胍基乙酸對肉牛生長性能、血漿抗氧化和糖代謝指標及血液相關基因表達的影響

王子苑 陳光吉 舒健虹 張 蓉 馬廣智 何廷章 王小利*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所，貴陽 550006；2.安徽萬合佳爾生物科技有限公司，滁州 239000；3.綏陽縣枧壩鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心，綏陽 563307)

肌酸是體內(nèi)能量代謝的重要物質(zhì)，主要存在于肌細胞中，當機體的能量供應不足時，能在無氧條件下快速合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，這種補充作用比直接由食物氧化釋放能量快，因此可滿足動物肌肉快速生長以及在應激條件下對能量的需要。Wyss等[1]研究發(fā)現(xiàn)，人和動物每天大約有1.7%的肌酸會不可避免地轉(zhuǎn)化為肌酐(creatinine，CRE)，并隨尿液排出體外，機體必須持續(xù)補充肌酸才得以維持平衡。然而動物營養(yǎng)學家發(fā)現(xiàn)，植物性飼料原料中并不含有肌酸[2]，反芻動物采食純植物飼糧極易造成機體對肌酸的缺乏。雖有研究表明飼糧中添加肌酸能提高動物生長性能[3-5]，但外源性補充肌酸穩(wěn)定性差、利用率低[6]。

胍基乙酸(guanidine acetic acid，GAA)是合成肌酸的唯一前體物，是精氨酸和甘氨酸在精氨酸-甘氨酸咪基轉(zhuǎn)移酶(arginine-glycine amidinotransferse，AGAT)作用下生成的，已證實GAA在不同條件下的穩(wěn)定性優(yōu)于肌酸[7]，補充GAA能提高磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)和ATP等高能量物質(zhì)的存貯量或利用效率。研究發(fā)現(xiàn)，GAA在提高肉仔雞胸肌重和三元雜交育肥豬平均日增重方面有顯著功效[8-9]，可改善育肥豬肌肉組織能量代謝，延緩糖酵解的發(fā)生，從而改善肉品質(zhì)[10]。由于GAA在國內(nèi)動物生產(chǎn)中的應用仍處于起步階段，關于其作為飼料添加劑的研究大多數(shù)集中于家禽和育肥豬上，在反芻動物飼糧中的研究報道甚少。因此，本研究以肉牛為試驗對象，旨在研究GAA對提升肉牛生長性能和改善能量代謝的作用效果，并探究其對血液中相關基因表達的影響，以期為GAA在肉牛飼糧中的生產(chǎn)應用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取平均體重為(473.58±64.40) kg的健康西門塔爾牛24頭，隨機分為3組，每組8個重復，每個重復1頭牛。對照組(CON組)飼喂基礎飼糧，試驗組分別在基礎飼糧中添加400(G1組)和800 mg/kg(G2組)的GAA。GAA由安徽某公司提供，有效物質(zhì)含量90%。預試期7 d，正試期49 d。

1.2 試驗飼糧及飼養(yǎng)管理

飼糧配方參照《肉牛飼養(yǎng)標準》(NY/T 815—2004)進行配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗飼糧按照配方要求，將GAA按0、400和800 mg/kg的添加量預先拌入精料預混料中，再逐級與所有精料混勻。試驗前對牛只進行統(tǒng)一稱重、編號，按牛場常規(guī)操作進行消毒免疫。每天08:00、16:00各飼喂1次，采用先精后粗的飼喂方法，自由采食粗料，自由飲水，保證每天飼料有少量剩余。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 樣品采集

試驗結束時，每組隨機選取4頭牛，由頸靜脈采集血液。乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管先采集2 mL血樣，置于干冰盒運回實驗室提取RNA，測定血液中相關基因表達量；另用肝素抗凝管采集10 mL血樣，室溫下傾斜放置30 min，3 500 r/min離心15 min后獲取上層血漿，分裝于200 μL離心管中，-80 ℃冷凍保存，用于血漿抗氧化和糖代謝指標的測定。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 生長性能

分別于正式試驗開始和結束當天晨飼前對每頭牛進行空腹稱重，記錄初重(IW)和末重(FW)，計算平均日增重(ADG)；以組為單位，記錄每日各組肉牛的總飼喂量和剩料量，計算每頭牛的平均日采食量(ADFI)，最后根據(jù)ADFI和ADG計算料重比(F/G)。

1.4.2 血漿抗氧化指標

血漿總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法測定，血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性采用羥胺法測定，血漿過氧化氫酶(CAT)活性采用鉬酸銨法測定，血漿丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定。以上試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.4.3 血漿糖代謝指標

血漿肌酸激酶(CK)和丙酮酸激酶(PK)活性采用比色法測定，血漿葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)活性采用高鐵血紅蛋白還原法測定，血漿CRE含量采用肌氨酸氧化酶法測定，血漿磷酸果糖激酶(PFK)活性采用分光光度法測定。以上試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.4.4 血液相關基因表達

1.4.4.1 總RNA提取及cDNA合成

收集細胞，加入1 mL Trizol和0.2 mL氯仿，漩渦振蕩混勻，4 ℃ 15 000 r/min離心5 min；取上清加400 μL異丙醇，振蕩混勻，4 ℃ 15 000 r/min離心20 min；棄上清，加1 mL 75%乙醇，4 ℃ 15 000 r/min離心5 min；棄上清，加1 mL無水乙醇，4 ℃ 15 000 r/min離心5 min；棄上清，空氣干燥5～10 min；溶于40 μL 1‰焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，-70 ℃保存待用。cDNA的合成按Toyobo公司Rever Tre Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。

1.4.4.2 實時熒光定量PCR檢測

利用Applied Biosystems 7500 PCR儀(ThermoFisher公司，美國)檢測肌酸轉(zhuǎn)運蛋白(CrT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白2(GAT2)和β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA相對表達量，所有引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表2。PCR反應體系：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.3 μL，2×SYBRGreen 10 μL，ddH2O 7.4 μL，PCR反應的總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，利用Gene Study軟件分析基因的mRNA相對表達量。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.5 結果統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用Duncan氏法，試驗結果以“平均值±標準差”表示。

2 結 果

2.1 GAA對肉牛生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，G1組和G2組的平均日增重分別提高了12.19%(P>0.05)、28.05%(P<0.05)，G1組和G2組的料重比分別下降了9.92%(P>0.05)、21.13%(P<0.05)；G1組和G2組的末重和平均日采食量有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表3 GAA對肉牛生長性能的影響Table 3 Effects of GAA on growth performance of beef cattle

2.2 GAA對肉牛血漿抗氧化指標的影響

由表4可知，與對照組相比，G1組和G2組的血漿T-AOC和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，G1組和G2組的血漿T-AOC分別提高了44.63%和108.26%，G1組和G2組的血漿GSH-Px活性分別提高了27.86%和25.72%；G1組和G2組的血漿CAT活性極顯著升高(P<0.01)，G1組和G2組的血漿CAT活性分別提高了47.14%和62.14%；G1組和G2組的血漿MDA含量極顯著降低(P<0.01)，且G1組的血漿MDA含量極顯著低于G2組(P<0.01)。各組間血漿SOD活性差異不顯著(P>0.05)，但隨著GAA添加量的增加有所升高。

表4 GAA對肉牛血漿抗氧化指標的影響Table 4 Effects of GAA on plasma antioxidant indexes of beef cattle

2.3 GAA對肉牛血漿糖代謝指標的影響

由表5可知，與對照組相比，G1組和G2組的血漿G-6-PDH活性極顯著降低(P<0.01)，G1組和G2組的血漿PK活性顯著降低(P<0.05)，G2組的血漿PKF活性顯著降低(P<0.05)；G1組和G2組的血漿CK活性顯著升高(P<0.05)，G1組和G2組的血漿CK活性分別提高了37.04%、62.96%。各組間血漿CRE含量差異不顯著(P>0.05)，但隨著GAA添加量的增加有所升高。

表5 GAA對肉牛血漿糖代謝指標的影響Table 5 Effects of GAA on plasma glycometabolism indexes of beef cattle

2.4 GAA對肉牛血液相關基因表達的影響

由表6可知，G1組和G2組血液中CrT、AMPK和GAT2 mRNA相對表達量均極顯著低于對照組(P<0.01)，且G1組血液中CrT、AMPK和GAT2 mRNA相對表達量均極顯著低于G2組(P<0.01)。對照組血液中CrTmRNA相對表達量分別是G1組和G2組的4.54和2.03倍，血液中AMPKmRNA相對表達量分別是G1組和G2組的6.51和2.23倍，血液中GAT2 mRNA相對表達量分別是G1組和G2組的6.37和2.74倍。

表6 GAA對肉牛血液相關基因表達的影響Table 6 Effects of GAA on blood related genes expression of beef cattle

3 討 論

3.1 GAA對肉牛生長性能的影響

肌酸是一類自然存在于脊椎動物體內(nèi)、能夠快速為肌肉和神經(jīng)細胞提供能量的物質(zhì)。GAA作為機體合成肌酸的重要內(nèi)源物，以甲基化的形式最終形成肌酸，其中有95%的肌酸經(jīng)過血液運輸?shù)郊∪饨M織，通過與高能磷酸基團結合以儲備能量[11]。本試驗在飼糧中外源性添加400和800 mg/kg GAA，能提高肉牛平均日增重，降低料重比，而對平均日采食量沒有影響，這與趙元等[12]、潘寶海等[13]研究結果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GAA能顯著提高肌肉中肌酸含量[14]，同時血漿CK活性也相應升高[15]，在CK催化下促使肌酸吸收多余ATP的磷酸根基團形成PCr，從而提升磷酸原系統(tǒng)的能量儲備，為機體蛋白質(zhì)沉積提供保障。同時，GAA作為氨基酸衍生物能促進肌肉的生長。宋陽[16]用20 mmol/L GAA處理C2C12成肌細胞，發(fā)現(xiàn)GAA可以提高肌源性分化基因肌肉轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(MyoD)和肌細胞生成素(MyoG)的表達水平，增加肌管融合率，同時GAA能通過miR-133a-3p和miR-1a-3p激活蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖體S6蛋白激酶(S6K)信號通路，從而促進肌細胞的分化和骨骼肌生長。目前，精氨酸被認為是畜禽營養(yǎng)中的條件性必需氨基酸[17]，具有促進骨骼肌蛋白合成，刺激生長激素分泌[18]以及增強機體抗應激能力等功能，由于精氨酸是合成GAA的前體物，外源添加GAA可以有效節(jié)約飼糧中的精氨酸[19]，這一節(jié)約作用能促使更多精氨酸參與機體的蛋白質(zhì)合成，從而提高畜禽生長性能[20]。此外，GAA可作用于胰腺導致胰島B細胞電位變化，并通過蛋白激酶A和蛋白激酶C來增強靶細胞膜表面胰島素受體的活性，刺激胰島素和胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)分泌[21-22]，間接促進機體生長。

GAA在脊椎動物體內(nèi)經(jīng)由血液循環(huán)運輸?shù)礁闻K，在胍乙酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(guanidinoacetate N-methyltransferse，GAMT)的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到GAA上，最終合成肌酸。由此可見，外源性補充GAA勢必會增加機體對甲基供體的需求[23]，若甲基供體缺乏則會增加同型半胱氨酸血癥的發(fā)生率。趙景鵬等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當全期(1～42日齡)飼喂肉雞高劑量GAA時，無需額外補充蛋氨酸也能獲得較好的末重和胴體質(zhì)量，但若要階段性使用GAA則適宜在飼養(yǎng)后期(22～42日齡)搭配蛋氨酸高劑量添加。本試驗中，飼糧添加400和800 mg/kg GAA能不同程度提高肉牛生長性能，但關于GAA的適用階段、最低有效量、最大耐受量以及與飼糧甲基供體的配套強化效果等問題，需待進一步研究解析。

3.2 GAA對肉牛血漿抗氧化指標的影響

生物體天然擁有一套復雜的抗氧化體系，包括抗氧化酶系和抗氧化非酶系，前者是以微量元素為中心，如SOD、GSH-Px、CAT和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)等；后者主要包括維生素、氨基酸、金屬蛋白質(zhì)以及中草藥提取物等。該體系通過清除和利用機體內(nèi)的氧化物質(zhì)，以應對生命活動過程中不斷產(chǎn)生的自由基，維持機體動態(tài)平衡[25]。如果該系統(tǒng)失衡，機體可能會產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，如超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化羥自由基等。在ROS作用下，生物膜、蛋白質(zhì)及核酸等大分子結構遭到破壞[26]，誘發(fā)動物體產(chǎn)生一系列疾病[27]，從而影響生長性能[28]。T-AOC是反映機體抗氧化作用的重要指標之一，SOD、CAT和GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD能夠催化超氧化物陰離子自由基轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧，過氧化氫又在CAT的作用下生成水，以解除自由基氧化而造成的機體損害。GSH-Px的作用底物是谷胱甘肽和過氧化物，能促使有毒的過氧化物生成無毒的羥基化合物，以保護細胞膜的結構和功能免受干擾。MDA被認為是膜脂質(zhì)過氧化(membrane lipid peroxidation，LPO)最重要的產(chǎn)物之一，通常用來反映機體LPO程度，它與膜蛋白結合會增加膜通透性，導致膜蛋白酶失活，細胞代謝發(fā)生紊亂。

李子平等[29]研究表明，在循環(huán)熱應激條件下，肉雞飼糧中添加0.5 g/kg GAA提高了血清SOD和GSH-Px活性，改善了熱應激引起的氧化損傷，提高了肉雞的抗氧化狀態(tài)。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GAA能提高肉牛血漿中抗氧化酶活性和T-AOC，同時降低血漿MDA含量，其中GAA添加量為400 mg/kg時能獲得較低的血漿MDA含量和較高的血漿GSH-Px活性。這說明GAA可在一定程度上能通過增加內(nèi)源性抗氧化酶活性達到提高機體抗氧化能力的效果，這可能與間接補充肌酸有關。有研究表明，磷酸肌酸可以保護丙酮醛或脂多糖刺激人臍靜脈的內(nèi)皮細胞，影響核因子-κB(NF-κB)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)通路，抑制p65核轉(zhuǎn)位，減少ROS產(chǎn)生[30-31]。李曉斌等[32]研究補喂肌酸對伊犁馬血漿中的抗氧化酶活性的影響，結果發(fā)現(xiàn)血漿抗氧化酶活性隨補飼的進行逐漸升高，尤其在試驗后期，GSH-Px、SOD活性和T-AOC明顯提高，說明肌酸對提高伊犁馬抗氧能力有促進作用。然而有研究認為，外源性條件GAA后，血清GAA濃度(約5 μmol/L)較低時才體現(xiàn)出其抗氧化作用，反之GAA則會作為強氧化劑誘導氧化應激[21,33]。

3.3 GAA對肉牛血漿糖代謝指標的影響

動物體內(nèi)糖分解代謝途徑主要有糖原分解、無氧分解、有氧分解和戊糖磷酸途徑(PPP)等，G-6-PDH是PPP的關鍵限速酶，葡萄糖-6-磷酸可經(jīng)此途徑代謝產(chǎn)生核糖-5-磷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)+氫離子(H+)和二氧化碳。核糖-5-磷酸是合成核酸和核苷酸的原料，NADPH+H+能為生物合成提供還原當量，同時還能將氧化型谷胱甘肽還原為氧化型[34]。PFK和PK則是糖酵解途徑(EMP)中的2個關鍵限速酶，PFK參與無氧分解過程中第2個限速反應，催化果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣?1,6-二磷酸，而PK是無氧分解的第3個限速步驟，將磷酸烯醇式丙酮酸催化為丙酮酸。本試驗中，飼糧中添加GAA降低了肉牛血漿G-6-PDH、PFK和PK活性，說明GAA能減少機體葡萄糖的分解代謝，這一結論與洑琴等[35]的研究結果一致，GAA是合成肌酸的唯一前體物，能直接增加生命活動所需的ATP，使葡萄糖更多的以糖原形式貯存起來。

CRE是肌肉中的肌酸通過不可逆的非酶脫水反應產(chǎn)生的代謝物，以恒定速度釋放入血后隨尿排出，有學者認為CRE含量的高低能夠反映機體的肌肉總量[36]。本試驗中，飼糧中添加GAA提高了肉牛血漿中CRE含量，說明GAA作為肌酸的潛在來源，能提高機體的肌肉代謝，同時外源添加GAA能促進蛋白質(zhì)沉積以及骨骼肌的生長，由此印證GAA對生長性能的促進作用。CK主要存在于細胞質(zhì)和線粒體中，能可逆地催化PCr和ATP之間高能磷酸鍵的轉(zhuǎn)化，當機體代謝旺盛ATP供應不足時，PCr在CK催化作用下快速脫去磷酸根與二磷酸腺苷(ADP)結合生成ATP供能，同時釋放出肌酸，因此CK在肌酸代謝中具有能量緩沖作用。同時，還認為CK能通過ADP再利用循環(huán)機制抑制ROS的產(chǎn)生，提高動物在應激條件下的抗氧化能力[37]。李蛟龍[38]研究發(fā)現(xiàn)，在育肥豬飼糧中補充0.8%一水肌酸和0.1%GAA可顯著提高背最長肌中CK活性以及肌酸、PCr含量。本試驗結果表明，飼糧中添加GAA提高了肉牛血漿中CK活性，可能是GAA的添加促進了高能磷酸化合物的儲備，以此增強肌酸代謝中的能量緩沖。有報道，肌肉中PCr的大量儲備能延緩宰后糖酵解的發(fā)生以及pH的下降速度，進而改善胴體肉品質(zhì)[39]。

3.4 GAA對肉牛血液相關基因表達的影響

肝臟合成的肌酸進入血液后，需在鈉離子(Na+)和氯離子(Cl-)依賴的CrT的作用下，通過血液循環(huán)逆濃度差將肌酸轉(zhuǎn)運到肌纖維和其他組織中[40]，因此細胞內(nèi)肌酸或總肌酸含量是影響CrT表達的重要因素。有學者者認為，長時間暴露在高肌酸含量環(huán)境下或外源補充肌酸，可能會降低CrT活性從而部分抑制肌酸攝取[41]。Loike等[42]將L6成肌細胞置于肌酸含量為1 mmol/L的培養(yǎng)基24 h，發(fā)現(xiàn)該組細胞的CrT活性較培養(yǎng)基不含肌酸的對照組下降了2/3，當把肌酸孵育的L6成肌細胞轉(zhuǎn)移至缺少肌酸的培養(yǎng)基中24 h，其下調(diào)的CrT活性會部分回升。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GAA顯著下調(diào)肉牛血液中CrTmRNA相對表達量，然而有研究表明，飼糧中添加一水肌酸能顯著上調(diào)育肥豬背最長肌、肝臟和腎臟中CrTmRNA相對表達量；飼糧中添加GAA可以顯著上調(diào)背最長肌中CrTmRNA相對表達量，但對其他組織中的CrTmRNA相對表達量沒有影響[38]。上述結果與本研究結果不一致的原因可能是樣品采集部位不同，基因表達存在組織差異性。

AMPK被稱為“細胞能量感受器”，當機體代謝增強時，ATP過量消耗，一磷酸腺苷(AMP)含量升高，從而激活AMPK途徑，抑制糖原合成，加快糖酵解代謝，達到調(diào)節(jié)機體能量代謝的目的。本研究結果顯示，飼糧中添加GAA極顯著下調(diào)了肉牛血液中AMPKmRNA相對表達量，可能是外源補充GAA能為動物生長提供直接能量，從而節(jié)約了機體葡萄糖的分解供能，此時細胞能量充盈，AMPK處于相對沉默狀態(tài)。前人研究結果表明，飼糧中添加一水肌酸能降低大鼠腓腸肌中糖酵解酶活性以及肌球蛋白重鏈(MyHC)Ⅱx mRNA相對表達量，進而改變了腓腸肌肌纖維類型，即由酵解型向氧化型轉(zhuǎn)變[43]，肌肉纖維類型的改變能提高蛋白質(zhì)溶解度，加強蛋白質(zhì)水合作用，進而增加動物體重，這一結論可從另一方面解釋本試驗的部分結果。然而也有研究表明，AMPK途徑的激活能抑制糖酵解代謝，增加葡萄糖在細胞間的轉(zhuǎn)運作用，改善糖代謝效率[44]，可能由于AMPK是內(nèi)含α、β、γ 3個亞單位的異源復合物，其各個亞型組合在機體的不同組織或相同組織的不同代謝狀態(tài)中有不同表達[45]。有研究表明，GAT2參與了肝細胞攝取GAA過程[46]。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GAA極顯著降低了肉牛血液中GAT2 mRNA相對表達量，其變化趨勢與CrT和AMPKmRNA相對表達量一致，并且均在G1組獲得最低相對表達量，該結果暗示了外源補充GAA可能會對肉牛轉(zhuǎn)運和攝取GAA有一定的抑制作用。

4 結 論

本試驗條件下，飼糧中添加400和800 mg/kg GAA可不同程度改善肉牛的生長性能，提高抗氧化能力，并降低血漿糖代謝相關酶活性以及血液中CrT、AMPK、GAT2 mRNA相對表達量，改善能量代謝途徑。