活血解毒方調(diào)控AKT/mTOR通路抑制心肌凋亡改善大鼠缺血再灌注損傷的作用機制

黃明艷，陳可冀，龍霖梓，于子凱，付長庚

急性心肌梗死在全球范圍內(nèi)具有較高的死亡率，通過溶栓或經(jīng)皮冠狀動脈介入的心肌再灌注治療是急性心肌梗死有效的救治方法。然而，再灌注治療又引起心肌細胞損傷，增加心肌梗死面積，進而導致急性心肌梗死病人死亡率升高，這一過程即為缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷[1-2]，因此，預防和治療再灌注損傷尤為關(guān)鍵。心肌細胞凋亡在I/R損傷中發(fā)揮著重要的作用。相關(guān)研究顯示，蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(protein kinase B/mammalian target of rapamycin，AKT/mTOR)信號通路的異常調(diào)控及下游的B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱天冬酶3(Caspase-3)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65蛋白等凋亡相關(guān)蛋白的異?；罨瘜/R損傷誘導的心肌細胞凋亡具有重要的影響[3-5]。

陳可冀院士提出的“瘀毒致變”理論認為血瘀證是冠心病穩(wěn)定期病人的基礎病理狀態(tài)，瘀久化熱、釀生毒邪，瘀毒內(nèi)蘊，痹阻心脈導致病情突變，出現(xiàn)不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死等急危重癥，因此，“瘀毒致變”是穩(wěn)定期冠心病發(fā)生急性心血管事件的關(guān)鍵病機[6]。鑒于此，課題組在陳可冀院士指導下，創(chuàng)立了由赤芍10 g、川芎10 g、黃連10 g組成的活血解毒方。前期臨床研究顯示，活血解毒中藥能降低急性冠脈綜合征病人術(shù)后血清炎性標記物如超敏C反應蛋白和腫瘤壞死因子-α，改善血瘀狀態(tài)并具有良好的調(diào)脂作用[7]。實驗研究顯示，活血解毒中藥預處理聯(lián)合缺血后適應可減輕I/R所造成的炎癥反應及氧化應激，抑制心肌酶釋放，減少動物心肌梗死面積以保護心肌組織[8]。關(guān)于活血解毒方對I/R損傷誘導的心肌細胞凋亡的作用機制尚未明確。本研究通過構(gòu)建I/R損傷大鼠模型，觀察活血解毒方預處理對I/R損傷引起的心肌梗死面積和心肌凋亡的影響，并通過AKT/mTOR信號通路進一步探討其機制，為活血解毒方防治I/R的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠36只，8～10周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于西苑醫(yī)院SPF級實驗動物中心，室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%，光/暗周期 12 h/12 h，自由攝食飲水，通風，分籠飼養(yǎng)。實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》和《北京市實驗動物福利倫理審查指南》[9]的要求。

1.1.2 實驗藥物 活血解毒方由川芎10 g、赤芍10 g、黃連10 g配伍組成，活血解毒中藥顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司提供，將活血解毒中藥顆粒以生理鹽水配成27 g/L、54 g/L、108 g/L溶液，超聲溶解，高壓滅菌后于-20 ℃貯存?zhèn)溆?。阿司匹林，?guī)格：每片100 mg，批號：BJ45356，注冊證號：國藥準字J20171021，Bayer S.p.A生產(chǎn)，使用生理鹽水配制成0.6 g/L的混懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實驗試劑及儀器 實驗試劑：肌酸激酶同工酶(CK-MB)測定試劑盒(南京建成科技有限公司，E30024)，心肌肌鈣蛋白T(cTnT)測定試劑盒(南京建成科技有限公司，E30062)，氯化硝基四氮唑藍(N-BT)(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20050421)，水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，T20050609)，2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白檢測試劑盒(cwbiotech，02912E)，Trizol試劑(北京艾德萊生物科技有限公司，批號252250AX)，p-AKT抗體(Affinity，AF0016)，p-mTOR抗體(Affinity，AF3308)，Bcl-2抗體(Abcam，ab196495)，CleavedCaspase-3抗體(CST，9668)，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體(Affinity，AF6266)，p-p65抗體(CST，3031)，山羊抗兔IgG(H+L)HRP(Jackson，111-035-003)。實驗儀器：全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司，ROCHE P800)，多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)(北京空海公司，MPIDS-500)，垂直電泳儀(北京金時速儀器設備公司，DL600C)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，Chemi Doc XRS)，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)儀(ABI，QuantStudio 6)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模 對Wistar大鼠進行冠狀動脈前降支結(jié)扎-松解手術(shù)構(gòu)建I/R模型。按0.01 L/kg劑量腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉大鼠；待大鼠麻醉后，無菌環(huán)境下，從大鼠左側(cè)第4肋、第5肋間切開，打開胸腔，取出心臟，于左心耳下2 mm冠狀動脈左前降支下鈍性分離血管并穿線，血管與結(jié)扎線之間墊一根0.5～1.0 cm的軟硅膠管，使用0號手術(shù)線結(jié)扎冠狀動脈，立即將心臟放回胸腔，以動脈夾夾閉切口。假手術(shù)組動物只穿線不結(jié)扎。結(jié)扎后90 min，剪斷硅膠管，實施再灌注2 h，建立大鼠I/R模型。

1.2.2 分組及給藥 適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將36只Wistar大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組(Sham組)、I/R組、活血解毒方低劑量組、活血解毒方中劑量組、活血解毒方高劑量組和阿司匹林組，每組6只。所有用藥劑量按照人與大鼠體表面積換算，活血解毒方低劑量組、活血解毒方中劑量組、活血解毒方高劑量組分別按成人用量的1倍、2倍、4倍分別給予活血解毒方0.27 g/kg、0.54 g/kg、1.08 g/kg灌胃，Sham組及I/R組給予等體積的生理鹽水灌胃，阿司匹林組給予等體積的阿司匹林0.03 g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃2周，末次灌胃1 h后構(gòu)建大鼠I/R模型。

1.3 觀察指標

1.3.1 心肌損傷標志物CK-MB、cTnT 再灌注2 h后，取主動脈血5mL，室溫靜置2h，4℃離心機，以1 000 r/min離心10 min，留取血清，應用全自動生化分析儀進行檢測。

1.3.2 心肌梗死面積 取血完畢后立即處死大鼠，取出心臟，使用生理鹽水沖洗心腔殘留血液，用濾紙吸干多余液體后稱重；自結(jié)扎線下平行冠狀動脈溝均勻地將心室部分切成等厚5片，將心臟切片置于0.2%氯化硝基四氮唑藍(N-BT)染液中，常溫避光染色2～3 min。采用掃描儀分別掃描5片心肌正面、反面，獲得掃描圖像，采用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量每片心肌雙側(cè)的梗死區(qū)(N-BT非染色區(qū)，呈灰白色)和非梗死區(qū)(N-BT染色區(qū)，呈藍黑色)面積，計算心肌梗死面積比(%)=(梗死區(qū)面積/全心面積)×100%。

1.3.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測AKT/mTOR信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達 取心肌組織并加入蛋白裂解液，采用超聲裂解后離心取上清液。BCA法測定蛋白濃度，將制備好的蛋白樣品加入上樣孔，電泳分離后轉(zhuǎn)膜，封閉。加入AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、β-catenin、p65、p-p65及內(nèi)參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗液。4 ℃孵育過夜，取出后用TBST洗膜3次，每次10 min，再將膜放入山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗液中搖床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，洗膜后用化學發(fā)光法(ECL)顯影，膠片曝光。

1.3.4 RT-qPCR檢測Bcl-2 mRNA表達 取心肌組織并加入Trizol進行超聲勻漿，采用紫外分光光度計測定總RNA含量。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，以25 μL體系將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行PCR擴增，PCR反應體系為20 μL，以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH正向引物序列5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，反向引物序列5′-CCACCCTGTTGCTG-TAGCCATA-3′，擴增產(chǎn)物長度為270 bp；Bcl-2正向引物序列5′-GGGCTACGAGTGGGATACTGGAG-3′，反向引物序列5′-CGGGCGTTCGGTTGCTCT-3′，擴增產(chǎn)物長度為101 bp。PCR擴增反應條件為94 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40個PCR循環(huán)。計算目的基因Bcl-2 mRNA表達的相對水平即RQ值，以公式2-△△CT表示。

2 結(jié) 果

2.1 活血解毒方對CK-MB、cTnT水平的影響 與Sham組比較，I/R組大鼠血清CK-MB和cTnT表達增加(P<0.05)。與I/R組比較，活血解毒方低劑量組、活血解毒方中劑量組、活血解毒方高劑量組和阿司匹林組大鼠血清CK-MB和cTnT表達均降低(P<0.05)。詳見圖1。

與I/R組比較，＊P<0.05。圖1 活血解毒方對I/R大鼠血清CK-MB、cTnT水平的影響(A為血清CK-MB水平；B為血清cTnT水平。a為Sham組；b為I/R組；c為活血解毒方低劑量組；d為活血解毒方中劑量組；e為活血解毒方高劑量組；f為阿司匹林組)

2.2 活血解毒方對大鼠心肌梗死面積的影響 與Sham組比較，I/R組大鼠心肌梗死面積比增加(P<0.05)，表現(xiàn)為N-BT染色非黑藍色區(qū)域增加?；钛舛痉降蛣┝拷M、活血解毒方中劑量組、活血解毒方高劑量組和阿司匹林組大鼠心肌梗死面積及梗死面積比減少(P<0.05)。詳見圖2。

與I/R組比較，＊P<0.05。圖2 活血解毒方對心肌梗死面積的影響(A為N-BT染色觀察心肌梗死面積；B為心肌梗死面積比柱狀圖。a為Sham組；b為I/R組；c為活血解毒方低劑量組；d為活血解毒方中劑量組；e為活血解毒方高劑量組；f為阿司匹林組)

2.3 活血解毒方對AKT/mTOR信號通路及心肌凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 與Sham組比較，I/R組AKT/mTOR信號通路中p-AKT、p-mTOR蛋白表達均降低，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、β-catenin、p-p65表達均增加，Bcl-2蛋白表達降低；與I/R組比較，活血解毒方低劑量組、活血解毒方中劑量組、活血解毒方高劑量組和阿司匹林組AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白p-AKT、p-mTOR表達增加，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、β-catenin、p-p65表達降低，Bcl-2蛋白表達增加。詳見圖3。

圖3 活血解毒方對AKT/mTOR信號通路及心肌凋亡相關(guān)蛋白表達的影響(a為Sham組；b為I/R組；c為活血解毒方低劑量組；d為活血解毒方中劑量組；e為活血解毒方高劑量組；f為阿司匹林組)

2.4 活血解毒方對Bcl-2 mRNA表達的影響 與Sham組比較，I/R組大鼠心肌組織Bcl-2 mRNA表達降低；與I/R組比較，活血解毒方低劑量組、活血解毒方中劑量組、活血解毒方高劑量組及阿司匹林組心肌組織Bcl-2 mRNA表達增加(P<0.05)。詳見圖4。

3 討 論

急性心肌梗死的救治過程中，及時再灌注是挽救瀕死心肌細胞的關(guān)鍵。延遲的血流灌注恢復可能進一步損害缺血組織，從而導致心肌梗死面積增加。有研究顯示，再灌注損傷引起的心肌梗死占因缺血導致總梗死面積的一半以上[10]，因此，預防和治療I/R損傷尤為關(guān)鍵。心肌梗死面積是決定缺血性心臟病病人預后的主要因素[11]，CK-MB和cTnT是心肌損傷標記物，對心肌梗死程度的判斷具有重要指導作用，有助于判斷心肌梗死溶栓治療后冠狀動脈再灌注情況。CK-MB主要存在于心肌組織中，一般在急性心肌梗死發(fā)病后3～8 h增高，9～30 h達峰值，48～72 h恢復正常水平，但CK-MB升高并非心肌損傷的特征標志物，骨骼肌損傷、結(jié)締組織疾病和血液病等均導致CK-MB升高[12]。cTnT是肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白，6%～8%以游離形式存在于心肌細胞質(zhì)中，心肌細胞損傷時，cTnT迅速釋放到血清中，cTnT升高時間與CK-MB相似，但升高的倍數(shù)高，保持較長時間的高水平狀態(tài)，其診斷心肌缺血的特異性高于CK-MB。本研究結(jié)果表明，活血解毒方可降低I/R損傷大鼠CK-MB和cTnT心肌損傷標志物水平，并明顯縮小心肌梗死面積。

I/R損傷為現(xiàn)代醫(yī)學的病名，中醫(yī)學無I/R損傷的記載，根據(jù)疾病臨床癥狀將其歸屬于“心悸”“胸痹”“怔忡”等范疇，根據(jù)中醫(yī)理論，“瘀毒搏結(jié)、痹阻心脈”為I/R損傷發(fā)病的關(guān)鍵病機。由此，陳可冀院士創(chuàng)制了由川芎、赤芍、黃連組成的活血解毒方，方中川芎為君藥，行血中之氣、氣中之血；赤芍為臣藥，可活血祛瘀、清血分實熱；黃連為佐使藥，能去心竅惡血、瀉火解毒，全方氣血同調(diào)、寒溫并用，共奏活血解毒之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，川芎水提取物可減小I/R小鼠心肌梗死面積，降低cTnT和CK-MB含量以減輕I/R損傷[13]。赤芍通過調(diào)節(jié)多種心肌酶維持細胞內(nèi)外環(huán)境平衡，激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/mTOR信號通路，改善心臟能量代謝，抑制心肌細胞凋亡，從而保護心臟免受缺血性損傷[14]，赤芍總苷和黃連素均可抑制Bax促凋亡蛋白的表達，促進Bcl-2抗凋亡蛋白表達[15-16]。黃連素通過清除超氧陰離子發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的作用，進而阻止I/R引起的心肌細胞損傷[17]。

細胞凋亡導致心肌梗死面積增加，越來越多證據(jù)表明，心肌細胞凋亡在心臟I/R損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18-20]，細胞凋亡與線粒體中細胞色素C釋放和Caspase酶激活有關(guān)，并導致典型的DNA斷裂。心肌細胞凋亡通過DNA損傷、活性氧及胞質(zhì)Ca2+水平升高等內(nèi)在途徑發(fā)生或通過心肌細胞膜死亡受體激活等外在途徑發(fā)生，誘導多條信號通路[21]。AKT/mTOR信號通路在調(diào)控心肌細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。心肌細胞中AKT激活可抑制細胞凋亡和增加細胞大小，并減輕I/R損傷后心肌梗死和功能障礙以保護心臟[22]。mTOR通過促進蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成以刺激細胞生長、增殖、存活及新陳代謝，心臟mTOR過表達可抑制心肌凋亡，減輕I/R損傷后炎癥反應[23]。既往研究顯示，養(yǎng)心康片通過AKT/mTOR通路調(diào)控心肌細胞Bcl-2蛋白表達水平，以減少心肌梗死后心肌細胞凋亡[24]。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組AKT/mTOR信號通路受到抑制，活血解毒方通過激活AKT/mTOR信號通路以抑制心肌凋亡。

Bcl-2和Caspase-3是AKT/mTOR信號通路下游調(diào)控細胞凋亡的蛋白。Bcl-2是抗凋亡蛋白，通過直接抗氧化，抑制線粒體釋放促凋亡蛋白，抑制Bax和Bak的促凋亡作用，抑制Caspase酶激活等機制發(fā)揮抗凋亡作用[25]。細胞凋亡是由Caspase家族成員介導的蛋白酶級聯(lián)反應，Caspase-3是細胞凋亡主要的效應型Caspase酶，位于級聯(lián)反應下游，執(zhí)行剪切細胞結(jié)構(gòu)蛋白的作用，直接使細胞發(fā)生凋亡，稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[26]。NF-κB p65是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，存在于心肌細胞中，參與心肌I/R損傷導致的炎癥反應、細胞凋亡等多種生物進程，有研究顯示，NF-κB p65活化與心肌I/R損傷后引起的細胞凋亡有關(guān)，活化的NF-κB p65通過誘導凋亡促進蛋白Caspase-3表達及降低凋亡抑制蛋白Bcl-2生成而促進心肌細胞凋亡[27]。正常狀態(tài)下，β-catenin表達于上皮細胞胞膜，異常情況下，β-catenin異位表達于胞漿，并進入細胞核，通過激活c-myc、缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor，HIF-1)等下游靶基因以誘導細胞凋亡[28-29]。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組Cleaved Caspase-3、β-catenin、NF-κB p-p65促凋亡蛋白表達均增加，Bcl-2抗凋亡蛋白表達降低，提示I/R誘導細胞凋亡發(fā)生；與I/R組比較，活血解毒方低劑量組、活血解毒方中劑量組、活血解毒方高劑量組預處理后可降低促凋亡蛋白表達，增加抗凋亡蛋白的表達。本研究通過PCR檢測進一步驗證活血解毒方可增加抗凋亡Bcl-2 mRNA表達，結(jié)果提示活血解毒方可抑制細胞凋亡，從而發(fā)揮心臟保護作用。

綜上所述，以冠狀動脈前降支結(jié)扎-松解手術(shù)法構(gòu)建大鼠I/R模型，同時給予活血解毒方進行干預，通過N-BT染色、免疫印跡法、RT-qPCR等檢測方法證實活血解毒方可有效保護心臟，減輕I/R引起的心肌損傷，其機制可能與促進AKT/mTOR信號通路的活化并抑制心肌細胞凋亡有關(guān)。