基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)探討復方當歸注射液治療缺血性中風的作用機制

張巧慧，李志勇，劉振權(quán)，代雅潔，江 洋，廖 艷，湯軼波

藥物重定位具有研發(fā)成本低、研發(fā)風險低、研發(fā)周期短和研發(fā)效益高的特點，通過4R原則[重新定位(reposition)、重定用途(repurpose)、重新評價(reprofile)、重定治療方向(redirecting)]發(fā)現(xiàn)，已批準上市藥物新的臨床適應(yīng)證或新的用途是藥物研發(fā)受益/風險比率最高的策略之一[1]?；谂R床表型的研究方法建立藥物靶點和疾病靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，可發(fā)現(xiàn)藥物新的臨床適應(yīng)證[1]?；谂R床表型的藥物重定位理論與中醫(yī)學的異病同治理論基本一致，即不同的疾病若具有相同的臨床表型或辨證分型可以采用相同的藥物治療。缺血性中風(ischemic stroke，IS)具有較高的發(fā)病率、致殘率和死亡率。IS屬于中醫(yī)學“中風”范疇，風、火、痰、虛、氣、血等相互作用致病，基本病理機制為瘀血阻絡(luò)，治宜活血、通絡(luò)、祛瘀[2]。復方當歸注射液(Compound Angelica Injection，CAI)是由當歸、川芎、紅花3味藥組成，臨床適應(yīng)證為痛經(jīng)(dysmenorrhea)、經(jīng)閉(amenorrhea)、跌撲損傷(fall injury)和風濕痹痛(rheumatic arthralgia)等血瘀性病癥[3]。從中醫(yī)學辨證分型角度分析，復方當歸注射液可治療辨證瘀血阻絡(luò)證型IS。在中國知網(wǎng)以“當歸”和“中風”為關(guān)鍵詞檢索得到472篇文獻，同理得到川芎301篇文獻，紅花200篇文獻。表明復方當歸注射液及其組成藥物對治療IS具有潛在的臨床價值，但復方當歸注射液干預(yù)IS的潛在價值及作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學是應(yīng)用組學、網(wǎng)絡(luò)可視化發(fā)展而來的系統(tǒng)生物學方法，從整體上揭示疾病、藥物、靶點、通路之間的關(guān)系，理解和應(yīng)用中藥藥理作用機制方面具有重要的意義[4-5]。本研究從臨床表型的藥物重定位，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和分子對接技術(shù)，探討復方當歸注射液防治IS的潛在作用，并初步探討復方當歸注射液治療IS的作用機制。

1 資料與方法

1.1 獲取復方當歸注射液適應(yīng)證與IS的靶點 利用基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，https://www.omim.org/)、中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP，https://www.tcmip.cn/)V2.0數(shù)據(jù)庫，以“dysmenorrhea”“amenorrhea”“fall injury”“rheumatic arthralgia”為關(guān)鍵詞進行檢索，合并所得靶點，獲取復方當歸注射液適應(yīng)證相關(guān)靶點；同理，以“ischemic stroke”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲得IS相關(guān)靶點。

1.2 復方當歸注射液適應(yīng)證和IS臨床表型富集分析 利用FunRich 3.1.3軟件[6]對復方當歸注射液適應(yīng)證和IS潛在作用靶點分別進行臨床表型的富集分析，并利用FunRich軟件比較兩者臨床表型差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 復方當歸注射液成分的獲取與靶點的預(yù)測 查閱文獻獲得復方當歸注射液發(fā)揮作用的活性成分，在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取藥物活性成分的Canonical SMILES格式，再將化合物的SMILES格式文件導入Swiss Target Prediction分析平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，將所得的靶點作為化合物發(fā)揮藥效的潛在作用靶點，合并所有化合物潛在作用靶點，去除重復靶點，作為復方當歸注射液的潛在作用靶點。

1.4 復方當歸注射液調(diào)節(jié)IS潛在靶點的獲取 使用FunRich3.1.3軟件構(gòu)建復方當歸注射液主要成分潛在作用靶點與IS疾病靶點的交集韋恩圖，其交集靶點作為復方當歸注射液調(diào)控IS的靶點。利用String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，構(gòu)建交集靶點蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件MCODE模塊分析功能獲取復方當歸注射液與IS的關(guān)鍵交集靶點，將關(guān)鍵模塊的靶點作為復方當歸注射液調(diào)節(jié)IS的潛在作用靶點。

1.5 基因本體(GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 使用Metascape(https://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫對復方當歸注射液調(diào)節(jié)IS的潛在作用靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，設(shè)置P<0.01，屬性為“Homo sapiens”。利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平臺繪制GO和KEGG富集分析氣泡圖。將成分-靶點-通路導入Cytoscape軟件，構(gòu)建復方當歸注射液與IS的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 關(guān)鍵靶點與復方當歸注射液成分的分子對接 選取“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中連接度(degree)大于中位數(shù)的靶點，反向?qū)ふ疫@些靶點對應(yīng)的復方當歸注射液活性成分，利用AutoDock進行分子對接，驗證關(guān)鍵靶點與活性成分之間的結(jié)合效能。具體方法：①在PubChem檢索獲取復方當歸注射液活性成分的SDF結(jié)構(gòu)文件，并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB格式文件。②從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫中檢索并獲得關(guān)鍵蛋白的PDBID編號，利用PYMOL 2.3.4軟件對受體蛋白進行去水、去配體等；利用AutoDock tools軟件對受體蛋白進行加氫、平衡電荷等修飾。利用Grid Box命令打開Grid Option工具對每個受體蛋白進行處理。調(diào)整配體口袋，設(shè)置蛋白格點間距為1，設(shè)置口袋中心為結(jié)合位點中心，并將受體蛋白和配體小分子分別轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。③利用AutoDock Vina 1.1.2對受體蛋白與配體小分子分別進行分子對接、結(jié)合能(affinity)打分及對接參數(shù)。結(jié)合能越低提示受體-配體復合物結(jié)合效能越好[7]。④選取與配體分子結(jié)合效能最佳的靶點繪制分子對接模擬圖，采用PyMOL 2.3.4軟件制作三維圖顯示關(guān)鍵靶點與復方當歸注射液成分之間的相互作用可視化圖。

2 結(jié) 果

2.1 復方當歸注射液適應(yīng)證與IS相關(guān)靶點 檢索GeneCards、OMIM、TCMIP獲得痛經(jīng)、經(jīng)閉、跌撲損傷和風濕痹痛靶點，合并后分別得到301個、1514個、4 025個、733個靶點，合并復方當歸注射液適應(yīng)證所有靶點，去除重復靶點得到5 015個靶點，同理得到IS共3 416個相關(guān)靶點。詳見圖1。

圖1 復方當歸注射液臨床適應(yīng)證與IS相關(guān)靶點的韋恩圖

2.2 復方當歸注射液適應(yīng)證與IS潛在靶點臨床表型 FunRich臨床表型富集分析結(jié)果顯示，復方當歸注射液可調(diào)節(jié)神經(jīng)功能(neurologic)異常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system)異常、周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system)異常、常染色體顯性遺傳(autosomal dominant)異常、內(nèi)分泌變化(endocrine features)異常、實驗室指標異常(laboratory abnormalities)及其他異常臨床表現(xiàn)(P<0.05)，詳見圖2A。IS臨床表型異常表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳異常和血管(vascular)病變(P<0.05)，詳見圖2B。FunRich軟件分析比較復方當歸注射液適應(yīng)證與IS的臨床表型結(jié)果顯示，以IS臨床表型為參照，復方當歸注射液臨床適應(yīng)證相關(guān)靶點與IS靶點存在明顯的臨床表型交集，主要表現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)異常臨床表型，包括神經(jīng)功能異常和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常(P<0.05)，詳見圖2C。

圖2 復方當歸注射液臨床適應(yīng)證和IS臨床表型富集分析圖(A為復方當歸注射液臨床適應(yīng)證臨床表型；B為IS臨床表型；C為復方當歸注射液臨床適應(yīng)證和IS臨床表型)

2.3 復方當歸注射液潛在靶點的獲取及其治療IS的潛在靶點 查閱文獻得到復方當歸注射液的活性成分為阿魏酸、新綠原酸、羥基紅花黃色素A、隱綠原酸、綠原酸和咖啡酸[8]，在Swiss Target Prediction平臺獲得這些活性成分潛在靶點共260個，詳見表1。在FunRich軟件中獲得復方當歸注射液成分靶點與IS疾病靶點交集靶點共165個，導入String平臺獲得PPI圖，在Cytoscape 3.8.0軟件模塊分析獲得一個主要模塊，該模塊共27個靶點，含有27個節(jié)點、299條邊，score為23 000，認為這27個靶點為復方當歸注射液治療IS的潛在作用靶點，詳見圖3。

表1 復方當歸注射液活性成分及其潛在靶點

(續(xù)表)

圖3 復方當歸注射液靶點預(yù)測與IS相關(guān)基因的韋恩圖與交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 GO功能富集結(jié)果顯示，復方當歸注射液治療IS與387個生物過程(biological process，BP)、51個分子功能(molecular function，MF)和42個細胞組成(cellular component，CC)具有相關(guān)性(P<0.01)，分別選取-LogP值居前10位繪制GO富集分析條形圖(其中CC有9條)，詳見圖4。KEGG通路富集分析結(jié)果包括125條信號通路(P<0.01)，選取與IS疾病相關(guān)的20條信號通路[9-15]并繪制氣泡圖[16]，詳見圖5。通路分別為：糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路[advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products(AGE-RAGE)signaling pathway in diabetic complications]、腫瘤壞死因子信號通路[tumor necrosis factor(TNF)signaling pathway]、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、白細胞介素17信號通路[interleukin-17 (IL-17)signaling pathway]、缺氧誘導因子1信號通路[hypoxia inducible factor-1(HIF-1)signaling pathway]、磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路[phosphatidylinositol 3 kinase-serine-threonine protein kinase(PI3K-Akt)signaling pathway]、凋亡(apoptosis)、有絲分裂原活化蛋白激酶信號通路[mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling pathway]、Toll樣受體信號通路(Toll-likereceptor signaling pathway)、壞死病(necroptosis)、兩面激酶-信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路[janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT)signaling pathway]、核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路[nuclear factor-κB-gene binding(NF-κB)signaling pathway]、Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)、自噬-動物(autophagy-animal)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、白細胞跨內(nèi)皮遷移(leukocyte transendothelial migration)、緊密連接(tight junction)、Th1和Th2細胞分化(Th1 and Th2 cell differentiation)、自然殺傷細胞介導的細胞毒性(natural killer cell mediated cytotoxicity)、趨化因子信號通路(chemokine signaling pathway)。將信號通路中的靶點回溯到復方當歸注射液適應(yīng)證與IS的差異性臨床表型中，結(jié)果顯示復方當歸注射液防治IS與中樞神經(jīng)功能異常的臨床表型有關(guān)，且復方當歸注射液主要通過調(diào)控抗凋亡信號通路、抗炎癥反應(yīng)信號通路和保護血腦屏障相關(guān)信號通路發(fā)揮防治IS的作用。詳見表2。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

表2 復方當歸注射液治療IS相關(guān)通路及其映射到交集臨床表型的靶點

2.5 復方當歸注射液治療IS的多維網(wǎng)絡(luò)分析 將復方當歸注射液的活性成分及其治療IS的潛在靶點、通路導入Cytoscape軟件中構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示，復方當歸注射液的6個活性成分參與并調(diào)控IS疾病發(fā)展的多個靶點和多條信號通路。詳見圖6。顯效理論即多個成分在不同的靶點中存在時間和空間的藥效疊加作用，且不同靶點之間存在相互協(xié)同作用[17]，這是中藥發(fā)揮藥效藥理作用的重要機制。

圖6 復方當歸注射液治療IS的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)(外圈圓形為靶點，顏色越深，面積越大，度值越大；中間綠色六邊形為信號通路；內(nèi)圈粉紫色橢圓形為成分；TL為信號通路，CF為復方當歸注射液活性成分，羥A為羥基紅花黃色素A)

2.6 關(guān)鍵靶點分子對接 選取“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值>中位數(shù)(degree>23)的12個靶點，并反向映射這些靶點對應(yīng)的復方當歸注射液活性成分進行分子對接，詳見表3。結(jié)合能<-29.29 kJ/mol提示具有較好的結(jié)合效能，對接效能與結(jié)合能呈負相關(guān)性。結(jié)果顯示，阿魏酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸與基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的結(jié)合效能最佳，羥基紅花黃色素A與MTOR的結(jié)合效能最佳，綠原酸與有絲分裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)的結(jié)合效能最佳，根據(jù)結(jié)合能繪制對接模式圖，模擬圖左邊為分析對接的整體效能圖，右邊為分子對接放大的位點圖。詳見圖7。

表3 關(guān)鍵靶點與其映射化合物的結(jié)合能

圖7 關(guān)鍵靶點與最低結(jié)合能成分的分子對接模擬圖(A為MAPK8與綠原酸；B為MMP9與隱綠原酸；C為MMP9與新綠原酸；D為MMP9與咖啡酸；E為MMP9與阿魏酸；F為MTOR與羥基紅花黃色素A)

3 討 論

異病同治是中醫(yī)學辨證論治的體現(xiàn)，《黃帝內(nèi)經(jīng)》《傷寒雜病論》等經(jīng)典著作中充分包含辨證施治的內(nèi)涵，清代陳士鐸《石室秘錄》記載：“同經(jīng)者，同是一方，而同治數(shù)病也?！闭教岢霎惒⊥蔚母拍頪18]。異病同治內(nèi)涵是指不同的疾病若促使疾病的病理機制相同，可采用同一種方法治療。后世醫(yī)家以經(jīng)方、名方“異病同治”多種疾病收獲不俗的效能。賈六金教授應(yīng)用參苓白術(shù)散治療脾虛泄瀉、脾虛厭食、脾虛便血和脾虛閉經(jīng)等[19]；劉友章教授應(yīng)用甘露消毒丹治療痛風、濕疹和慢性乙肝[20]；趙德喜教授應(yīng)用小柴胡湯治療頭痛、失眠、郁病等[21]。在異病同治理論的指導下，充分體現(xiàn)中醫(yī)藥治療疾病的靈活性與多效性。近年來，興起藥物重定位的概念，利用系統(tǒng)生物學、計算生物學、網(wǎng)絡(luò)藥理學等技術(shù)對已上市的“老藥”進行重新評估，以期獲得“新用途”，不僅極大地降低了藥物研發(fā)的成本與風險，同時可提高藥物研發(fā)的效益，已成為藥物研發(fā)的重點策略之一[1]。

復方當歸注射液是廣泛應(yīng)用于治療臨床多種疾病的中成藥，其說明書明確寫明復方當歸注射液臨床適應(yīng)證為痛經(jīng)、經(jīng)閉、跌撲損傷和風濕痹痛。痛經(jīng)、經(jīng)閉的主要病理機制均包括氣滯血瘀[22-23]，跌撲損傷的病理機制為瘀血腫痛[24]，風濕痹痛的病理機制為經(jīng)絡(luò)瘀閉[25]。根據(jù)異病同治理論可知，復方當歸注射液可有效治療“瘀”滯性疾病。中風居中醫(yī)學四大難治病之首，是由于氣血失調(diào)、陰陽失衡加之勞倦內(nèi)傷、暴飲暴食、嗜食煙酒等造成臟腑陰陽失調(diào)，氣血逆亂直沖犯腦，引發(fā)腦脈痹阻或血溢腦脈的病證[26]。因中風具有起病急、變化快、病情危重等特點，受到了歷代醫(yī)家的廣泛研究，從唐宋之前的外風立論，金元時期的內(nèi)風立論，明清時期的內(nèi)外風并論，到衷中參西理論的發(fā)展，深刻認識中風的發(fā)生發(fā)展為虛實夾雜、脈絡(luò)瘀阻，治宜活血通絡(luò)、祛瘀止痛。本研究基于異病同治及藥物重定位理論探討復方當歸注射液防治IS的潛在價值，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)初步闡明復方當歸注射液防治IS的作用機制。

利用FunRich軟件進行復方當歸注射液臨床適應(yīng)證與IS臨床表型的研究。結(jié)果顯示，復方當歸注射液具有治療IS神經(jīng)功能異常和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常的作用，認為復方當歸注射液具有治療IS的潛在作用，研究復方當歸注射液抗IS具有重要的臨床意義。冀宇蘭[8]利用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS技術(shù)及負離子模式下的色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18質(zhì)譜信息鑒定出復方當歸注射液的6個化合物：阿魏酸、羥基紅花黃色素A、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸。在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫分別獲取復方當歸注射液的6個化合物潛在靶點，最終確定復方當歸注射液潛在靶點共260個靶點，與IS疾病靶點交集獲得165個交集靶點。利用PPI網(wǎng)絡(luò)最終確定復方當歸注射液治療IS與27個關(guān)鍵靶點有關(guān)，包括有絲分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase1，MAPK1)、原癌基因JUN、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1)、半胱氨酸肽酶(Caspase 3，CASP3)、Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、MMP9等，主要與細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等有關(guān)。初步認為復方當歸注射液具有抗IS的作用，且與抗凋亡和抗炎癥反應(yīng)有關(guān)。

本研究對27個關(guān)鍵靶點進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示復方當歸注射液干預(yù)IS與125條信號通路密切相關(guān)，選取其中與IS密切相關(guān)的信號通路繪制氣泡圖。結(jié)果與先前靶點預(yù)測一致，復方當歸注射液治療IS集中在細胞凋亡相關(guān)信號通路(TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、凋亡、自噬等通路)、炎癥反應(yīng)相關(guān)信號通路(IL-17信號通路、JAK-STAT信號通路、NF-κB信號通路、白細胞跨內(nèi)皮遷移、Th1和Th2細胞分化相關(guān)通路等)。復方當歸注射液干預(yù)IS與血腦屏障的完整性有關(guān)。血腦屏障是由腦內(nèi)皮細胞、基底膜、緊密連接蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等構(gòu)成的屏障，可阻止某些分子和物質(zhì)由血液進入腦組織，并嚴格調(diào)控血管內(nèi)外的物質(zhì)交換，是維持腦微環(huán)境穩(wěn)定和發(fā)揮正常神經(jīng)功能的重要器官[27]。中風后，壞死的神經(jīng)元釋放過量的損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，激活并釋放大量促炎性因子、趨化因子及MMP2/MMP9，破壞了血腦屏障的完整性，導致外周血炎性因子和有害物質(zhì)浸潤中樞，引發(fā)二次損傷級聯(lián)，加重腦梗死發(fā)展[12]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學發(fā)現(xiàn)，復方當歸注射液可干預(yù)MMP2、MMP9的釋放并激活緊密連接蛋白相關(guān)通路，進而發(fā)揮保護血腦屏障的作用。通過分析復方當歸注射液適應(yīng)證與IS差異性臨床表型進一步證實復方當歸注射液可有效防治IS的進展，該機制可能與調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的凋亡反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及血腦屏障的完整性有關(guān)。通過構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，直觀發(fā)現(xiàn)復方當歸注射液通過多靶點、多通路、多途徑發(fā)揮干預(yù)IS的作用。

為了進一步探討復方當歸注射液抗IS與某一具體的成分和有關(guān)靶點，進行了分子對接驗證。選取度值>中位數(shù)的12個靶點與復方當歸注射液的6個核心成分進行分子對接，結(jié)果顯示復方當歸注射液成分與這些關(guān)鍵靶點均結(jié)合良好，其中阿魏酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸與MMP9的結(jié)合效能最佳，羥基紅花黃色素A與MTOR的結(jié)合效能最佳，綠原酸與MAPK8的結(jié)合效能最佳。因此，復方當歸注射液參與IS的調(diào)控主要與調(diào)節(jié)MMP9、MAPK8及MTOR的表達有關(guān)。其中MMP9主要與血腦屏障的完整性有關(guān)[28]，而MAPK8、MTOR主要參與細胞凋亡[29-30]。由此可知，復方當歸注射液通過多種途徑發(fā)揮干預(yù)IS的作用。

綜上所述，復方當歸注射液可能從抗凋亡、抗炎、保護血腦屏障等方面發(fā)揮干預(yù)IS的作用，治療IS具有潛在的優(yōu)勢。復方當歸注射液治療IS值得進一步深入進行藥效研究及分子機制實驗驗證，為拓展復方當歸注射液臨床適應(yīng)證的研究提供了方向，同時為老藥新用提供了新的挖掘方法。