微生物細胞工廠生產(chǎn)化學(xué)品的研究進展
——以幾種典型小分子和大分子化學(xué)品為例

鄭煜堃，孫青，陳振，于慧敏

（清華大學(xué)化學(xué)工程系，教育部工業(yè)生物催化重點實驗室，北京 100084）

引 言

隨著“綠色發(fā)展”理念越來越深入人心，以高效、低耗、清潔、低碳為典型特征的綠色生物制造技術(shù)日益受到世界各國政府、研究機構(gòu)和企業(yè)界的高度重視[1]。發(fā)展以生物質(zhì)為基礎(chǔ)原材料的生物制造產(chǎn)業(yè)鏈及以工業(yè)生物催化為核心的綠色低碳生物經(jīng)濟是推動“綠色發(fā)展”、實現(xiàn)“碳中和”目標不可或缺的條件。微生物細胞工廠是綠色生物制造的核心對象之一。采用微生物細胞工廠高效合成各種大宗及高值化學(xué)品已經(jīng)不僅成為學(xué)術(shù)界的研究熱點，也日益成為合成生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)界的開發(fā)重點。而隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的化學(xué)品可以通過細胞工廠進行綠色高效的清潔生產(chǎn)。

在經(jīng)典的基因工程、代謝工程和酶工程學(xué)科的支撐基礎(chǔ)上，近年來，合成生物學(xué)、大數(shù)據(jù)與人工智能等新技術(shù)快速發(fā)展起來并逐漸交叉融合，使得針對各種微生物細胞工廠進行設(shè)計優(yōu)化的使能技術(shù)也越來越豐富且高效。為此，本文首先簡述微生物細胞工廠構(gòu)建及改造過程中的使能技術(shù)及其新發(fā)展；另一方面則重點闡述微生物細胞工廠合成有機酸、有機醇、有機胺等幾類典型小分子產(chǎn)物以及多糖、聚酯等幾種典型大分子產(chǎn)物的研究進展；在此基礎(chǔ)上，進一步對未來微生物細胞工廠生產(chǎn)化學(xué)品的總體發(fā)展趨勢和前景進行展望。

1 構(gòu)建高效微生物細胞工廠的主要使能技術(shù)及其新發(fā)展

微生物細胞工廠合成目標產(chǎn)物的產(chǎn)量、得率等性能直接決定著產(chǎn)品的生物制造成本，設(shè)計調(diào)配合理路線以高效合成高值化學(xué)品是其成功應(yīng)用的關(guān)鍵。當(dāng)利用微生物作為目標化學(xué)品的生產(chǎn)機器時，常需要在細胞內(nèi)引入外源途徑，并結(jié)合復(fù)雜的代謝調(diào)控，重分配代謝流，使更多的能量及生物量流入所需產(chǎn)品的合成途徑。經(jīng)典的基因工程、代謝工程以及酶工程等學(xué)科的發(fā)展是微生物細胞工廠構(gòu)建及改造過程中的重要支撐。其中，啟動子工程是調(diào)節(jié)基因表達強度的核心，代謝流分析指導(dǎo)代謝改造的方向，酶的理性設(shè)計和定向進化則是酶分子活性改造的重要手段。如圖1所示。

圖1 構(gòu)建高效微生物細胞工廠的使能技術(shù)[2-6]Fig.1 Enabling technology for building efficient microbial cell factories[2-6]

近年來，基因組編輯技術(shù)對于菌株的代謝途徑改造至關(guān)重要。成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其關(guān)聯(lián)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas）系 統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一種重要基因組定向編輯手段，其中的單鏈向?qū)NA（single-guide RNA,sgRNA）可以特異性定位目標DNA序列，可用于調(diào)控基因表達強度、敲除基因、定點突變等[7]。目前CRISPR/Cas技術(shù)已成功應(yīng)用于大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母等模式生物[8]以及紅球菌[3]、嗜鹽單胞菌[9]等多種非模式生物，可用于生產(chǎn)脂肪酸、維生素、氨基酸、聚羥基烷酸酯（PHA）等多種化學(xué)品，是最主要的基因組編輯手段之一[10]。如利用CRISPR系統(tǒng)在嗜鹽單胞菌Halomonas中進行三羧酸循環(huán)改造，設(shè)計生產(chǎn)新型PHA[11]。此外，通過CRISPR系統(tǒng)可以進行大規(guī)模敲除實現(xiàn)基因組精簡，減少細胞代謝負擔(dān)；或者在不改變基因型的情況下，利用CRISPR系統(tǒng)編輯RNA，實現(xiàn)表現(xiàn)型的改變[12]。

DNA組裝技術(shù)是構(gòu)建DNA元件的常用技術(shù)，例如利用同源片段進行的Gibson無縫拼接技術(shù)，就為多片段基因組合提供了便利[5]。未來，隨著DNA大片段、多拷貝快速組裝技術(shù)的進一步發(fā)展，微生物細胞工廠改造的效率將進一步顯著提升。

為了模擬自然進化中的變異和選擇，通過施加外界環(huán)境壓力以篩選獲得理想的優(yōu)良性狀[13]，常壓室溫等離子體誘變[4]等誘變育種方法耦合微流控高通量篩選技術(shù)[14]的使用越來越廣泛。新型誘變育種策略在微生物細胞工廠改造中取得了更多成果，尤為適合遺傳背景不明確及目標性狀復(fù)雜的菌株的改進工作，如結(jié)冷膠的生產(chǎn)中，通過誘變育種耦合高通量篩選技術(shù)，獲得了搖瓶產(chǎn)量達41.6 2g/L的高產(chǎn)菌株[15]。已有研究成功結(jié)合理性設(shè)計與實驗室適應(yīng)性進化構(gòu)建出可以甲醇為唯一碳源生長的大腸桿菌，為微生物利用有機碳一原料作出了重要突破貢獻[16]。

隨著下一代測序技術(shù)、多組學(xué)分析手段的發(fā)展，微生物代謝模型覆蓋的種類及準確度不斷完善?；蚪M尺度的代謝模型（genome-scale models,GSMs）及模擬算法可用于預(yù)測最優(yōu)途徑及潛在的改造目標，可加快高效細胞工廠的構(gòu)建[17]，如利用基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)透明質(zhì)酸生產(chǎn)優(yōu)化，將產(chǎn)量提升到28.7g/L[6,18]。在此基礎(chǔ)上，多組學(xué)分析將基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、脂質(zhì)組等多組學(xué)數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，能夠更加深入理解各因子之間的相互聯(lián)系和作用，有利于挖掘候選關(guān)鍵因子。

此外，隨著環(huán)境進行響應(yīng)的動態(tài)代謝調(diào)控也是提高細胞生產(chǎn)能力的重要技術(shù)。其中反義RNA[19]、小RNA[20]、CRISPR-dCas9[21]等就常被用于同時調(diào)控細胞的多個基因表達水平，可有效地微調(diào)基因表達活性。如利用小RNA調(diào)節(jié)大腸桿菌相關(guān)基因，使1,4-丁二胺的產(chǎn)量提高到42.3g/L[22]。而基因元件的標準化、模塊化將減少基因操作的難度，為底盤構(gòu)建及改造工作提供重要便利。人工智能和機器學(xué)習(xí)系統(tǒng)可按照“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)（designbuild-test-learn）”的循環(huán)流程，通過從大型實驗數(shù)據(jù)集學(xué)習(xí)系統(tǒng)的行為模式，以預(yù)測復(fù)雜的細胞代謝，預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)[23]，模擬分子間相互作用，優(yōu)化啟動子等基因元件[24]。

此外，進行大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)時，還需要進行發(fā)酵體系放大及生產(chǎn)線建設(shè)，對于發(fā)酵過程及發(fā)酵工藝的優(yōu)化、反應(yīng)器設(shè)計改造等過程工程策略是實現(xiàn)真正投產(chǎn)時的關(guān)注重點。

接下來，本文將從微生物細胞工廠生產(chǎn)典型有機小分子和多糖及聚酯類生物大分子兩個方面入手，來分類闡述研究進展并舉例具體說明在不同類型產(chǎn)品的生產(chǎn)中，需要關(guān)注和優(yōu)化的主要問題。

2 微生物細胞工廠合成有機醇/酸/胺類小分子大宗化學(xué)品

微生物細胞工廠已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物小分子的合成，如氨基酸、有機酸、有機醇和有機胺等。本節(jié)選取幾種典型的小分子有機醇、酸、胺產(chǎn)品為例進行介紹，以期為更多更廣泛的有機小分子合成作示例。各種不同重組菌株的改造策略及代表性菌株的生產(chǎn)性能如圖2和表1所示。

表1 代表性小分子大宗化學(xué)品的菌株生產(chǎn)性能比較Table1 Production performance comparison for representative micromolecular bulk products via cell factories

圖2 微生物細胞工廠合成重要小分子大宗化學(xué)品代謝途徑圖Fig.2 Metabolic pathways for important micromolecular bulk products via cell factories

2.1 有機醇

有機醇特別是二元醇是一類極為重要的化學(xué)品，可廣泛用于合成聚酯、聚氨酯、聚醚多元醇等高性能材料，近年來生物法生產(chǎn)1,3-丙二醇（1,3-PDO）、1,4-丁二醇（1,4-BDO）、1,3-丁二醇（1,3-BDO）[39]等取得了重要進展，已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。

1,3-丙二醇（1,3-PDO）作為一種重要的C3平臺化合物，其最主要的用途是與對苯二甲酸縮聚生成對苯二甲酸丙二醇酯（PTT）。目前1,3-丙二醇的工業(yè)生產(chǎn)80%以上是采用生物法，杜邦公司利用重組大腸桿菌，基于DNA組裝及基因編輯技術(shù)，引入釀酒酵母的甘油合成途徑和克雷伯氏菌的1,3-丙二醇合成途徑，利用高通量技術(shù)篩選脫水酶基因突變文庫，并基于代謝網(wǎng)絡(luò)模型改造底盤細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運模塊、能量代謝模塊等，使得1,3-丙二醇的產(chǎn)量達135g/L，得率為1.0 9mol/mol[25]。筆者所在課題組開發(fā)的甘油法技術(shù)路線通過對天然的1,3-丙二醇生產(chǎn)菌株如克雷伯氏菌等進行代謝改造，利用Red重組系統(tǒng)和CRISPR系統(tǒng)敲除副產(chǎn)物乳酸、乙醇、丁二酸積累途徑，1,3-丙二醇的產(chǎn)量可超過100g/L，得率超過0.6mol/mol，目前已實現(xiàn)了萬噸級工業(yè)化生產(chǎn)[26]。筆者所在課題組還以高絲氨酸[40]或3-羥基丙酸[41]為中間代謝物設(shè)計了1,3-丙二醇的新合成途徑，可以實現(xiàn)一個微生物細胞工廠利用甘油、葡萄糖、蔗糖、木糖等多種原料生產(chǎn)1,3-丙二醇。

1,4-丁二醇（1,4-BDO）是一種重要化工原料，主要用于生產(chǎn)四氫呋喃（THF）、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚氨酯(PU)等，在汽車電子、紡織等重要行業(yè)有重要用途[27]，目前實現(xiàn)生物法投產(chǎn)1,4-BDO。自然界不存在1,4-BDO的直接生物合成途徑，Genomatica公司利用基于人工智能的生物信息學(xué)技術(shù)計算并篩選了超過1000種的1,4-BDO合成路徑，最終對兩種潛在路徑進行了實驗驗證[39]，經(jīng)過改造的大腸桿菌可以利用葡萄糖生產(chǎn)1,4-BDO，產(chǎn)量可達18g/L[42]。為了進一步提高大腸桿菌底盤菌的還原力和能量再生途徑，通過酶分子的理性設(shè)計和定向進化提高了關(guān)鍵酶的活性并解除了1,4-BDO的反饋抑制作用，通過基因編輯減少副產(chǎn)物丙酮酸和4-羥基丁酸等積累，使得1,4-BDO產(chǎn)量可提升至125g/L，得率可達0.4g/g葡萄糖，達到理論得率的80%[27]。

1,3-丁二醇（1,3-BDO）常用作化妝品行業(yè)的保濕劑和溶劑，作為醇酸樹脂的原料與苯酐、順丁烯二酸酐等單體可制成不飽和聚酯樹脂，還可作為青霉烯和碳青霉烯β-內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵手性中間體。筆者所在課題組結(jié)合啟動子工程篩選不同來源的輔酶A依賴型乙醛脫氫酶[43]，構(gòu)建了一株可高產(chǎn)(R)-1,3-BDO的大腸桿菌，產(chǎn)量達13.4g/L[28]。

2.2 有機酸

有機酸是另一類重要的化學(xué)品。丁二酸作為一種重要的四碳酸平臺化合物，是生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)合成的重要單體，且近年來因聚氨酯生產(chǎn)中趨向于采用丁二酸替代己二酸，推動了其市場規(guī)模不斷發(fā)展擴大。琥珀酸放線桿菌[44]可以利用木糖、葡萄糖、玉米漿、農(nóng)作物秸稈廢料等高效生產(chǎn)丁二酸，基于基因編輯、蛋白質(zhì)改造技術(shù)等通過對其進行改造可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。以大腸桿菌為細胞工廠，通過代謝網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測和基因編輯技術(shù)，并結(jié)合多輪突變篩選獲得了高產(chǎn)丁二酸的高產(chǎn)菌株[45]，目前已用于萬噸級丁二酸生產(chǎn)線的生產(chǎn)。

蘋果酸和延胡索酸作為四碳有機酸與生物法制備丁二酸路徑類似。通過代謝組分析，需要敲除大腸桿菌中的三個延胡索酸酶基因并過表達磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因或乙醛酸分流操縱子增加回補途徑的通量，所得菌株通過補料分批培養(yǎng)，可利用甘油產(chǎn)生41.5g/L延胡索酸，達到最大理論產(chǎn)量的70%和0.5 1g/(L·h)的總生產(chǎn)率[33]。

2.3 有機胺

有機胺為另一類重要小分子化學(xué)品，尤其是二胺類可與二元酸合成聚酰胺，用于尼龍的生產(chǎn)，廣泛用于紡織、醫(yī)療、工業(yè)產(chǎn)品等。1,4-丁二胺是合成尼龍46的重要原料。生物法合成1,4-丁二胺主要集中于在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中，利用鳥氨酸途徑合成1,4-丁二胺[46]。通過小RNA技術(shù)對丁二胺合成途徑中的關(guān)鍵基因argF、glnA進行精細的動態(tài)代謝調(diào)控，工程化的大腸桿菌最高1,4-丁二胺產(chǎn)量可達42.3g/L[22]。

1,5-戊二胺主要用于合成生物基尼龍56、尼龍54等，由于對應(yīng)的尼龍產(chǎn)品具有良好的力學(xué)、耐熱、耐磨、回彈性能，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。目前凱賽生物、寧夏伊品利用全細胞催化法催化賴氨酸脫羧生產(chǎn)戊二胺已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。近年來，開發(fā)谷氨酸棒桿菌以實現(xiàn)利用葡萄糖一步發(fā)酵直接生產(chǎn)戊二胺受到廣泛關(guān)注。通過在谷氨酸棒桿菌中利用基因編輯技術(shù)理性設(shè)計優(yōu)化賴氨酸的合成途徑[47]、過表達戊二胺的分泌蛋白基因等[48]，目前報道的戊二胺最高產(chǎn)量可達125g/L，且純化后與癸二酸共聚合成生物基聚酰胺PA510，與化學(xué)基PA510性能相當(dāng)，具有重要的應(yīng)用前景[38]。

3 微生物細胞工廠合成多糖及聚酯類大分子化學(xué)品

能夠以糖、氨基酸、脂肪酸等為基礎(chǔ)聚合合成大分子產(chǎn)物是微生物細胞工廠不可替代的重要功能。這些大分子化學(xué)品種類豐富，且功能多樣、應(yīng)用廣泛。如胞外多糖、糖胺聚糖、聚酯、聚氨基酸、多肽、酶等，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)療藥品、生物材料、化妝品乃至石油開采等產(chǎn)業(yè)。

與小分子產(chǎn)品不同的是，大分子化學(xué)品的微生物合成不僅要在細胞層面考慮代謝工程途徑優(yōu)化、產(chǎn)物轉(zhuǎn)運強化、基因組編輯改造、產(chǎn)物合成動態(tài)代謝調(diào)控及組學(xué)規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等策略，還經(jīng)常需要考慮分子量控制問題以及發(fā)酵過程中因大分子產(chǎn)物導(dǎo)致的發(fā)酵液黏度增大、傳質(zhì)效率低從而難以實現(xiàn)高密度培養(yǎng)及高產(chǎn)率生產(chǎn)等問題，因此，基于發(fā)酵過程優(yōu)化、新裝備設(shè)計、改造以及基于大數(shù)據(jù)分析的數(shù)字化、模型化自動控制等過程強化新方法等研究也受到高度重視。

下文將以胞外多糖、糖胺聚糖以及聚羥基烷酸酯(PHA)等幾種大分子的細胞工廠改造及過程強化策略為典型代表，對微生物細胞工廠合成大分子化學(xué)品的研究策略及進展進行闡述。

胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其通常由雜聚的高分子量的多糖（10～30kDa）組成，以共價結(jié)合或松散結(jié)合的方式分布在細胞表面[49]。由原核生物產(chǎn)生的胞外多糖具有良好的水溶性、增稠性、穩(wěn)定性等獨特性質(zhì)[50]，在食品、制藥和其他行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。糖胺聚糖（glycosaminoglycan）也被稱為黏多糖，是由己糖醛酸和氨基己糖構(gòu)成的二糖單元組成的一類線性、可硫酸化、帶負電荷的特殊多糖。不同糖胺聚糖的差別體現(xiàn)在二糖單元中己糖的種類、糖苷鍵的類型和側(cè)鏈的硫酸化程度[51]。糖胺聚糖廣泛存在于自然界中，是動物體內(nèi)結(jié)締組織和細胞間質(zhì)中的特有成分，被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)療、食品等領(lǐng)域中。胞內(nèi)聚酯是生物體合成的天然儲能物質(zhì)，如PHA[52]。PHA具有良好的生物可降解性、生物相容性、熱加工性能等，有望取代現(xiàn)有的難降解高分子材料[53]。PHA材料廣泛應(yīng)用于薄膜、泡沫、纖維、醫(yī)用植入物、藥物傳遞載體、組織再生用醫(yī)療支架等[54]。

根據(jù)微生物合成上述大分子產(chǎn)物的機制不同，需要分別采用天然宿主和異源宿主改造策略，來進行高性能細胞工廠的構(gòu)建。如圖3所示。

圖3 細胞工廠合成大分子化學(xué)品的研究策略Fig.3 High-yield strategies for production of macromolecular chemicals via cell factories

從底盤菌株出發(fā)，胞外多糖中的黃原膠、結(jié)冷膠和葡聚糖[49]在自然界中分別由油菜黃單胞菌Xanthomonas campestris[55]、少動鞘氨醇單胞菌Sphingomonas paucimobilis[56]和腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides生產(chǎn)。胞外多糖的合成通常需要12～17kb的基因序列，如黃原膠合成基因簇包括11個基因[55]，結(jié)冷膠的基因簇包含多達18個基因。由于合成基因簇較大，目前還難以實現(xiàn)異源表達，所以黃原膠和結(jié)冷膠的生產(chǎn)主要限制在天然生產(chǎn)菌株之中。與此不同，葡聚糖是一種同聚糖，其合成只需要一個糖基轉(zhuǎn)移酶[57]，所以它不僅可以由原始菌株生產(chǎn)，還可以由其他的合適宿主，如乳酸菌LactobacillusSpp.、融合魏斯氏菌Weissella confusa等進行異源合成。糖胺聚糖的合成與葡聚糖較為類似，通常由一個合成酶或一個合成酶加若干個轉(zhuǎn)運酶即可合成并分泌到胞外，所以其可以在不同的宿主中進行異源合成。典型的糖胺聚糖包括透明質(zhì)酸（HA）、硫酸軟骨素和肝素等，除HA外，動物組織提取法仍然是其主要生產(chǎn)方法。HA的生產(chǎn)最早是在獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus中進行，經(jīng)誘變育種和發(fā)酵條件優(yōu)化后，可以達到10g/L以上的產(chǎn)量和2MDa的分子質(zhì)量，并已經(jīng)投入工業(yè)生產(chǎn)。但獸疫鏈球菌不屬于FDA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）所認定的公認安全（generally recognized as safe，GRAS）菌株，可能具有安全隱患。所以采用GRAS菌株進行HA生產(chǎn)的研究受到普遍關(guān)注，包括枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、乳酸菌Lactococcus lactis、谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum等。PHA與胞外多糖等產(chǎn)品不同，它是以胞內(nèi)顆粒的方式存在。PHA合成途徑所涉及的基因通常只有幾個，所以其天然生產(chǎn)菌株（如產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes eutrophus、氣單胞菌Aeromonas hydrophila、假單胞菌Pseudomonas putida等）和異源宿主（如大腸桿菌Escherichia coli）都可以發(fā)展成為高效的細胞工廠。近年來，可以顯著降低發(fā)酵成本的嗜鹽單胞菌Halomonassp.合成PHA的研究也成為熱點之一[58]，且其產(chǎn)業(yè)化和產(chǎn)品化進程都在加速推進。

總之，不管是天然菌株還是異源宿主所構(gòu)建的細胞工廠，其性能持續(xù)提升一直是產(chǎn)業(yè)化的重要需求。一般而言，對菌體自身生長的優(yōu)化、對副產(chǎn)物相關(guān)途徑的阻斷或弱化、對產(chǎn)物合成以及輔助合成途徑的強化以及對核心酶分子的優(yōu)選與設(shè)計改造等，都是普適性的重組改造策略。

此外，由于不同分子量的大分子產(chǎn)物通常具有不同的用途，所以微生物細胞工廠生產(chǎn)大分子化學(xué)品的研究需要同時考慮高產(chǎn)和分子量控制兩個方面。進一步地，可以分別從細胞層面改造和過程強化兩個角度入手，進行微生物合成大分子化學(xué)品工藝的全局優(yōu)化。

如表2所示，通過對PHA合成酶理性設(shè)計和改造可以提高酶活，并改變PHA單體分子結(jié)構(gòu)從而生產(chǎn)新產(chǎn)品[59-62]。通過CRISPR編輯技術(shù)，在非模式菌種進行細胞代謝改造，將嗜鹽單胞菌Halomonassp.中的PHA產(chǎn)量提高到60.4g/L[58]。利用ARTP誘變育種可以使難以進行基因改造的少動鞘氨醇單胞菌Sphingomonas paucimobilis中結(jié)冷膠的產(chǎn)量提高到41.6 2g/L[15,63-64]。而基于基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)下的全局改造與動態(tài)代謝調(diào)控，使得谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum中的HA產(chǎn)量提高到28.7g/L[6,18]。

表2 細胞工廠生產(chǎn)大分子產(chǎn)品的代表性改造策略Table2 Representative reconstruction methods for production of macromolecular products via cell factories

由于目前對油菜黃單胞菌等非模式微生物進行基因組編輯比較困難，針對大分子胞外多糖產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株改造經(jīng)常采用常規(guī)的誘變育種方法[63]、引入透明顫菌血紅蛋白（VHb）提高細胞對氧的獲取利用能力等輔助策略[15,64]或者添加代謝抑制劑弱化糖酵解過程[65]等間接手段調(diào)控代謝流。

進一步以HA為例簡要陳述大分子產(chǎn)物的分子量調(diào)控策略。通常，HA產(chǎn)物的分子量由發(fā)酵的產(chǎn)量、生產(chǎn)菌株的種類、透明質(zhì)酸合成酶/透明質(zhì)酸酶以及發(fā)酵工藝過程等因素共同決定。一般來說，當(dāng)HA產(chǎn)量提高時，HA的平均分子量則會下降。例如，在枯草芽孢桿菌中表達透明質(zhì)酸酶可以獲得19.4g/L的HA產(chǎn)量，分子質(zhì)量為6600Da[76]。在谷氨酸棒桿菌合成HA過程中，外源添加透明質(zhì)酸酶，HA產(chǎn)量可提高至74.1g/L，分子質(zhì)量為53kDa[66]。還可以通過調(diào)節(jié)生產(chǎn)時的溫度，來改變HA分子質(zhì)量[77]。

除此之外，對大分子產(chǎn)物分子量、產(chǎn)量及生產(chǎn)成本進行有效調(diào)控的另一個策略就是進行發(fā)酵過程強化。比如，過高濃度的胞外多糖在發(fā)酵過程中會出現(xiàn)培養(yǎng)基黏度增大，導(dǎo)致攪拌、溶氧、傳遞等受阻，普通的發(fā)酵罐攪拌槳和發(fā)酵方法難以克服高濃度胞外多糖產(chǎn)生的負面影響[78-79]。研究發(fā)現(xiàn)，對于發(fā)酵罐攪拌槳等設(shè)備的改良可以大大提高胞外多糖的產(chǎn)量[71]。固定化細胞反應(yīng)器、無細胞體系催化生產(chǎn)、微反應(yīng)器等新設(shè)備和新工藝也已經(jīng)用于黃原膠和葡聚糖的生產(chǎn)研究[74-75,80]。除了設(shè)備，發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件也很重要。利用響應(yīng)面分析和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測改良培養(yǎng)基成分、磷酸鹽限制、連續(xù)流加發(fā)酵、兩階段發(fā)酵等策略，都可以提高胞外多糖及PHA等大分子產(chǎn)物的產(chǎn)量[58,72,81-85]。

類似地，PHA發(fā)酵中也會存在溶氧和黏度問題，筆者實驗室通過在大腸桿菌細胞工廠中表達透明顫菌血紅蛋白解決了相關(guān)問題[69]。再有，PHA的分離純化也是PHA生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，經(jīng)常需要通過細胞離心、破碎、分離提取等多個環(huán)節(jié)才能得到產(chǎn)品，步驟煩瑣，成本也較高。使用CRISPR基因編輯方法調(diào)控嗜鹽單胞菌的細胞分裂生長基因，使菌體變大變長，發(fā)酵結(jié)束后自然沉降[68,86]；又或筆者實驗室在大腸桿菌基因組中引入λ噬菌體裂解基因使菌體自發(fā)裂解[69-70]，都可以減少分離純化的成本。

4 未來微生物細胞工廠生產(chǎn)化學(xué)品展望

隨著目前合成生物學(xué)研究的跨越式發(fā)展，各種基因操作困難工業(yè)微生物的基因組編輯、動態(tài)代謝調(diào)控、廣譜誘變與超高通量篩選、基于人工智能的酶分子模擬等新工具被不斷成功開發(fā)出來。未來的微生物細胞工廠，還將可以高效生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物、抗生素、淀粉等各種目標產(chǎn)品，并實現(xiàn)重要資源的回收利用。如圖4所示。

圖4 不同微生物細胞工廠合成不同分子量化學(xué)品的未來展望Fig.4 Overview of future chemicals production with different molecular mass by different microbial cell factories

其中，微生物細胞工廠合成高活性植物天然產(chǎn)物是目前的研究熱點之一。例如，利用重組大腸桿菌細胞工廠合成紫杉二烯[87]、重組酵母細胞工廠生產(chǎn)青蒿酸[88]和人參皂苷[89]等，都已經(jīng)打通合成路線或即將達到產(chǎn)業(yè)化水平。

抗生素是由細菌或真菌生產(chǎn)的一大類醫(yī)藥化學(xué)品[90]。近年來，由于微生物抗藥性問題越來越嚴重，具備抗菌功能的多肽、糖脂、脂肽等新分子的微生物合成研究也越來越多[2,91]。最新研究發(fā)現(xiàn)，新型脂肽類特納環(huán)霉素能夠殺死耐黏菌素的鮑曼不動桿菌[92]。而中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所利用二氧化碳生產(chǎn)淀粉更是近期生物制造產(chǎn)業(yè)里程碑式的進展[93]。隨著技術(shù)能力的發(fā)展，AlphaFold等人工智能工具幫助人們更快更方便地了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[23]，使得構(gòu)建生產(chǎn)各種天然產(chǎn)物的細胞工廠的進度大大加快。

為了實現(xiàn)碳中和，利用更加廣泛的營養(yǎng)源，包括秸稈處理物等纖維素木質(zhì)素處理液、廚余垃圾等低劣生物質(zhì)，進行化學(xué)品的生產(chǎn)也將是細胞工廠研究的一個重點[94-97]。而多個細胞工廠協(xié)作的多菌系統(tǒng)在生產(chǎn)天然產(chǎn)物如白藜蘆醇[98]、類黃酮[99]等的過程中也起到了重要作用[100]。

隨著越來越多的新功能元件被挖掘或創(chuàng)造出來，原本無法作為底物的物質(zhì)也能進行利用。PET（聚對苯二甲酸乙二醇酯）水解酶的發(fā)現(xiàn)[101]，使得對塑料的生物降解成為可能，塑料生物降解產(chǎn)物的高值化利用也將成為未來細胞工廠的重要應(yīng)用場景。如利用生產(chǎn)PET水解酶的大腸桿菌對PET進行降解，通過假單胞菌以降解產(chǎn)物為底物生產(chǎn)PHA等生物可降解塑料[102]，將實現(xiàn)塑料降解和再合成的統(tǒng)一，助力我國循環(huán)經(jīng)濟發(fā)展和雙碳戰(zhàn)略實施。

而對于過程工程優(yōu)化，隨著大數(shù)據(jù)分析和模擬優(yōu)化計算能力的日益提高，分子層面的酶設(shè)計改造、細胞層面的代謝途徑優(yōu)化和高通量育種以及過程工藝層面的新型生物反應(yīng)器設(shè)計開發(fā)、發(fā)酵過程優(yōu)化與自動控制、產(chǎn)物分離提取過程優(yōu)化等策略將加速交叉融合，實現(xiàn)微生物細胞工廠生產(chǎn)化學(xué)品的一體化全局設(shè)計與統(tǒng)籌優(yōu)化[71-72,74-75,80-82]。

可以預(yù)見，在不久的將來，更多的大宗和精細化學(xué)品生產(chǎn)將通過微生物細胞工廠來實現(xiàn)并創(chuàng)造巨大的價值。微生物法合成化學(xué)品這一綠色生物制造新策略將對于我國實現(xiàn)碳減排中長期目標，踐行科學(xué)發(fā)展、可持續(xù)發(fā)展國策作出重要貢獻。