臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)TLR4-NF-κB通路誘導(dǎo)產(chǎn)生regDC治療急性肝衰竭

王琳 吳慧麗 肖興國(guó) 張磊

急性肝衰竭(acute hepatic failure, AHF)為免疫紊亂出現(xiàn)導(dǎo)致嚴(yán)重肝功能衰竭的臨床癥候群，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為DC、T淋巴細(xì)胞等參與了AHF的發(fā)病[1]。Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLR)與炎癥反應(yīng)的關(guān)系研究很多[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSC)已應(yīng)用于治療AHF[3]，但治療機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選取5例AHF患者外周血DC與hU-MSC共培養(yǎng)，體外觀察hU-MSC對(duì)患者單核細(xì)胞衍生的DC免疫調(diào)節(jié)作用，以期為AHF的臨床治療提供新的思路。

資料與方法

一、入組病例

篩選鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科2016年1月至2019年1月5例急性肝衰竭患者。急性肝衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)會(huì)肝衰竭與人工肝學(xué)組與中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)重型肝病與人工肝學(xué)組發(fā)布的《肝衰竭診治指南(2018版)》[4]。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究參與者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

(一)hU-MSC的分離與培養(yǎng) 無(wú)菌條件下采集鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院行剖宮產(chǎn)的足月胎兒臍帶，分離獲得臍帶wharton膠組織，剪碎，0.1%Ⅰ型膠原酶37℃消化4 h后200目篩網(wǎng)過(guò)濾。收集濾液，1 700 r/min、離心8 min，重懸細(xì)胞沉淀接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第三代收集細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定、成脂成骨染色。

(二)人外周血單核細(xì)胞分離及DC體外誘導(dǎo) 取患者肝素抗凝外周靜脈血20 mL，F(xiàn)icol法分離得到白膜層，PBS洗滌細(xì)胞2次，收獲PBMC。用含10 ng/mL GM-CSF、5 ng/mL IL-4和10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；隔天半量補(bǔ)液，培養(yǎng)5 d備用。

(三)hU-MSC與DC共培養(yǎng) hU-MSC融合80%時(shí)，加入絲裂霉素C(10 μg/mL)，37℃孵育4 h，PBS洗滌2次備用。收集培養(yǎng)第6天的DC，與處理后的hU-MSC按照10∶1混合培養(yǎng)于含有100 ng/mL TNF-α和10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行流式表型鑒定。

(四)DC流式標(biāo)記和檢測(cè) 取1×105細(xì) 胞于流式管，加入FITC-Lineage Cocktail 1、PE-anti-hunan HLA DR、APC-750-anti-human CD11c、APC-anti-human CD80或 APC-anti-human CD86，抗體用量按照說(shuō)明書(shū)推薦量使用，標(biāo)記總體積為100 μL。設(shè)置同型對(duì)照管，加入相同濃度的同型對(duì)照抗體。

(五)多因子檢測(cè) 采集24 h hU-MSC與DC共培養(yǎng)細(xì)胞上清液，使用LEGENDplex自定義11細(xì)胞因子檢測(cè)板，根據(jù)說(shuō)明書(shū)分析以下11個(gè)因子：IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6 、IL-10、TNF-β、IFN-γ、IL-17A、IL-12p40、IL-4和TNF-α。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行，以確保加載標(biāo)準(zhǔn)。最后用Cytoflex流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，Krefeld，美國(guó))進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)通過(guò)Legendplex V8.0軟件(Biolegend)進(jìn)行分析。

(六)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 收取DC，加入細(xì)胞裂解液 Buffer(62.5 mmol/L Tris-HCl，2% SDS，10% 甘油，50 mmol/L DTT，1 mmol/L Na3VO4，cocktail proteinase inhibitor，0.01%w/v 溴酚藍(lán))勻漿，經(jīng)超聲破碎后，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，分別與 NF-κB-p65、IKKα及TLR4抗體4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗37℃孵育90 min，ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

(七)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異分析 提取5例患者共培養(yǎng)前后DC總RNA，選取其中RNA完整且同時(shí)量足夠的3例患者RNA，去除 rRNA，探針?lè)兓痳RNA并進(jìn)行片段化。應(yīng)用非接觸式全自動(dòng)超聲波破碎儀，將RNA打斷成100～300 bp，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并構(gòu)建文庫(kù)。利用 T4 DNA 連接酶將 illumina 測(cè)序接頭連接至文庫(kù) DNA 兩端，進(jìn)行文庫(kù)片段篩選。采用 Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)，2×150 bp 雙端測(cè)序策略對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。采用Deseq2軟件分析兩兩分組的case 組與 control組的差異表達(dá)基因。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。2組間數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、hHU-MSC的生物學(xué)特性及鑒定

觀察第3代hU-MSC呈成纖維樣，細(xì)胞大小與形態(tài)均一、排列有序定向分化(圖1A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hU-MSC可成功誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞(圖1B)和骨細(xì)胞(圖1C)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)hU-MSC表面標(biāo)記顯示，CD90、CD105、CD73為陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為94.38%、99.86%、99.86%，而CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR為陰性表達(dá),符合國(guó)際上對(duì)hU-MSC的界定。

A：第3代hU-MSC；B：脂肪細(xì)胞；C：骨細(xì)胞

二、DC細(xì)胞形態(tài)

1. imDC：培養(yǎng)第3天時(shí)，細(xì)胞周邊出現(xiàn)較短的樹(shù)突狀突起，且細(xì)胞呈現(xiàn)聚集生長(zhǎng)，并且此現(xiàn)象隨時(shí)間增加愈發(fā)明顯，此時(shí)形成的細(xì)胞即為 imDC；2. maDC 形態(tài)(圖2A)：向 imDC 中(培養(yǎng)第 4～5 天)加入 TNF-α后成簇的imDC逐漸分開(kāi)，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞外突起增多、變長(zhǎng)，此時(shí)即形成 maDC；3. regDC形態(tài)(圖2B)：共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)imDC粘附生長(zhǎng)，形態(tài)與maDC相比有一定差別，新細(xì)胞樹(shù)突較少，在TNF-α的作用下，形態(tài)沒(méi)有大的改變。

三、DC細(xì)胞表型鑒定

imDC高表達(dá)CD11b，低表達(dá)CD11c，共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)也相對(duì)比較低，I-A的表達(dá)量也不高；maDC高表達(dá)I-A，共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)量較 imDC高，但是其低表達(dá)CD11b；regDC高表達(dá)CD11b，低表達(dá)共刺激分子CD80、CD86，二類分子I-A的表達(dá)量較低。regDC的表型具有CD11b high CDIa low CD11c low的特點(diǎn)，與maDC相比，共刺激分子CD80、CD86呈低水平表達(dá)，與imDC比較相像。 與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組DC的表型具有 CD11b high Ia low CD11c low的特點(diǎn)，與maDC相比，共刺激分子 CD80、CD86 呈低水平表達(dá)，與 imDC比較相像(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析DC及hU-MSC+DC組表型

A：maDC；B：regDC

圖2 hU-MSC共培養(yǎng)誘導(dǎo)FHF患者外周血DC形態(tài)(×100)

四、LEGENGplexTM多因子流式檢測(cè)

MSC與DC細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測(cè)了DC細(xì)胞因子的分泌情況MSC-DC組IL-10、IL-12p40表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增多，IL-1α 、IL-1β和IL-6 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯減少(表1)。

表1 DC與hUC-MSC共培養(yǎng)前后細(xì)胞因子表達(dá)的比較(pg/mL，±s)

五、蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)TLR4、IKKα與NF-κB-p65蛋白表達(dá)變化

hU-MSC共培養(yǎng)組NF-κB-P65與TLR4表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而IKKα蛋白表達(dá)高于對(duì)照組；NS398處理組NF-κB-P65與TLR4表達(dá)水平明顯低于共培養(yǎng)組及對(duì)照組，IKKα蛋白表達(dá)明顯高于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 TLR4、IKKα與NF-κB-p65蛋白表達(dá)水平(±s)

六、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析MSC處理后的DC基因表達(dá)譜的改變

MSC與DC共培養(yǎng)后對(duì)FHF患者外周DC有一定的影響，選取5例患者M(jìn)SC-DC，以每例患者非MSC共培養(yǎng)組DC為對(duì)照組，進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較兩組全部表達(dá)差異的基因。MSC-DC和DC組共有2 790個(gè)表達(dá)差異的基因(≥2倍，或≤0.5 倍)。與DC組相比，MSC-DC組分別有2 127個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，663個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因(圖4)。

注：紅色表示樣本相對(duì)于對(duì)照樣本表達(dá)量上調(diào)的基因，綠色表示下調(diào)基因，藍(lán)色表示無(wú)顯著差異的基因

圖4 差異基因表達(dá)火山圖

討 論

MSC已被證明可以干擾DC的分化，MSC具有抑制單核細(xì)胞分化為未成熟DC的能力，并且這種抑制作用是可逆的[5]。有研究表明，與MSC共培養(yǎng)的DC，即使暴露于成熟因子，仍不表達(dá)CD83，并且未能表現(xiàn)出成熟標(biāo)志物，如MHCⅡ類分子，CD40或CD86的上調(diào)[6]，與本研究結(jié)果一致。表明MSC抑制DC的分化，導(dǎo)致未成熟DC的形成，并表現(xiàn)出抑制功能或抑制性表型。

DC在AHF的發(fā)病機(jī)制中分為兩個(gè)階段：①DC的前體細(xì)胞即單核細(xì)胞迅速進(jìn)入血液循環(huán)；②DC遷移至受損的肝臟組織并被活化，并分化為成熟的DC，同時(shí)活化淋巴結(jié)中的T細(xì)胞使其向受損的肝臟遷移。LPS誘導(dǎo)的肝臟DC細(xì)胞活化，并分泌大量TNF、IL-4、IL-5等，在AHF發(fā)病中起關(guān)鍵作用[7]。而調(diào)節(jié)regDC也是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)MSC誘導(dǎo)的regDC表現(xiàn)出髓系分子CD11c、提呈分子Ia和共刺激分子CD80、CD86表達(dá)下調(diào)，而CD11b的表達(dá)上調(diào)，這表明MSC誘導(dǎo)出了一種不同的DC群體。本研究顯示，MSC-DC組分泌的IL-1α、IL-1β、IL-6降低，但I(xiàn)L-10增加，這是regDC群體的一個(gè)特點(diǎn)。由于體外誘導(dǎo)DC分化成熟需要IL-4和TNF-α，因此目前無(wú)法分析這兩種因子的促炎作用，但是提示MSC可以通過(guò)調(diào)節(jié)DC的分化進(jìn)而分泌抗炎細(xì)胞因子、抑制促炎細(xì)胞因子行使免疫調(diào)節(jié)作用。

TLR作為一種重要的PRR，主要表達(dá)于DC細(xì)胞表面，構(gòu)成機(jī)體抵御病原體入侵的第一道屏障[8]。LPS與TLR4結(jié)合后，通過(guò)受體本身胞內(nèi)段的結(jié)構(gòu)域募集接頭分子MyD88，活化IKKα、IKKβ、IKKγ，最終激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，相關(guān)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 、 IL-1β和趨化因子，對(duì)病毒進(jìn)行原始攻擊,發(fā)揮天然免疫的作用，同時(shí)促進(jìn)DC的成熟，從而啟動(dòng)獲得性免疫[9]。有研究表明，COX-2 抑制劑發(fā)揮抗炎和抗增殖作用主要通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB或AP-1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)來(lái)減弱NF-κB的表達(dá)[10]。本研究結(jié)果表明，共培養(yǎng)后，NF-κB-p65與TLR4蛋白水平表達(dá)明顯下降，而IKKα由于組蛋白修飾減少而表達(dá)量上調(diào)，以NS398阻斷NF-κB 下游基因COX-2表達(dá)的條件下觀察hU-MSC對(duì)DC的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制, NF-κB-p65與TLR4蛋白表達(dá)繼續(xù)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，而IKKα蛋白表達(dá)再次顯著上調(diào)。提示hU-MSC可能通過(guò)調(diào)節(jié)AHF患者DC的分化成熟進(jìn)而影響與TLR4的結(jié)合，從而導(dǎo)致IKKα激活的減少，使得NF-κB-p65絲氨酸635磷酸化受阻，最終阻斷NF-κB通路影響炎性因子的產(chǎn)生。

本研究通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出上調(diào)表達(dá)TOP20的基因中有八個(gè)與炎性因子負(fù)調(diào)控明顯相關(guān)。這些差異表達(dá)基因有助于優(yōu)化治療方案，選取可用于診治的基因做進(jìn)一步研究。

綜上所述，hUC-MSC通過(guò)TLR4/NF-κB/COX-2信號(hào)通路抑制DC的分化及成熟，產(chǎn)生regDC進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)抑制炎性因子和炎性介質(zhì)過(guò)表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子表達(dá)，有效降低全身炎癥反應(yīng)發(fā)生率，最終緩解急性肝衰竭的進(jìn)展。