基于肝臟時(shí)鐘基因bmal1、clock和per2探討清達(dá)顆粒降壓的作用機(jī)制

褚劍鋒，王天一，魯竹青，王乙連，盧 妍，彭美中，彭 軍，陳可冀

《內(nèi)經(jīng)》記載：“闕，在下者肝也”“肝大則逼胃迫咽，迫咽則苦膈中，且脅下痛”?！瓣I”指胸廓，“在下”指季肋部，可見(jiàn)，古人已確定肝的位置位于季肋，與胃、食管、膈相鄰，現(xiàn)代解剖學(xué)與此論述[1]基本一致。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“肝者，體陰而用陽(yáng)也，二者一血一氣，一陰一陽(yáng)，互根互用”。“肝主藏血”為陰，“肝主疏泄”為陽(yáng)，若肝失疏泄則人體氣機(jī)失調(diào)，導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，甚者肝氣上逆，化火傷陰，臟腑陰陽(yáng)失衡，肝陽(yáng)上亢而出現(xiàn)煩躁易怒、血壓升高等癥狀或體征[2-3]。此理論為從肝論治高血壓提供了理論前提，也為平肝潛陽(yáng)法治療高血壓奠定了論治基礎(chǔ)。清達(dá)顆粒是由陳可冀院士防治高血壓專方清眩降壓湯化裁而來(lái)，全方由天麻、鉤藤、黃芩、蓮子心四味藥物組成，共奏清肝熱、平肝陽(yáng)、瀉心火之功，對(duì)高血壓病人降壓效果顯著[4]。本研究采用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)模型，觀察清達(dá)顆粒對(duì)血壓、心臟功能、血管病理形態(tài)及肝臟晝夜節(jié)律基因的影響，為探討清達(dá)顆粒的作用機(jī)制提供部分生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 Wistar Kyoto(WKY)大鼠8只，SHR 16只，均為雄性，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，4周齡，體質(zhì)量(200±20)g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0009]，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)并飼養(yǎng)[SYXK(閩)2009-0001]。將16只SHR隨機(jī)分為模型組(SHR組)和清達(dá)顆粒組(SHR+QDG組)，各8只；8只同周齡Wistar Kyoto大鼠作為空白組(WKY組)。分籠飼養(yǎng)，光照/黑夜各12 h，恒溫、恒濕，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均嚴(yán)格按照國(guó)際動(dòng)物保護(hù)及使用指南進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器 蘇木精染色液(北京索萊寶科技有限公司)；伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司)；Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；clock抗體(SAB，33580)；per2抗體(ABclonal，A13168)；bmal1抗體(Abbkine，ABP53154)；即用型免疫組化試劑盒(兔)(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色試劑盒(×20)(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；CODA無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓系統(tǒng)(美國(guó) Kent Scientific公司)；DM400B顯微鏡(德國(guó)萊卡儀器有限公司)；生物自動(dòng)脫水機(jī)(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；生物組織石蠟包埋機(jī)(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡儀器有限公司)；小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司)；Vevo LAB軟件(富士 VisualSonics公司)。

1.3 清達(dá)顆粒藥液制備 清達(dá)顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。按照臨床給藥量換算，取清達(dá)顆粒(每袋5 g)，按0.9 g/(kg·d)加入一定比例生理鹽水?dāng)嚢枵鹗幹镣耆芙狻?/p>

1.4 干預(yù)方法 大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，SHR+QDG組給予清達(dá)顆粒0.9 g/(kg·d)灌胃，SHR組和WKY組均給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，3組均連續(xù)給藥10周。每周采用鼠尾無(wú)創(chuàng)血壓儀器測(cè)量大鼠血壓，稱量體質(zhì)量。

1.5 鼠尾無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量 首先安裝CODA無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓系統(tǒng)，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)、加熱板、電腦Coda軟件、連接傳感器裝置等。根據(jù)室溫選擇合適的加熱檔及加熱時(shí)間，將大鼠固定器置于加熱板上進(jìn)行預(yù)熱，按每組每輪8只大鼠誘導(dǎo)其鉆進(jìn)固定器，并將合適的尾袖套在大鼠尾巴根部，讓大鼠穩(wěn)定5 min，設(shè)置電腦的CODA軟件，每只大鼠預(yù)測(cè)試5次，正式測(cè)定10次，循環(huán)3次，測(cè)量開(kāi)始并記錄合格的血壓數(shù)據(jù)。

1.6 心臟超聲與脈沖波檢查 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠在異氟烷吸入麻醉下，將小動(dòng)物超聲探頭MS250置于胸骨左緣，對(duì)大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖與脈沖波檢查，通過(guò)M型心動(dòng)圖測(cè)量大鼠形態(tài)學(xué)和功能參數(shù)，包括室間隔厚度(IVS)、左室后壁厚度(LVPW)、左室收縮末期容積(LVESV)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。LVEF和LVFS通過(guò)Vevo LAB軟件計(jì)算得出：LVEF(%)=[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100%，LVFS(%)=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100%。所有超聲心動(dòng)圖參數(shù)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期平均值。

1.7 取材及實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè) 干預(yù)10周后，大鼠采用異氟烷麻醉并處死，收集腹主動(dòng)脈血樣，分離血清，將其保存在-80 ℃下進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取出心臟，冰上剔除大血管與結(jié)締組織，剝離腹主動(dòng)脈并分離為3部分，將肝臟左外葉的左側(cè)和右側(cè)兩部分及腹主動(dòng)脈的其中兩部分置于-80 ℃保存用于分析，其余部分固定在4%多聚甲醛中，用于蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色。

1.8 肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 使用Illumina公司的NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit構(gòu)建測(cè)序庫(kù)。用RNase抑制劑和ProtoScript Ⅱ Reverse合成互補(bǔ)DNA(cDNA)第一鏈。樣品在PTC-225 Peltier熱循環(huán)器中培養(yǎng)，在25 ℃下10 min，在42 ℃下15 min，在70 ℃下15 min，在4 ℃下保持。第二鏈的cDNA合成使用第二鏈合成反應(yīng)緩沖液和第二鏈合成酶混合，并在PTC-225 Peltier熱循環(huán)器中16 ℃孵育1 h。之后使用1.8X agcourt AMPure XP Beads對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行純化，最后制備cDNA文庫(kù)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用QUBIT DNA HS Assay Kit對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。采用2100生物分析儀芯片對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)在Illumina測(cè)序平臺(tái)上測(cè)序。利用FastQC軟件對(duì)測(cè)序5′-3′的堿基質(zhì)量進(jìn)行分析，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)中的堿基含量進(jìn)行測(cè)量。對(duì)原始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾，得到適合下游數(shù)據(jù)分析的高質(zhì)量序列。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR) 采用RT-qPCR檢測(cè)肝臟組織bmal1、clock和per2 mRNA表達(dá)水平。使用Trizol試劑對(duì)肝臟組織進(jìn)行裂解，提取肝臟組織RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)量260 nm和280 nm處的吸光度比，定量測(cè)定提取的RNA。采用PrimeScript RT reagent Kit 合成cDNA，并使用SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行qPCR。目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量歸一化至管家基因(GAPDH)，并采用比較Ct法和公式2-△△CT進(jìn)行定量。引物序列如下：GAPDH正向引物序列5′-3′TATGTCGTGGAGTCTACTGGCG，反向引物序列5′-3′ATGAGCCCTTCCACGATGC；bmal1正向引物序列5′-3′CACAGGATAAGAGGGTCATCAC，反向引物序列5′-3′CGGAAGGAATGTCTGGAGTC；per2正向引物序列5′-3′GCAACGGGGAGTACATCACA，反向引物序列5′-3′GTGCGGAGTCTTCTCCTCTG；clock正向引物序列5′-3′CACTCAGGACAGACAGATAAGGT，反向引物序列5′-3′GCTGCTGTTGCTGTGTTACT。

1.10 免疫組織化學(xué)法 將新鮮大鼠部分肝臟組織置于4%多聚甲醛固定24 h，之后采用75%乙醇室溫下浸泡。常規(guī)脫水、包埋，制作石蠟切片，脫蠟入水后，以檸檬酸法進(jìn)行抗原修復(fù)，按照免疫組化試劑盒步驟進(jìn)行下一步操作，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉10 min，配制bmal1、clock和per2一抗(bmal1為1∶100；clock為1∶200；per2為1∶100)，4 ℃低溫過(guò)夜孵育，次日孵育酶標(biāo)聚合抗兔IgG二抗，鏈霉菌抗生物素蛋白孵育1 h，過(guò)氧化物酶孵育1 h，DAB染色，蘇木精復(fù)染色，最后晾干封片。所有切片采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行放大400倍檢查，每個(gè)切片隨機(jī)選取6張圖分析clock、bmal1、per2蛋白的表達(dá)情況。利用顯微鏡圖像分析軟件Motic MED 6.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1 清達(dá)顆粒對(duì)SHR血壓及體質(zhì)量的影響 第0周起(除第1周外)，SHR組與WKY組收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示高血壓模型可靠。清達(dá)顆粒灌胃第2周起，與SHR組比較，SHR+QDG組收縮壓、平均動(dòng)脈壓上升幅度均受到抑制(P<0.05)；給藥3周后，與SHR組比較，SHR+QDG組舒張壓下降(P<0.05)。提示清達(dá)顆?？擅黠@降低SHR血壓。詳見(jiàn)圖1。

SHR組與WKY組比較，＊P<0.05；SHR+QDG組與SHR組比較，#P<0.05。圖1 清達(dá)顆粒對(duì)SHR血壓及體質(zhì)量的影響(A為收縮壓；B為舒張壓；C為平均動(dòng)脈壓；D為體質(zhì)量。1 mmHg=0.133 kPa)

2.2 清達(dá)顆粒對(duì)SHR超聲心動(dòng)圖指標(biāo)和腹主動(dòng)脈脈沖波傳導(dǎo)速度的影響 給藥第10周結(jié)束，通過(guò)小動(dòng)物超聲對(duì)大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖及腹主動(dòng)脈脈沖波檢查，結(jié)果顯示：與WKY組比較，SHR組大鼠LVEF和LVFS降低(P<0.05)，腹主動(dòng)脈脈沖波傳導(dǎo)速度升高(P<0.05)；與SHR組比較，SHR+QDG組大鼠LVEF、LVFS升高和腹主動(dòng)脈脈沖波傳導(dǎo)速度降低(P<0.05)。提示清達(dá)顆?？筛纳芐HR心臟和腹主動(dòng)脈功能。詳見(jiàn)圖2。

SHR組與WKY組比較，＊P<0.05；SHR+QDG組與SHR組比較，#P<0.05。圖2 清達(dá)顆粒對(duì)SHR超聲心動(dòng)圖、腹主動(dòng)脈脈沖波傳導(dǎo)速度的影響(A為各組超聲心動(dòng)圖圖像；B為L(zhǎng)VEF；C為L(zhǎng)VFS；D為腹主動(dòng)脈脈沖波傳導(dǎo)速度)

2.3 清達(dá)顆粒對(duì)SHR腹主動(dòng)脈病理形態(tài)及血管纖維化的影響 HE染色觀察顯示：與WKY組比較，SHR組腹主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞排列不完整；與SHR組比較，SHR+QDG組腹主動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、厚度均有所改善。提示清達(dá)顆?？蓽p輕SHR腹主動(dòng)脈病理改變。Masson染色觀察顯示：與WKY組比較，SHR組腹主動(dòng)脈壁膠原纖維增多；與SHR組比較，SHR+QDG組腹主動(dòng)脈壁纖維化程度減輕。提示清達(dá)顆?？擅黠@減輕SHR腹主動(dòng)脈血管纖維化。詳見(jiàn)圖3。

圖3 清達(dá)顆粒對(duì)SHR腹主動(dòng)脈血管病理形態(tài)及血管纖維化的影響(A為HE染色圖；B為Masson染色圖)

2.4 清達(dá)顆粒對(duì)SHR肝臟組織病理形態(tài)的影響 WKY組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列成條索狀，以中央靜脈為中心向四周放射狀排列，肝細(xì)胞輪廓清晰，未見(jiàn)脂肪變性和炎細(xì)胞分布；SHR組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，小葉間可見(jiàn)大量粗條狀結(jié)締組織增生，肝細(xì)胞腫脹壞死；SHR+QDG組肝臟病變明顯減輕。詳見(jiàn)圖4。

圖4 清達(dá)顆粒對(duì)SHR肝臟組織病理形態(tài)的影響(×400)

2.5 全基因組基因表達(dá)譜分析 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較各組肝臟組織中差異表達(dá)基因分析(DEGs)，并根據(jù)DEGs繪制聚類圖(見(jiàn)圖5A、5B)和火山圖(見(jiàn)圖5C、圖D)，以便較好地顯示DEGs分布情況。結(jié)果顯示，與WKY組比較，SHR組中有936個(gè)DEGs顯著表達(dá)，其中512個(gè)基因顯著上調(diào)，424個(gè)基因顯著下調(diào)。與SHR組比較，SHR+QDG組中有365個(gè)DEGs顯著表達(dá)，其中155個(gè)基因顯著上調(diào)，210個(gè)基因顯著下調(diào)。SHR組有107個(gè)重疊基因表達(dá)上調(diào)，清達(dá)顆粒處理后表達(dá)下調(diào)(見(jiàn)圖5E)。SHR組有63個(gè)重疊基因下調(diào)，清達(dá)顆粒處理后上調(diào)(見(jiàn)圖5F)。SHR組上調(diào)和清達(dá)顆粒處理后下調(diào)前5個(gè)基因的信息見(jiàn)表1。SHR組下調(diào)基因和SHR+QDG組上調(diào)基因居前5位的信息見(jiàn)表2。

圖5 清達(dá)顆粒對(duì)SHR的DEGs影響(A為SHR組比WKY組聚類圖；B為SHR+QDG組比SHR組聚類圖；C為SHR組比WKY組火山圖；D為SHR+QDG組比SHR組火山圖；E、F為各組DEGs的交集)

表1 SHR組上調(diào)和SHR+QDG組下調(diào)的基因信息(居前5位)

表2 SHR組下調(diào)和SHR+QDG組上調(diào)的基因信息(居前5位)

2.6 基因本體(GO)、京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 GO功能富集分析主要從生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)等方面對(duì)生物靶標(biāo)進(jìn)行分析。圖6A和6B顯示豐富的GO項(xiàng)。對(duì)SHR組與WKY組和SHR+QDG組進(jìn)行了交叉分析，得到了3 315種常見(jiàn)的生物過(guò)程(見(jiàn)圖6C)、321種常見(jiàn)的細(xì)胞成分(見(jiàn)圖6D)和555種常見(jiàn)的分子功能(見(jiàn)圖6E)。結(jié)果表明，富集基因主要表現(xiàn)在小分子代謝、多細(xì)胞生物發(fā)育、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激、有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)脂質(zhì)、激素、應(yīng)激的反應(yīng)等。同時(shí)進(jìn)行了KEGG通路富集分析，進(jìn)一步探討了QDG治療高血壓的病理機(jī)制，并鑒定了SHR組與WKY組和SHR+QDG組與SHR組功能相關(guān)的基因通路。圖7A和圖7B顯示KEGG富集顯著的前30個(gè)信號(hào)通路。其中，SHR組與WKY組和SHR+QDG組與SHR組有206條重疊信號(hào)通路(見(jiàn)圖7C)。其中Circadiam rhythm信號(hào)通路最豐富。

圖6 GO功能富集分析(A、B為GO富集分析；C為BP；D為CC；E為MF)

圖7 KEGG通路富集分析(A為SHR組和WKY組；B為SHR+QDG組與SHR組；C為重疊信號(hào)通路)

2.7 RT-qPCR RT-qPCR結(jié)果顯示，與WKY組比較，SHR組肝臟組織bmal1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與SHR組比較，SHR+QDG組抑制了這種上調(diào)(P<0.05)。各組間clock mRNA表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與WKY組比較，SHR組肝臟組織per2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；與SHR組比較，SHR+QDG組QDG處理抑制了這種下調(diào)(P<0.05)。詳見(jiàn)圖8。

圖8 qPCR檢測(cè)肝臟組織bmal1、clock和per2的mRNA表達(dá)(A為bmal1 mRNA；B為clock mRNA；C為per2 mRNA)

2.8 免疫組織化學(xué)法 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝臟組織bmal1、clock和per2蛋白表達(dá)情況。與WKY組比較，SHR組bmal1和clock蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SHR組比較，SHR+QDG組bmal1和clock蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與WKY組比較，SHR組per2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與SHR組比較，SHR+QDG組per2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。詳見(jiàn)圖9。

圖9 免疫組化檢測(cè)各組大鼠肝臟組織bmal1、clock和per2蛋白表達(dá)(×400)(A為bmal1；B為clock；C為per2)

3 討 論

《十四經(jīng)發(fā)揮》記載：“肝之為臟，左三葉，右四葉，凡七葉，其治在左。其臟在右脅右腎之前，并胃著脊之第九椎”，并以《臟腑名堂圖》描述了肝臟在人體的具體位置，對(duì)肝的形態(tài)位置與毗鄰關(guān)系進(jìn)行了記載，中醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代解剖學(xué)的肝臟位置相同[5]。

“肝藏血，主疏泄”概括了中醫(yī)學(xué)中肝臟的功能，一方面，肝臟貯藏血液，調(diào)節(jié)全身血液流動(dòng)；另一方面，肝臟調(diào)暢氣機(jī)，促進(jìn)津血的運(yùn)行和代謝，促進(jìn)脾胃的運(yùn)化及調(diào)節(jié)生殖機(jī)能等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為導(dǎo)致高血壓的內(nèi)因多為年老體虛、陰陽(yáng)失衡、先天稟賦不足、后天失調(diào)，外因多為起居無(wú)常、飲食不節(jié)、情志刺激、勞逸失度[6]。這些病因從不同角度影響肝臟正常的生理功能，如長(zhǎng)期的情志失調(diào)、抑郁惱怒，致使肝失疏泄，肝氣郁結(jié)，郁結(jié)日久而化火，導(dǎo)致肝陽(yáng)上亢，形成本虛標(biāo)實(shí)之證，出現(xiàn)血壓升高的臨床癥狀；飲食不節(jié)，嗜食肥甘厚味之物，導(dǎo)致脾胃運(yùn)化失常，內(nèi)生痰濕之邪，阻礙人體津血正常的運(yùn)行和代謝，進(jìn)一步擾亂肝氣運(yùn)行，血壓升高同時(shí)多伴有頭重、昏蒙的臨床癥狀[7]。可見(jiàn)，“肝藏血主疏泄”的功能與高血壓發(fā)病密切相關(guān)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)高血壓的病因多歸于遺傳因素、飲食、吸煙、精神應(yīng)激等環(huán)境因素，其中，精神應(yīng)激、飲食與中醫(yī)學(xué)所言情志失調(diào)、飲食不節(jié)等不謀而合?，F(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏日益加快，人們承受的心理壓力日漸加大，隨之出現(xiàn)高血壓病人數(shù)量呈快速增多的趨勢(shì)[7]，研究人員開(kāi)始關(guān)注精神應(yīng)激和高血壓發(fā)病之間的關(guān)系。有研究通過(guò)對(duì)老年原發(fā)性高血壓病人研究發(fā)現(xiàn)，高血壓發(fā)病與焦慮、抑郁、低社會(huì)支持及高應(yīng)激狀態(tài)等不良情緒存在相關(guān)性[8]。寧亮等[9]認(rèn)為心理情緒障礙是原發(fā)性高血壓發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，可增加高血壓相關(guān)心腦血管事件發(fā)生率。從肝藏血、主疏泄、調(diào)暢情志的功能出發(fā)，采用清肝熱、平肝陽(yáng)、恢復(fù)肝臟正常生理功能的中藥成方是治療高血壓病的公認(rèn)思路。

清達(dá)顆粒是在清眩降壓湯基礎(chǔ)上的簡(jiǎn)化配方，由天麻、鉤藤、黃芩、蓮子心4味中藥組成，全方共奏清肝熱、平肝陽(yáng)之效。相關(guān)研究表明，清達(dá)顆粒通過(guò)促進(jìn)血管舒張降低SHR血壓，還可抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路，從而減輕心臟重構(gòu)和炎癥[10-11]。本研究采用SHR模型，發(fā)現(xiàn)清達(dá)顆粒可降低SHR血壓，改善心臟收縮功能，減輕動(dòng)脈血管重構(gòu)同時(shí)調(diào)控SHR肝臟晝夜節(jié)律基因的表達(dá)。

根據(jù)肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR組與WKY組和SHR+QDG組與SHR相比，GO功能分析表明富集基因主要表現(xiàn)在小分子代謝、多細(xì)胞生物發(fā)育、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激、有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)脂質(zhì)、激素、應(yīng)激的反應(yīng)等方面。KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)Circadiam rhythm信號(hào)通路最為豐富。生物過(guò)程和功能，如血壓的調(diào)控等呈時(shí)間節(jié)律性，是由下丘腦視交叉上核(SCN)中的遺傳主時(shí)鐘控制的，時(shí)鐘基因per1、per2、per3、bmal1、clock及cry及其基因產(chǎn)物的節(jié)律性活動(dòng)構(gòu)成了中樞節(jié)律維持機(jī)制[12]。有研究顯示，對(duì)生物鐘成分的遺傳操作，如clock和bmal1，人類生物鐘基因per3的串聯(lián)重復(fù)變異及內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)生物鐘的遺傳消融，顯著減弱甚至消除了心律或血壓的晝夜節(jié)律，影響機(jī)體自身晝夜節(jié)律的穩(wěn)定[13-15]。可見(jiàn)，晝夜節(jié)律與高血壓呈一定的相關(guān)性，調(diào)控肝臟晝夜節(jié)律基因的表達(dá)可調(diào)控血壓。本研究結(jié)果顯示，清達(dá)顆粒降低血壓同時(shí)可調(diào)控肝臟組織bmal1和per2 mRNA表達(dá)，二者的作用機(jī)制需進(jìn)一步探討。

綜上所述，清達(dá)顆粒能降低血壓，改善心臟收縮功能，減輕動(dòng)脈血管重構(gòu)，調(diào)控肝臟晝夜節(jié)律基因的表達(dá)。清達(dá)顆粒降血壓的機(jī)制可能與清肝熱、平肝陽(yáng)，使肝主疏泄的功能恢復(fù)正常，調(diào)控肝臟晝夜節(jié)律基因表達(dá)有關(guān)，肝臟晝夜節(jié)律基因表達(dá)的改變可能是清達(dá)顆粒的藥效機(jī)制或相關(guān)成分的靶點(diǎn)，為從肝論治高血壓奠定了部分生物學(xué)基礎(chǔ)。