甘薯葉片的抗氧化活性和相關(guān)成分比較

石 婕，符雪影，吳 強，梁清干，朱國鵬，祝志欣

（1.海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院,海口 570228;2.海南大學(xué) 園藝學(xué)院/海南省熱帶園藝作物品質(zhì)調(diào)控重點實驗室,?？?570228）

甘薯（Ipomoea batatas）是旋花科（Convolvulaceae）甘薯屬（Ipomoea）草質(zhì)藤本植物，又名地瓜、紅薯或紅苕。甘薯耐貧瘠、易栽培，其地下塊根是亞洲地區(qū)重要的糧食和經(jīng)濟作物，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點[1]；其葉可以作為蔬菜，含豐富的Ca、Mg、Na、K、Fe、Cu、Zn 等礦物質(zhì)[2]和可溶性纖維、維生素、煙酸、生物素等[3]，營養(yǎng)價值較高。與紅甘藍、葡萄和紫色玉米等果蔬相比，甘薯葉提取物的抗氧化活性較強[4]，是世界衛(wèi)生組織推薦的保健蔬菜[5]。攝入抗氧化性食品不僅可幫助人體清除體內(nèi)的自由基，提高免疫能力，降低人體患血脂和心血管疾病的風(fēng)險，還有抑制腫瘤細胞増生、預(yù)防慢性疾病的功效[6-7]。甘薯葉營養(yǎng)豐富，已被報道的主要抗氧化成分包括酚類和維生素C 等[8]，其中酚類是甘薯葉具有優(yōu)秀抗氧化性的重要原因[9-10]，這與大多數(shù)蔬菜不同。席利莎[9]對40 種甘薯莖葉進行抗氧化活性和多種營養(yǎng)素含量間相關(guān)性分析，結(jié)果表明，甘薯莖葉的抗氧化活性與酚類含量間的相關(guān)系數(shù)最高（R=0.758 9，P<0.000 01）。邱俊凱等[10]對58 個不同品種甘薯葉中的粗蛋白、粗脂肪、膳食纖維、維生素、多酚、黃酮類物質(zhì)進行含量及抗氧化活性相關(guān)分析，結(jié)果表明，甘薯莖葉中主要的抗氧化活性物質(zhì)為多酚類。植物酚類包含酚酸、黃酮和花青素等，其中花青素是肉眼可見的一類色素，在葉片中表現(xiàn)為紅紫色，被認為是“看得見的抗氧化性”[11]。馬小磊等[12]研究表明紅紫色甘薯葉具有更高的抗氧化能力。葉綠素和類胡蘿卜素這2 種主要色素與抗氧化性的相關(guān)性也被報道：張兵等[13]在獼猴桃中鑒定到的5 種葉綠素都具有一定的抗氧化活性；王紫璇等[14]文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素可抑制、消除體內(nèi)的游離基，具有減緩衰老和提高抵抗力等效能，但此3 類色素與蔬菜抗氧化性的綜合關(guān)系鮮有研究。甘薯葉是開發(fā)優(yōu)質(zhì)保健蔬菜的良好材料，目前商品化的菜用甘薯基本為全綠表型。筆者選取海南地區(qū)栽種的10 個甘薯品種的葉片為材料，采用比色法，對其花青素、葉綠素、類胡蘿卜素、總酚和總黃酮含量進行測定，結(jié)合ABTS（2,2′-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）和DPPH（2,2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2,2′-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除能力所表征的抗氧化活性，綜合分析不同品種甘薯葉片中各類物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性，旨在為海南省保健型菜用甘薯的品種選育工作提供理論依據(jù)，并為甘薯葉的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料實驗材料包含海南地區(qū)栽種的7 個菜用型甘薯和3 個塊根利用型甘薯（表1），其中‘福薯7-6’是菜用甘薯的代表品種，葉片全綠；‘徐紫菜8’、‘渝15’、‘寧紫薯1’和‘川山紫’葉片帶有不同程度的紫紅色表型，其中‘徐紫菜8’為本研究中唯一一種葉片明顯帶紫色的菜用甘薯品種。將所有材料統(tǒng)一種植于海南大學(xué)海甸校區(qū)農(nóng)科基地（東經(jīng) 110°19′8″，北緯 20°3′39″），常規(guī)水肥管理。各甘薯品種扦插1.5～2 個月后，收集藤蔓頂端約12 cm 的莖段（5～8 片葉片），3 個莖段上所有葉片剪碎混合后作為一個生物學(xué)重復(fù)，進行后續(xù)各生理指標的測量。每個生理指標測量均進行3 個生物學(xué)重復(fù)。

表1 海南地區(qū)10 個甘薯品種的基本特性Tab.1 Basic characteristics of the 10 sweetpotato varieties in Hainan

1.2 方法

1.2.1 徒手切片參考WANG 等[15]方法，對甘薯的葉肉和葉脈進行徒手切片，并立刻進行臨時裝片和顯微觀察，以防止色素的流失。將顯微鏡調(diào)至合適的視野和倍數(shù)后進行拍照。

1.2.2 花青素含量的測定根據(jù)LUO 等[16]和SUN 等[17]的方法，取1 g 葉片材料于10 mL 1%鹽酸—甲醇（V/V）中進行研磨提取，適當稀釋過濾液，分別在525、657 nm 處測吸光度，計算花青素含量。

式中：花青素含量單位為（mg·g-1）；A525和A657分別為樣品在525、657 nm 處的吸光度，其中A525為花色苷的吸收主峰，0.25×A657為對葉片中額外提取出的少量葉綠素的本底消除；V為提取液總體積（mL）；DR（dilution rate）為稀釋倍數(shù)；M為Cy-3-Glu（矢車菊色素-3-葡萄糖苷）的相對分子質(zhì)量（449）；ε 為Cy-3-Glu 的消光系數(shù)（29 600）；m為樣品鮮質(zhì)量（g）。組織樣品均以鮮質(zhì)量（fresh weight，F(xiàn)W）表示；每個樣品測量都進行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 葉綠素和類胡蘿卜素含量的測定參照古麗江等[18]和DENG 等[19]實驗方法，取1 g 葉片材料，用10 mL 95%乙醇進行研磨提取，適當稀釋過濾液，在665、649、470 nm 下測吸光度，計算類胡蘿卜素和葉綠素含量，其中葉綠素含量為葉綠素a 和葉綠素b 兩者含量之和。組織樣品均以鮮質(zhì)量（fresh weight，F(xiàn)W）表示；實驗進行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 總酚和總黃酮含量的測定參照劉子金[20]的方法，取1 g 葉片材料于10 mL 75%乙醇溶液中研磨。4 ℃，10 000 r·min-1下離心1 min 后取上清液并過濾，用75%乙醇溶液補至10 mL，此時樣品提取液濃度為100 g·L-1?？偡拥臏y定，參照文獻[20]采用福林酚法，以沒食子酸（Gallic acid，GAE）制作標準曲線并得到回歸方程，對各樣品在760 nm 下測吸光度，代入回歸方程計算總酚濃度。結(jié)果以每克鮮質(zhì)量樣品所含的沒食子酸當量（mg·g-1）表示，實驗進行3 次生物學(xué)重復(fù)。總黃酮的測定包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇和雙黃酮物質(zhì)的總含量，但不包含花青素的含量。參照文獻[20]采用氯化鋁顯色法，以蘆丁（Rutin）制作標準曲線并得到回歸方程，在508 nm 波長下測吸光值，代入回歸方程計算各樣品中的總黃酮含量。結(jié)果以每克鮮質(zhì)量樣品中所含的蘆丁當量（mg·g-1）表示，實驗進行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 抗氧化測定通過測定ABTS 和DPPH 自由基清除能力來估算各甘薯品種葉片的抗氧化性。參照劉子金[20]的方法進行樣品的提取和測量，提取步驟與總酚和總黃酮相同，樣品測量分別在734、517 nm處進行，結(jié)果以清除率表示。

式中，A0表示空白對照管的吸光值，A1表示加入樣品后的吸光值。

ABTS 和DPPH 自由基清除能力最終結(jié)果采用IC50值（concentration for 50% inhibition；即體系中自由基清除率達到50%時的樣品濃度）進行定量計算。IC50值越小，代表其抗氧化能力越高，所有測定均進行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)以3 個生物重復(fù)的平均值和標準誤差（SE）表示。采用SPSS 23 進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和鄧肯檢驗（Duncan’s test），P<0.05 為差異顯著；采用Pearson 雙向分析得到葉片營養(yǎng)物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)（R）；采用Excel 2010 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯葉色素的組織定位和含量測定葉片色素不僅與植株長勢相關(guān)，很可能也與植株抗氧化性直接相關(guān)。本研究甘薯品種的葉片切片結(jié)果如圖1 所示，包括葉片全綠的‘福薯7-6’、葉片帶紅色的‘川山紫’、‘徐紫菜8’和‘渝15’?！Ｊ?-6’葉片上下表皮透明，葉肉為綠色，未觀察到花青素的積累（圖1-A）。‘川山紫’幼葉為紅色，成熟葉為綠色；其幼葉切片圖顯示花青素積累于葉片和葉脈的上下表皮及葉肉柵欄組織的上層細胞，而海綿組織為全綠（圖1-B）；‘川山紫’成熟葉的切片圖未發(fā)現(xiàn)花青素積累（圖1-C）?！熳喜?’和‘渝15’葉片呈帶紫暈的表型，切片圖顯示它們?nèi)~片和葉脈的上下表皮積累花青素，而葉肉為綠色，與紫暈表型對應(yīng)；與‘徐紫菜8’ 相比較，‘渝15’葉肉部分綠色更深（圖1-D，E）。

圖1 甘薯品種葉切片圖A.‘福薯7-6’；B.‘川山紫’幼葉；C.‘川山紫’成熟葉；D、E.‘徐紫菜8’和 ‘渝15’的葉片及葉脈切片。上方為葉片切片圖，下方為葉脈切片圖。圖中各標尺均代表100 μm 長度。Fig.1 Cross sections of representative leaves of the sweetpotato varietiesA:Sweetpotato ‘Fushu 7-6’;B:Young leaf of ‘Chuansanzi’;C:Mature leaf of ‘Chuansanzi’;D,E:Leaves and leaf veins of‘Xuzicai 8’ and ‘Yu 15’.

各甘薯品種葉片的花青素、葉綠素和類胡蘿卜素含量測定結(jié)果如圖2 所示?；ㄇ嗨睾浚▓D2-A）：葉片帶紅色的4 個甘薯品種顯著高于其他葉片全綠的品種，‘徐紫菜8’和‘渝15’花青素含量最高，其次為‘寧紫薯1’和‘川山紫’。葉綠素含量（圖2-B）：‘渝15’最高，其次為‘福薯7-6’和‘廣薯5 號’，‘海大7798’和‘湘菜薯3 號’的葉綠素含量最低。類胡蘿卜素含量：各甘薯品種差異不大（圖2-C），范圍值為0.124～0.211 mg·g-1，平均含量為0.161 mg·g-1，各品種間的相對數(shù)據(jù)與葉綠素含量趨勢表現(xiàn)一致。

圖2 不同甘薯品種葉片的色素含量A.花青素含量；B.葉綠素含量；C.類胡蘿卜素含量。Fig.2 Pigment contents in the leaves of the 10 sweetpotato varietiesA:Anthocyanin content;B:Chlorophyll content;C:Carotenoids content.

綜合葉切片和色素測定結(jié)果，葉片紅色表型與花青素含量直接相關(guān)，綠色葉片基本沒有花青素積累?！?5’為塊根利用型甘薯，其葉片的花青素、葉綠素和類胡蘿卜素水平均較高；菜用甘薯中的‘福薯7-6’和‘廣薯5 號’含有較高的葉綠素和類胡蘿卜素，而‘徐紫菜8’含有較高的花青素。

2.2 總酚和總黃酮含量比較總酚含量（圖3-A）：‘福薯7-6’（4.61 mg·g-1）和‘川山紫’（5.78 mg·g-1）的總酚顯著低于其他品種；其余8 個品種的總酚含量數(shù)值接近（6.88～7.83 mg·g-1），‘渝15’總酚含量最高（7.83 mg·g-1）。總黃酮含量（圖3-B）：各品種的數(shù)值差異幅度較大，‘徐紫菜8’和‘渝15’的總黃酮含量顯著高于其他8 個品種；‘川山紫’和‘福薯7-6’總黃酮含量最低，‘福薯7-6’總黃酮含量（11.84 mg·g-1）約為‘徐紫菜8’（49.14 mg·g-1）的四分之一。綜合各品種甘薯葉片總酚和總黃酮的數(shù)據(jù)，‘渝15’和‘徐紫菜8’的總酚和總黃酮較高，而‘川山紫’和‘福薯7-6’的總酚和總黃酮顯著低于其他8 個甘薯品種。

圖3 不同甘薯品種葉片的總酚和總黃酮含量A.總酚含量；B.總黃酮含量。Fig.3 Contents of total phenolics and total flavonoids in the leaves of the 10 sweetpotato varietiesA:Total phenolics content;B:Total flavonoids content

2.3 抗氧化能力的比較各品種甘薯葉片抗氧化性的定量以ABTS 和DPPH 自由基清除能力的IC50值顯示，IC50值越小，代表抗氧化能力越高。表2 結(jié)果表明，在ABTS 自由基清除能力測定中，抗氧化能力最強的是‘渝15’，IC50=（0.78 ± 0.11 ）g·L-1；其次為‘徐紫菜8’；最低為‘福薯7-6’，IC50=（8.69 ± 1.09）g·L-1；其余7 個品種ABTS 的IC50數(shù)值接近。各甘薯品種DPPH 的IC50數(shù)值變化幅度較大，‘渝15’和‘徐紫菜8’DPPH 的IC50數(shù)值最低，清除率顯著高于其他8 個品種?！畬幾鲜?’、‘湘菜薯3 號’及‘臺農(nóng)71’略高于‘廣薯5 號’和‘薯綠2 號’?！Ｊ?-6’的DPPH 清除率力較低，但清除力最低的甘薯品種為‘川山紫’，IC50=（24.88 ±1.18 ）g·L-1。綜合比較ABTS 與DPPH 自由基清除能力，‘渝15’和‘徐紫菜8’抗氧化性較強，‘寧紫薯1’、‘湘菜薯3 號’和‘臺農(nóng)71’的抗氧化性表現(xiàn)也不錯，而‘福薯7-6’和‘川山紫’的抗氧化能力最差。

表2 不同甘薯葉片抗氧化能力Tab.2 Antioxidant activities of the leaves of the 10 sweetpotato varieties

2.4 抗氧化性與色素、總酚和總黃酮含量相關(guān)度分析各品種甘薯葉片的抗氧化性與3 種色素、總酚、總黃酮含量相關(guān)性如表3 所示。雖然ABTS與DPPH 代表的抗氧化性指標稍有差異，但它們的數(shù)據(jù)呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。ABTS 和DPPH與總黃酮和花青素呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；與總酚呈正相關(guān)，但不顯著（P>0.05），可能因總酚含量的數(shù)值在各品種差別不大導(dǎo)致?？傸S酮與總酚、花青素呈顯著正相關(guān)（P<0.05），但總酚和花青素之間關(guān)聯(lián)度不大。葉綠素和類胡蘿卜素是植物進行光合作用的重要物質(zhì)，而花青素為額外的次生代謝色素。3 種色素中，葉綠素與類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關(guān)，與花青素關(guān)聯(lián)度不大，表明葉綠素和類胡蘿卜素作為光合復(fù)合物成員比例恒定[21]，而與花青素呈相互獨立的關(guān)系。綜合來說，甘薯葉抗氧化性與黃酮和花青素相關(guān)性最高，與葉綠素也有較高的相關(guān)度，而與總酚的相關(guān)度未達到顯著。

表3 不同甘薯葉片抗氧化能力與各指標的相關(guān)性Tab.3 Correlation between antioxidant activities and various indexes in the leaves of the 10 sweetpotato varieties

3 討論

目前國內(nèi)甘薯莖葉的利用程度普遍較低，除少部分用作蔬菜和飼料外，大部分被隨意丟棄，造成資源浪費[22]。海南省地處熱帶季風(fēng)氣候區(qū)域，氣候復(fù)雜多樣，歷來是臺風(fēng)、干旱和洪澇等農(nóng)業(yè)自然災(zāi)害頻發(fā)地區(qū)。甘薯耐貧瘠、易栽培，甘薯葉頂尖部分可反復(fù)采摘，當災(zāi)害發(fā)生蔬菜供應(yīng)不足時可作有效補充。

近年來，隨著人們保健理念的增強以及菜用甘薯的開發(fā)，甘薯葉越來越受消費者喜愛[5]。目前商品化的菜用甘薯基本為全綠表型，關(guān)于其活性成分報道主要集中在酚類中無色的總酚和黃酮。本實驗除了測定總酚和總黃酮的含量外，還加入了甘薯葉色相關(guān)的3 種色素（花青素、葉綠素和類胡蘿卜素）的直接切片觀察及含量測定，并比較分析了以上各類物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性。葉片切片結(jié)果顯示，葉片表型與其色素分布基本吻合：全綠葉片無花青素積累；‘徐紫菜8’和‘渝15’紫暈表型對應(yīng)表皮細胞中花青素的積累；‘川山紫’幼葉紅葉表型對應(yīng)柵欄組織中額外的花青素分布。以上結(jié)果與馬小磊等[12]對‘徐紫薯3’的莖葉切片結(jié)果一致。本研究中，甘薯葉ABTS 和DPPH 自由基清除能力與總黃酮和花青素含量呈顯著正相關(guān)（P<0.01），與黃酮和花青素的功能相符。靳艷玲等[23]對不同甘薯品種的葉、藤、皮、肉4 個部位抗氧化活性分析發(fā)現(xiàn)，甘薯葉中的黃酮類化合物對DPPH 自由基清除能力較強；王永徐[22]研究表明，‘臺灣紅’甘薯葉花青素含量較高，抗氧化活性也較強，與本研究結(jié)果相符。本研究中，甘薯葉抗氧化活性與總酚含量雖呈正相關(guān)，但未達到顯著（P>0.05），此結(jié)果與前人報道的多酚是甘薯葉最關(guān)鍵的抗氧化物質(zhì)的結(jié)論不太吻合[9-10]。對本研究的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，各甘薯品種總酚含量在數(shù)值上差異不大，很可能導(dǎo)致了總酚含量與抗氧化活性在相關(guān)性檢測中并未達到顯著。3 種色素中，抗氧化活性與花青素含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），而與類胡蘿卜含量相關(guān)度未達到顯著。以上結(jié)果反映了甘薯葉中的葉綠素和類胡蘿卜主要以光合色素形式存在，行使光合作用的功能[21]，與獼猴桃果實積累的葉綠素意義存在差異[13]。本研究中，不同甘薯品種葉片的葉綠素、花青素、總酚和總黃酮等成分的含量差異反映了基因型所導(dǎo)致的遺傳性狀差異，而各類物質(zhì)含量的相關(guān)性則反映了代謝途徑的關(guān)聯(lián)性[11-12]：如花青素和總黃酮都隸屬于類黃酮，合成途徑有較多重疊，其含量在本研究呈現(xiàn)高度相關(guān)（P<0.01）；而總酚成分的合成主要依賴于苯丙烷途徑，此途徑位于類黃酮途徑更上游，屬于更基本的代謝途徑，總酚含量在各品種間的變異也較小。

甘薯葉是開發(fā)優(yōu)質(zhì)保健蔬菜的良好材料。本研究結(jié)果表明，各甘薯品種葉片中酚類含量差異較小，而其總黃酮和花青素含量是抗氧化差異的主要因素?；ㄇ嗨刈鳛椤翱吹靡姷目寡趸浴?，與甘薯葉的抗氧化活性極顯著相關(guān)，表明在進行保健型菜用甘薯選育時，可直接根據(jù)葉片顏色對其抗氧化性能進行初步的直觀判斷，可以節(jié)約人力物力資源，降低育種工作成本。