樣品、核心引物和標準程序是構(gòu)建品種（系）標準DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫應滿足的3 個基本要求。DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)記錄的方式多樣，其根本都是以電泳帶型為基礎，對電泳圖譜進行數(shù)字化編碼處理。最常見的形式就是將擴增得到的等位基因進行“0/1”數(shù)字化（即根據(jù)有無帶記為“1、0”），所有標記位點的數(shù)據(jù)來表示品種的指紋信息，結(jié)果簡單明了。研究者對數(shù)據(jù)進行分析和適配，并開發(fā)相應的軟件，對各個品種的指紋圖譜進行收錄和整理，極大地方便了新品種、疑似品種的鑒別。目前，我國玉米、水稻兩個作物已經(jīng)完成DNA 指紋圖譜建設并投入使用[85]，這些為甘蔗建庫提供一定的借鑒。

劉新龍等以組合引物（8對引物隨機挑選2對）對27份甘蔗自育材料進行分子鑒定，結(jié)果表明MSSCIR16/MSSCIR36是最佳引物組合，能將所有云南甘蔗自育品種區(qū)分，而且能將10個主栽品種與云南甘蔗自育品種最有效地區(qū)分開，使用國家地區(qū)代碼和品種的國圃號等數(shù)據(jù)共同組成云南甘蔗自育品種的“身份證”[86]。葉琳莉利用Visual Fox Pro9.0 對31 份重要甘蔗無性系的SSR 標記分析結(jié)果為基礎，構(gòu)建了這31 份材料的分子指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)了對甘蔗SSR 分子指紋數(shù)據(jù)的管理和處理，能夠通過對已有數(shù)據(jù)的匹配查找，對甘蔗SSR 分子指紋數(shù)據(jù)進行鑒定檢測，從而達到鑒定區(qū)分品種的目的[87]。改進Rabin-Karp算法的匹配查找部分，提高了數(shù)據(jù)處理速度。游倩等利用7個SSR 和8個EST-SSR 作為基礎核心引物，構(gòu)建181份甘蔗種質(zhì)材料的分子身份證和指紋圖譜，該分子身份證由121 位0～1 數(shù)字組成，代表了15 對SSR 基礎核心引物在該品種中的擴增條帶分布情況[88]。此外，研究還根據(jù)品種的身份證信息構(gòu)建了具有查詢功能的甘蔗SSR 指紋數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含了3個基礎數(shù)據(jù)庫：引物數(shù)據(jù)庫、品種數(shù)據(jù)庫與DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，其中DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫主要包括2 715個0～1 組成的分子ID 和2 715張毛細管電泳圖[88]。該研究構(gòu)建的SSR 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，具有可查詢品種（系）基本信息、品種（系）分子身份證和品種（系）間相似率等基本功能。這些研究為標準甘蔗分子指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建和管理提供了一定借鑒。

3.2 構(gòu)建甘蔗標準指紋圖譜（庫）并執(zhí)行行業(yè)標準，保護品種權(quán)益

從我國開始受理農(nóng)業(yè)植物新品種權(quán)申請，至今已有22 年。截至2020 年10月底，農(nóng)業(yè)植物新品種權(quán)申請3.9 萬件左右，授予品種權(quán)1.5 萬件以上，品種保護從無到有，取得了較好的發(fā)展[89]。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心2021年7月28號公布的數(shù)據(jù)，2021年1—5月，新公布的植物新品種權(quán)數(shù)量達到1 302件[90]。數(shù)量龐大的植物新品種也為品種權(quán)保護工作帶來了巨大壓力。

目前，我國加入的是1978版國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV），未涉及派生品種鑒定的問題。但隨著甘蔗育種進程的推進，派生品種鑒定將成為一大挑戰(zhàn)，而DNA 分子指紋圖譜有望解決這一難題。如果將每個甘蔗品種（系）擴增出的電泳圖譜轉(zhuǎn)換成可視化編碼，建成主要品種（系）DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，利用大數(shù)據(jù)、人工智能等進行智能流暢的管理，可為甘蔗品種系統(tǒng)鑒別提供基礎數(shù)據(jù)支持。同時，標準DNA 指紋圖譜庫將在真?zhèn)舞b定及品種（系）純度檢驗、親緣類群劃分、品種侵權(quán)案件的法律依據(jù)等方面發(fā)揮著巨大的作用。

2013 年以來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部審定通過高粱、甘藍型油菜、大麥等16 個農(nóng)業(yè)植物品種DNA 指紋圖譜鑒定技術(shù)規(guī)程的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準，為構(gòu)建甘蔗標準指紋圖譜提供了借鑒和指導[91]。2018 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也對甘蔗登記品種DNA 指紋圖譜鑒定技術(shù)規(guī)程的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準進行立項，由國家甘蔗工程技術(shù)研究中心負責制定，2021年4月正式發(fā)布。2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也啟動了甘蔗DNA 指紋圖譜庫的構(gòu)建工作。利用SSR 分子標記，構(gòu)建涵蓋我國全部國家級、省級無性系品種和獲植物新品種權(quán)保護的甘蔗品種（系）的分子指紋圖譜，對甘蔗種質(zhì)資源評價、品種鑒別、品種權(quán)益保護等具有重要意義。

4 構(gòu)建甘蔗標準指紋圖譜的思考與展望

目前，DNA 指紋圖譜技術(shù)推動了甘蔗育種的進程，但仍有一些問題亟需思考與解決。在監(jiān)控方面：第一，國家區(qū)試和省級區(qū)試、省間區(qū)試的協(xié)調(diào)關系。當同名更換、仿冒雷同甘蔗品種（系）發(fā)生在不同省區(qū)試之間時，必然涉及協(xié)調(diào)不同試驗管理部門工作關系。第二，品種命名的非唯一性。由于品種（系）名稱不唯一，容易出現(xiàn)同一品種利用不同名字或者不同品種利用同樣名字在多?。▍^(qū)）審定的情況，為品種管理帶來混亂，因為很難核實是育種單位自己對同一品種取了不同的名字，還是盜用他人品種帶來混亂。在檢測方面：第一，實驗誤差較大，檢測過程繁瑣。如SSR 標記，在PCR 結(jié)束后PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）中有銀染顯色等危險繁瑣步驟，且人工讀帶使實驗結(jié)果偏主觀。第二，缺少標準指紋圖譜。相較其他作物，基于SNP 標記分型技術(shù)的甘蔗分子指紋圖譜鮮有報道，而使用SSR 所構(gòu)建的指紋圖譜報道雖多，但由于缺乏統(tǒng)一的引物、標準的實驗流程，因此指紋圖譜的唯一性較差。針對上述提到的問題，提出以下兩點建議：①建立甘蔗品種DNA 指紋鑒定標準試驗體系，采用統(tǒng)一的DNA 提取方式、核心引物組合、PCR 擴增反應程序和反應體系，以及使用毛細管電泳熒光檢測方式避免人工讀帶的誤差；②建立適應復雜多倍體甘蔗品種的標準指紋數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)，不斷健全數(shù)據(jù)種質(zhì)信息表和種質(zhì)庫品種代碼信息，實現(xiàn)品種查詢和真?zhèn)舞b定。