根癌農(nóng)桿菌介導的新暗色柱節(jié)孢菌遺傳轉化

王 猛，王周雯，丁 一，徐 敏，郭攀陽，劉成立，李佳雪，李 濤，韋雙雙，湯 華

（海南大學 熱帶作物學院/海南熱帶生物資源可持續(xù)利用國家重點實驗室培育基地，?？?570228）

火龍果 (Hylocereus polyrhizus) 屬于仙人掌科的熱帶植物，原產(chǎn)于中美洲和南美洲[1]?；瘕埞麑嶎伾聋惒⒑卸喾宇惢衔颷2]，紅肉火龍果含有甜菜紅素[3-4]等豐富的生物活性成分，具有抗氧化、清腸通便等多種生理功能，有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值[5-7]。近年來，火龍果在我國種植面積增長十分迅速，截至2020 年，我國火龍果種植面積已經(jīng)超過6.67 萬 hm2。隨著種植面積的擴大，火龍果的病害問題日趨嚴重，其中危害最嚴重的是火龍果潰瘍病[8-9]。2012 年，火龍果潰瘍病在中國臺灣首次被報道[10]，隨后在馬來西亞、以色列、墨西哥、美國、尼加拉瓜和中國的廣東、廣西、云南、貴州、海南等火龍果種植區(qū)均有發(fā)現(xiàn)[9,11-12]，火龍果潰瘍病嚴重危害火龍果的產(chǎn)量和品質(zhì)，在夏季，火龍果莖部潰瘍病病株發(fā)病率高達60%，該病具有發(fā)病快、傳播廣、危害大等特點。經(jīng)研究表明，引起該病的病原菌為新暗色柱節(jié)孢菌(Neoscytalidium dimidiatum)[13]，該病菌主要損害火龍果樹的莖和果實，導致果實和莖條先出現(xiàn)白色病斑，隨著時間的推移轉變?yōu)樽厣?，最后表現(xiàn)為莖腐病、果實開裂[14-15]、內(nèi)部褐腐病和黑腐病[11,14]，此病害在高溫和潮濕的環(huán)境中更具侵襲性[16]，對火龍果的產(chǎn)量、質(zhì)量產(chǎn)生有害影響，進而影響其商業(yè)價值[17]。目前，已經(jīng)分離和鑒定了火龍果潰瘍病的致病菌，但關于其遺傳轉化體系的研究仍為空白，而有效的遺傳轉化體系對于新暗色柱節(jié)孢菌致病機理及相關致病基因的研究將起到至關重要的作用。真菌遺傳轉化主要分為原生質(zhì)體轉化和農(nóng)桿菌介導轉化2 種途徑[18]。原生質(zhì)體法操作簡單，但轉化效率低、變異率高，而且PEG 有一定的毒性，可能會對原生質(zhì)體的生長有一定影響，制備原生質(zhì)體程序繁瑣，因此，在絲狀真菌的轉化應用中受限[4,19-21]。2001 年MULLINS 等[22]通過構建二元載體，通過農(nóng)桿菌的介導實現(xiàn)了對鐮刀菌的有效遺傳轉化，到目前為止已有大量的農(nóng)桿菌介導轉化真菌的報道[23]，但是因為真菌材料的性質(zhì)差異，所用農(nóng)桿菌菌株和真菌分離株及共培養(yǎng)條件的不同，對不同的真菌物種進行優(yōu)化是一項艱巨的任務。迄今為止，國內(nèi)外還沒有關于農(nóng)桿菌介導新暗色柱節(jié)孢菌轉化的相關報道，其在新暗色柱節(jié)孢菌中的有效性尚待進一步研究。筆者利用農(nóng)桿菌介導轉化法，將含有潮霉素抗性基因（hyg）和綠色熒光蛋白基因（mGFP）的雙元表達載體轉化到新暗色柱節(jié)孢菌中，并在陽性轉化子中檢測綠色熒光蛋白的表達，旨在為進一步研究新暗色柱節(jié)孢菌的菌絲生長過程、形態(tài)特征、致病菌與火龍果之間的互作致病機制等提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒新暗色柱節(jié)孢菌是本實驗室從紅皮紅肉火龍果莖條分離鑒定并保存的。雙元表達載體pG-Hyg-GFP 是以pCAMBIA1300 為骨架，插入trpC啟動子、潮霉素抗性基因（hyg）和綠色熒光蛋白基因（mGFP），方法參照MULLINS 等[22]。其中潮霉素抗性基因來源于構巢曲霉Aspergillus nidulans的trpC啟動子控制其轉錄，綠色熒光蛋白基因來源于3-磷酸甘油脫氫酶基因（gpdA）啟動子控制其轉錄。利用化學轉化法轉入根癌農(nóng)桿菌AGL-1 中，獲得農(nóng)桿菌pG-Hyg-GFP（圖1）。

圖1 pG-Hyg-GFP 質(zhì)粒圖Fig.1 Plasmid map of pG-Hyg-GFP

1.2 培養(yǎng)基及試劑馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：稱取PDA 培養(yǎng)基粉62.5 g，加水定容至1 000 mL，滅菌后4 ℃保存。馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養(yǎng)基：稱取PDB 培養(yǎng)基粉26.1 g，加水定容至1 000 mL，調(diào)pH 至7.0 后滅菌，4 ℃保存?；九囵B(yǎng)基（minimal medium,MM）：KH2PO43.625 g，K2HPO45.125 g，NaCl 0.375 g，MgSO47H2O 1.250 g，CaCL22H2O 0.165 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.006 2 g，(NH4)SO41.250 g，定容至1 000 mL，室溫儲存。AIM 培養(yǎng)基：MM 培養(yǎng)基400 mL，0.5%（V/V）甘油5 mL，MES 8.5 g，1 mol·L-1過濾除菌的葡萄糖5 mL，將pH 調(diào)至5.3，定容至1 000 mL，固體加入15 g 的瓊脂粉，室溫儲存。LB 培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，將pH 調(diào)至7.0，4 ℃儲存。噻孢霉素（Cefotaxime）：稱取1 g Cef 溶于1 mL 滅菌水中，配置成100 g·L-1，過濾分裝，-20 ℃儲存。乙酰丁香酮（Acetosyringone）：稱取 196.2 mg AS，溶于 10 mL 二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide），配置成100 mmol·L-1，-20 ℃儲存?？敲顾兀↘anamycin）：稱取50 mg Kan，溶于1 mL 的滅菌水中，配置成50 g·L-1，-20 ℃儲存。利福平（Rifampicin）：稱取0.25 g Rif，溶于10 mL無菌水中，過濾分裝，-20 ℃儲存。

1.3 潮霉素對新暗色柱節(jié)孢抑制濃度的篩選將野生的新暗色柱節(jié)孢菌絲接到PDA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3～5 d，先用5～7 mL 滅菌水洗滌菌絲，再用槍頭把菌絲懸浮液吸至含有50 mL 的PDB 培養(yǎng)基中，在搖床中28 ℃培養(yǎng)3 d 后，用3 層擦鏡紙過濾獲得孢子懸浮液，并稀釋成1×107個·mL-1，吸取20 μL 孢子懸浮液點接到分別含有0、10、20、30、40、50、60、70 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天觀察其生長狀況并記錄。

1.4 農(nóng)桿菌的轉化

1.4.1 農(nóng)桿菌AGL-1 的活化和誘導培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉化參照文獻[22]的方法培養(yǎng)。首先將-80 ℃保存的含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL-1 菌液接到液體LB 培養(yǎng)基中（含有100 μg·mL-1的Kan 和25 μg·mL-1的Rif），28 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)至渾濁；然后取培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌50 μL 接種到MM 培養(yǎng)基中（含有100 μg·mL-1的Kan 和25 μg·mL-1的Rif），28 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)2 d，室溫，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入20 mL 的AIM 液體培養(yǎng)基（含有200 μmol·L-1的AS 和40 μmol·L-1的MES）重懸，5 000 r·min-1室溫離心10 min，棄上清；再用IM 液體培養(yǎng)基（含有200 μmol·L-1的AS 和40 μmol·L-1的MES）調(diào)農(nóng)桿菌A600=0.15，28 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h 至A600=0.6，備用。

1.4.2 新暗色柱節(jié)孢孢子的培養(yǎng)挑取適量的菌絲于PDB 培養(yǎng)基中（含100 μg·mL-1的Kan），28 ℃暗培養(yǎng)3 d，經(jīng)3 層擦鏡紙過濾，收集孢子懸浮液，調(diào)整孢子懸浮液的密度為1×107個·mL-1，備用。

1.4.3 根癌農(nóng)桿菌與新暗色柱節(jié)孢孢子的共培養(yǎng)將A600=0.6 的根癌農(nóng)桿菌與新暗色柱節(jié)孢的分生孢子懸浮液（1×107個·mL-1）按體積比為1：1 的比例混合，取200 μL 混合液，用涂布器均勻的涂布于鋪有硝酸纖維素濾膜IM（含200 μmol·L-1的AS 和40 μmol·L-1的MES）固體培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)48 h。

1.4.4 新暗色柱節(jié)孢菌轉化子的篩選將完成共培養(yǎng)48 h 的硝酸纖維素薄膜轉移至PDA 培養(yǎng)基上（含200 μg·mL-1Cef、50 μg·mL-1的潮霉素B），25 ℃暗培養(yǎng)7 d 后，用接種環(huán)挑取轉化子于新的PDA 培養(yǎng)基上（含200 μg·mL-1Cef、50 μg·mL-1的潮霉素B）培養(yǎng)7 d，進行檢測。

1.5 綠色熒光蛋白的表達與檢測在無菌條件下，將轉化子接種到選擇培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，滴一滴dH2O 于載玻片中央，用接種針挑取嫩的菌絲于水中，將菌絲打散，蓋上蓋玻片，在黑暗條件下，將載玻片放到帶有綠色激發(fā)濾光460～550 nm 的OLMPUS IX71 熒光顯微鏡下，觀察綠色熒光蛋白表達情況。先用自然光找到菌絲體，再關閉自然光改為藍光，分別記錄在自然光和綠光下的曝光情況，并用OLMPUS相機拍照。

1.6 PCR 分析轉化子將轉化子用接種環(huán)接種在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，待長滿培養(yǎng)皿時，用接種環(huán)將刮取菌絲并利用真菌微量DNA 提取試劑盒提取DNA，用于PCR 檢測。具體操作如下：以新暗色柱節(jié)孢菌全基因組DNA 為模板，根據(jù)雙元表達載體(pG-Hyg-GFP)上的潮霉素磷酸轉移酶基因設計上下游引物，分別為HPH-F：5′-AATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGG-3′和HPH-R：5′-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC G-3′，PCR 擴增體系為：TaKaRa Ex Taq 0.25 μL，10×buffer 5 μL，dNTP mixture 4 μL，模板2 μL，上下游引物各1 μL，dH2O 補充至50 μL。PCR 擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30 次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物片段大小為1 604 bp。

1.7 轉化子遺傳穩(wěn)定性檢測從獲得的轉化子中隨機挑選出12 個轉化子接種至不含有潮霉素抗性的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3 d 后從邊緣挑取菌絲接種至另一個不含有潮霉素抗性的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，連續(xù)轉接5 代，再將菌絲轉接至含有潮霉素抗性PDA 的平板上培養(yǎng)，觀察轉化子的情況。

2 結果與分析

2.1 新暗色柱節(jié)孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）的遺傳轉化

2.1.1 新暗色柱節(jié)孢菌對潮霉素及卡那霉素的敏感性測試將野生型的新暗色柱節(jié)孢菌株接在含有不同濃度的潮霉素B 的PDA 平板上，其在含有20 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基平板上受到明顯的抑制，在40 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基平板上能夠完全抑制其生長，為了防止假陽性，選擇培養(yǎng)基選用50 μg·mL-1潮霉素的濃度。

2.1.2 新暗色柱節(jié)孢菌轉化子的篩選將農(nóng)桿菌和新暗色柱節(jié)孢菌在IM 培養(yǎng)基上共培養(yǎng)48 h 后，將硝酸纖維素薄膜轉移至含有50 μg·mL-1的潮霉素的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基上會長出新的菌絲。將其再挑到新的含50 μg·mL-1潮霉素B 和200 μg·mL-1Cef (抑制農(nóng)桿菌生長)的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結果表明，新暗色柱節(jié)孢菌轉化子可以在含有50 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 平板上生長（圖2），而野生型菌株不生長，說明新生新暗色柱節(jié)孢菌轉化子具有潮霉素抗性。

圖2 新暗色柱節(jié)孢菌野生型與轉化子的菌絲生長情況對比新暗色柱節(jié)孢菌野生型（A）和轉化子（C）在不含有抗性的PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)1 周情況對比；新暗色柱節(jié)孢菌野生型（B）和轉化子（D）在含有50 μg·mL-1 潮霉素B 和200 μg·mL-1 Cef 的PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)7 d 情況對比。Fig.2 Comparison of hyphae growth between wild-type and transformant of Neoscytalidium dimidiatumComparison of the wild-type Neoscytalidium dimidiatum (A) and putative transformants (C) cultured on the Potato Dextrose Agar (PDA) medium without presence of antibiotics for 7 days at 28 ℃;comparison of the growth of the wild-type Neoscytalidium dimidiatum (B) and putative transformants (D) cultured on the PDA medium supplemented with 50 μg·mL-1 of hygromycin and 200 μg·mL-1 of cefotaxime for 7 days at 28 ℃.

2.2 新暗色柱節(jié)孢菌轉化子中綠色熒光蛋白表達情況在熒光顯微鏡的藍光（488 nm）激發(fā)下，觀察和檢測mGFP的表達情況。圖3-A、3-C 分別為野生型新暗色柱節(jié)孢菌和轉化子在熒光顯微鏡自然光中的形態(tài)；圖3-B、3-D 分別為野生型新暗色柱節(jié)孢菌和轉化子在熒光顯微鏡熒光場中的形態(tài)。在熒光場中，新暗色柱節(jié)孢菌的野生型菌絲觀察不到熒光，而新暗色柱節(jié)孢菌的轉化子的菌絲上有明顯的綠色熒光。說明在轉化子中，GFP基因已成功轉到新暗色柱節(jié)孢菌中并得以表達。

圖3 mGFP 熒光蛋白在新暗色柱節(jié)孢菌轉化子中的表達情況檢測野生型新暗色柱節(jié)孢菌和轉化子在明場、熒光場的綠色熒光蛋白（mGFP）表達情況。明場成像A、C;熒光場成像B、D。Fig.3 Detection of the expression of mGFP fluorescent protein in the transformants of Neoscytalidium dimidiatumThe expression of green fluorescent protein (mGFP) in bright field and fluorescent field of wild-type Neoscytalidium dimidiatum and transformant.A,C:Bright-field imaging;B,D:Fluorescence imaging.

2.3 新暗色柱節(jié)孢菌轉化子的PCR 檢測隨機挑取3 個新暗色柱節(jié)孢菌轉化子在新的PDA 培養(yǎng)基上（含有50 μg·mL-1潮霉素B）培養(yǎng)，待菌絲長滿平板。分別提取新暗色柱節(jié)孢菌轉化子和野生型的DNA，以HPH-F 和HPH-R 作為上下游引物進行PCR 檢測，結果（圖4）表明，野生型對照沒有擴增出條帶，轉化子能夠擴增出1 604 bp 的潮霉素基因片段，說明T-DNA 已插入新暗色柱節(jié)孢菌中。

圖4 轉化子的PCR 檢測M：DNA marker；1～3：野生型新暗色柱節(jié)孢菌，作為陰性對照；4：含有潮霉素基因的質(zhì)粒，陽性對照；5～7：隨機挑選的新暗色柱節(jié)孢菌轉化子。Fig.4 PCR identification of transformantsM:DNA Marker DL2000;1～3:Wild type Neoscytalidium dimidiatum as a negative control;4:Plasmid with hygromycin gene as a positive control;5～7:Randomly selected transformants of Neoscytalidium dimidiatum.

2.4 新暗色柱節(jié)孢菌轉化子遺傳穩(wěn)定性的檢測將挑取的12 個轉化子接種至無潮霉素抗性的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5 代，再轉接至含有潮霉素抗性的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所有的轉化子均可以正常生長，說明轉化子獲得了抗潮霉素抗性，可以穩(wěn)定遺傳。

3 討論

通過構建雙元表達載體，利用構巢曲霉（Aspergillus nidulans）的trpC啟動子控制潮霉素磷酸轉移酶的轉錄；利用構巢曲霉（Aspergillus nidulans）的3-磷酸甘油脫氫酶基因（gpdA）啟動子控制綠色熒光蛋白（mGFP）的轉錄。在農(nóng)桿菌介導下，成功將含有潮霉素抗性基因和含有綠色熒光蛋白基因（mGFP）導入火龍果潰瘍病致病菌—新暗色柱節(jié)孢菌中，并通過PCR 擴增檢測到潮霉素基因片段，通過熒光顯微鏡檢測到綠色熒光蛋白的表達，說明外源基因能夠整合到新暗色柱節(jié)孢菌基因組上并成功表達；將轉化子菌株轉接5 代仍然可以在含有潮霉素B（50 μg·mL-1）的PDA 培養(yǎng)基上生長，說明其具有遺傳穩(wěn)定性。

目前，國內(nèi)外對于新暗色柱節(jié)孢菌的研究較少，相關的文獻報道基本都處于新暗色柱節(jié)孢菌的分離和鑒定階段[1,17,24]，也有在不同物種上發(fā)現(xiàn)了新暗色柱節(jié)孢菌的報道，如在加利福尼亞的無花果[25]、馬來西亞的菠蘿[26]、中國廣西的劍麻[27]等上面，均發(fā)現(xiàn)了新暗色柱節(jié)孢菌，導致植物發(fā)生潰瘍病。近幾年有關于火龍果對新暗色柱節(jié)孢菌侵染的響應研究報道，如2019 年，XU 等[28]從海南紅皮紅肉火龍果中分離得到新暗色柱節(jié)孢菌，使用Illumina RNA-Seq 技術研究了紅肉火龍果 (H.polyrhizus) 對Neoscytalidium dimidiatum的宿主反應；2020 年，XU 等[9]全面概述了紅肉火龍果在轉錄水平上響應Neoscytalidium dimidiatum感染的HpLRR 家族基因；2021 年，PAN 等[29]采用定量蛋白組學分析法研究了火龍果對Neoscytalidium dimidiatum感染的免疫反應，但新暗色柱節(jié)孢菌對火龍果的致病性機理的研究還未見報道。

建立成功的轉化系統(tǒng)是研究基因功能的前提，目前已經(jīng)有利用該方法獲得轉化子并開展基因功能的研究報道[30-31]。因此，建立有效的新暗色柱節(jié)孢菌遺傳轉化體系，對于研究新暗色柱節(jié)孢菌的致病基因及其基因功能極其重要。雖然已有大量農(nóng)桿菌介導的真菌遺傳轉化體系被建立，但未見新暗色柱節(jié)孢菌遺傳轉化相關的報道。本研究成功獲得穩(wěn)定表達的轉化子，將為后續(xù)開展新暗色柱節(jié)孢菌侵染火龍果的發(fā)育發(fā)展進程和探究新暗色柱節(jié)孢菌侵染火龍果的致病機理研究提供材料；還可以為后續(xù)突變體庫的建立提供技術基礎，通過篩選表型異常的突變體開展基因功能的研究。