納米結(jié)構(gòu)酶催化劑研究進(jìn)展

夏歡，盧滇楠，戈鈞，，吳建中，劉錚

（1清華大學(xué)深圳國際研究生院，廣東 深圳 518055；2清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084；3加州大學(xué)河濱分?；瘜W(xué)與環(huán)境工程系，美國 加利福尼亞 92521）

引 言

源于自然界的酶催化具有反應(yīng)條件溫和、（區(qū)域、立體和化學(xué)）高選擇性和高催化效率等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工、藥物合成、分析檢測及食品生產(chǎn)等[1-8]。然而，天然酶在工業(yè)環(huán)境或者操作條件下（如高溫或有機(jī)溶劑）會(huì)發(fā)生變性失活、難以重復(fù)使用。解決上述問題的方法可以分為兩大類，一類是采用蛋白質(zhì)工程方法對(duì)酶進(jìn)行分子改造[9-10]，另一類是對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾或者固定化[11-15]。

固定化酶常用的載體包括大孔樹脂、多孔玻璃、硅藻土等，采用這類材料可以有效地解決酶回收利用的問題，但固定化酶的活性與自由酶相比往往很低，其中一個(gè)重要原因是載體尺度較大，不利于酶催化過程中底物的傳質(zhì)[16-18]。納米材料由于其獨(dú)特的性質(zhì)和納米效應(yīng)，作為固定酶載體時(shí)，可賦予固定化酶獨(dú)特的性質(zhì)，如一些具有多孔結(jié)構(gòu)的納米材料往往對(duì)反應(yīng)底物有一定的富集效應(yīng)，可增加酶與底物接觸的概率，從而提高固定化酶表觀活性[19]；納米材料中的組成部分還可能對(duì)酶分子產(chǎn)生激活效應(yīng)，進(jìn)而提高固定化酶的性能[20]。采用適宜的納米材料還可為酶分子提供適宜的微環(huán)境，能最大程度地維持其天然構(gòu)象，從而提高酶在苛刻條件如高溫、有機(jī)溶劑和極端pH中的穩(wěn)定性[21-26]。此外，一些多功能化納米材料與酶的結(jié)合甚至可構(gòu)建出新型智能生物復(fù)合材料[27-31]。

本研究組開展納米結(jié)構(gòu)酶催化劑的研究近20年，發(fā)展了包括單分子酶納米凝膠[32-36]、酶-高分子納米偶聯(lián)體[37-41]、酶-無機(jī)晶體[42-45]納米雜合體、酶-MOFs[46-49]納米雜合體、酶-石墨烯[50]納米氣凝膠等多種納米結(jié)構(gòu)酶催化劑（圖1）。本文主要介紹了近期發(fā)展的新技術(shù)以及酶催化過程分子模擬新方法，討論了納米結(jié)構(gòu)酶催化劑的發(fā)展前景。

圖1 納米結(jié)構(gòu)酶催化劑的研究進(jìn)展Fig.1 The research progress of nanostructured enzyme catalysts

1 酶-無機(jī)晶體復(fù)合物

無機(jī)晶體材料具有較好的剛性結(jié)構(gòu)，可賦予固定化酶優(yōu)異的穩(wěn)定性，同時(shí)，無機(jī)晶體中的金屬組分還可能激活酶分子，進(jìn)而提高固定化酶的表觀活性。Ge等[42]利用漆酶誘導(dǎo)無機(jī)晶體（磷酸銅）成核，然后通過自組裝形成花狀結(jié)構(gòu)的酶-無機(jī)晶體復(fù)合物。研究表明，由于酶與納米無機(jī)晶體間的協(xié)同效應(yīng)，納米結(jié)構(gòu)酶催化劑的活性比天然酶提高了5～7倍，并且固定化酶的穩(wěn)定性得到了顯著提高。Zhu等[43]基于漆酶-無機(jī)晶體納米催化劑，構(gòu)建了一種快速檢測苯酚的檢測器。該檢測器能快速催化苯酚與4-氨基安替比林氧化偶聯(lián)反應(yīng)，并形成安替比林染料分子。研究表明，苯酚的檢測線性范圍為0.4 ～50μg·ml-1，并且該檢測系統(tǒng)具有良好的循環(huán)使用性能，在30次循環(huán)使用后，其催化活性能保持在初始活性的80%左右。Wang等[20]基于別構(gòu)效應(yīng)設(shè)計(jì)出α-淀粉酶與CaHPO4無機(jī)晶體的雜化納米催化劑。得益于納米CaHPO4的多級(jí)結(jié)構(gòu)以及鈣離子對(duì)α-淀粉酶的構(gòu)象調(diào)節(jié)作用，α-淀粉酶-CaHPO4納米結(jié)構(gòu)酶催化劑表現(xiàn)出比天然α-淀粉酶更高的活性。

此外，Li等[44]報(bào)道了辣根過氧化物酶和細(xì)胞色素C與水膽礬[Cu4(OH)6SO4]的納米結(jié)構(gòu)酶催化劑，研究表明，納米結(jié)構(gòu)水膽礬不僅對(duì)以上兩種金屬酶具有激活效應(yīng)，同時(shí)，還賦予了固定化酶抑菌功能。進(jìn)一步將該方法拓展至多酶體系共固定化，以辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶為典型體系，制備了多酶-磷酸銅復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)了多酶在載體中的分區(qū)分布，基于兩種酶之間的鄰近效應(yīng)，納米結(jié)構(gòu)雙酶催化劑的總活性比天然酶體系提高了3倍[45]。此外，其他酶-無機(jī)晶體納米材料如磷酸鈷[51]、氫氧化銅[52]和磷酸鋅[53]等也被探索用于構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)酶催化劑[54-56]。

2 酶-MOFs復(fù)合物

金屬有機(jī)骨架材料（metal-organic frameworks，MOFs）是一類新型多孔材料，由無機(jī)金屬離子或團(tuán)簇與有機(jī)配體通過配位鍵形成。與傳統(tǒng)多孔材料相比，MOFs具有高孔隙率、大比表面積、結(jié)構(gòu)多樣性、易修飾及較好的生物相容性等特點(diǎn)，在酶固定化中有很好的研究前景[57]。

采用類似于酶-無機(jī)晶體復(fù)合物的制備方法，在合成MOFs的前體溶液中引入酶分子，可以通過原位包埋的方法將酶分子固定到MOFs載體中[58]。將細(xì)胞色素C與ZIF-8前體（鋅離子和2-甲基咪唑）溶液混合，ZIF-8前體與生物分子官能團(tuán)之間通過氫鍵、靜電等相互作用促進(jìn)MOFs成核和生長，使酶分子在鋅離子與2-甲基咪唑自組裝形成ZIF-8過程中被原位包埋其中（圖2）[46]。由于MOFs本身很好的剛性結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性，包埋后的細(xì)胞色素C穩(wěn)定性顯著提高。Wu等[47]采用原位包埋法將葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶雙酶體系包埋于ZIF-8中，利用雙酶的鄰近效應(yīng)顯著提高了級(jí)聯(lián)反應(yīng)的總酶活，從而提高了對(duì)葡萄糖檢測的靈敏度。Zhang等[48]制備了含有介孔空洞的ZIF-8用于細(xì)胞色素C的負(fù)載，并應(yīng)用于電化學(xué)檢測過氧化氫。研究表明介孔有利于底物傳質(zhì)，與天然酶相比，固定化酶的活性提高了1.3 倍。原位包埋方法被應(yīng)用于多種不同類型酶和MOFs的組合[59-65]，進(jìn)一步證明了該方法的普適性。Hu等[66]結(jié)合微流控技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展了該方法，通過微流體混合制備了具有缺陷結(jié)構(gòu)的酶-MOF復(fù)合物，該缺陷結(jié)構(gòu)使得MOF具有微孔介孔混合的多級(jí)孔道結(jié)構(gòu)，在提高包埋酶穩(wěn)定性同時(shí)，有利于酶催化過程的底物傳遞，在5次循環(huán)使用后，固定化酶仍能保持其初始活性的73%。利用MOFs對(duì)酶進(jìn)行原位包埋受合成條件的限制，目前常用的MOFs主要是ZIFs系列，然而這類MOFs的孔徑以微孔為主，會(huì)帶來反應(yīng)過程中底物傳質(zhì)的問題。

圖2 采用原位合成法制備細(xì)胞色素C-ZIF-8復(fù)合物[46]Fig.2 Preparation of Cytochrome C-ZIF-8composites by an in situ approach[46]

除了原位包埋法外，先制備MOFs載體再進(jìn)行酶固定化的方法也得到廣泛關(guān)注[58]。Xia等[67]利用化學(xué)結(jié)合法將葡萄糖氧化酶固定于NH2-MIL-101上，以戊二醛為交聯(lián)劑，使其一端通過共價(jià)鍵與酶分子相連，另一端連接在NH2-MIL-101上。固定化酶表現(xiàn)出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性，天然葡萄糖氧化酶在60oC處理1h后活性降至初始活性的52%，同樣條件下的固定化酶仍能維持初始活性的98%，同時(shí)固定化酶對(duì)乙腈、丙酮等有機(jī)溶劑的耐受性顯著優(yōu)于天然酶。該方法適用于大多數(shù)以MOFs為載體的酶固定化，需要對(duì)MOFs引入活性官能團(tuán)，并確保參與化學(xué)結(jié)合的基團(tuán)為酶分子上遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的基團(tuán)，否則可能造成酶活性損失。該方法制備的固定化酶中的酶分子往往暴露在MOFs外，因此在特殊環(huán)境如胰蛋白酶、有機(jī)溶劑等條件下固定化酶的穩(wěn)定性提升效果有限。此外，利用MOFs內(nèi)部孔道結(jié)構(gòu)對(duì)酶進(jìn)行固定，能很好保留酶的活性，然而該方法要求MOFs的孔道尺寸與酶分子大小能相互匹配，如Ma等[68]將過氧化物酶（大小3.3 nm×1.7 nm×1.1 nm）固定在具有多級(jí)孔結(jié)構(gòu)的介孔MOF（Tb-mesoMOF）中，該MOF空腔內(nèi)分布有直徑為3.9 和4.7 nm的納米孔籠，有效防止酶的聚集。Farha等[69]設(shè)計(jì)并合成出穩(wěn)定性優(yōu)異的介孔MOF（NU-1003），該MOF孔徑可達(dá)4.6 nm，將有肌酸酐酶固定于NU-1003中得到納米結(jié)構(gòu)酶催化劑，并用于神經(jīng)毒劑的快速降解。Yaghi等[70]通過擴(kuò)展有機(jī)配體的方法合成出一系列結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的介孔MOFs，其孔徑范圍為1.4 ～9.8 nm，可用于多種酶分子的吸附固定化。

3 酶-石墨烯復(fù)合物

氣相酶催化具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景，但是由于氣相催化的無水環(huán)境導(dǎo)致酶的催化活性和穩(wěn)定性都很低，難以實(shí)際應(yīng)用[71]。本課題組近期研究[50]將酶包埋在親水、富含羥基的氧化石墨烯氣凝膠復(fù)合物中，如圖3（a）所示。石墨烯與酶分子表面氨基酸形成的氫鍵起到了保持氣相中酶分子構(gòu)象柔性的作用，將其應(yīng)用于連續(xù)流氣相催化醋酸乙烯酯和香葉醇的酯交換反應(yīng)，如圖3（b）所示。研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯氣凝膠固定化的脂肪酶的表觀活性比凍干的脂肪酶粉末提高了5～10倍，酶的初始活性能維持超過500h，如圖3（c）所示。分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步闡釋了脂肪酶-氧化石墨烯復(fù)合物的形成機(jī)理[72]。綜合分子模擬和結(jié)構(gòu)表征可知，氧化石墨烯與酶形成氫鍵取代了酶分子表面的必需水分子，這種氫鍵網(wǎng)絡(luò)使得酶分子在絕干氣體環(huán)境下保持結(jié)構(gòu)柔性，圓二色光譜分析結(jié)果表明包埋在石墨烯中的脂肪酶保持了其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖3 脂肪酶-氧化石墨烯氣凝膠復(fù)合物的制備過程(a)，氣態(tài)酶催化實(shí)驗(yàn)裝置示意圖(b)，連續(xù)操作下脂肪酶-氧化石墨烯氣凝膠的活性變化圖(c)[50]Fig.3 Preparation of procedures of lipase-GO aerogel(a),schematic diagram of experimental setup for gaseous enzymatic catalysis(b),the activity of lipase-GO aerogel during a continuous operation for500h(c)[50]

4 酶-功能高分子結(jié)合物

Zhu等[37]利用Pluronic F-127對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾制備了酶-Pluronic結(jié)合物，在甲苯、四氫呋喃等有機(jī)溶劑中能夠很好分散，使得有機(jī)相中底物分子與酶活性中心接觸的概率增加，有機(jī)相中酶的表觀活性顯著提高。同時(shí)，酶-Pluronic結(jié)合物具有溫度響應(yīng)特性，反應(yīng)溫度（40oC）下，結(jié)合物在有機(jī)溶劑中良好分散，當(dāng)反應(yīng)完成溫度降至4oC時(shí)，結(jié)合物可從溶劑中沉淀，實(shí)現(xiàn)重復(fù)使用，在10次循環(huán)使用后，酶-Pluronic結(jié)合物的催化活性仍能保持其初始活性的95%以上。Wu等[73]將脂肪酶-Pluronic結(jié)合物用于有機(jī)介質(zhì)（甲基叔丁基醚）中的不對(duì)稱氨解反應(yīng)，與天然脂肪酶相比，脂肪酶-Pluronic結(jié)合物的表觀活性提高了11倍。Yuki等[74]將脂肪酶-Pluronic結(jié)合物應(yīng)用于有機(jī)相酶催化環(huán)氧化反應(yīng)，同樣證實(shí)了其在有機(jī)相中的良好催化效率和穩(wěn)定性。

Cheng等[75]制備了有機(jī)磷水解酶-Pluronic結(jié)合物，研究發(fā)現(xiàn)酶-Pluronic結(jié)合物的最適反應(yīng)溫度比天然酶提高了20oC，并且在pH9～11范圍內(nèi)的穩(wěn)定性均優(yōu)于天然酶。在陰離子型、非離子型和生物相容性三種類型表面活性劑存在條件下，酶-Pluronic結(jié)合物均能保持很好的催化活性。在pH9，25oC條件下，酶-Pluronic結(jié)合物在10min內(nèi)能將0.1 5mmol/L的有機(jī)磷類殺蟲劑完全降解。

5 納米結(jié)構(gòu)酶催化劑的構(gòu)效關(guān)系研究

分子模擬技術(shù)為認(rèn)識(shí)酶催化過程微觀機(jī)制提供了新的工具。Cao等[76]采用分子模擬對(duì)MOFs包埋的辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶雙酶體系級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了研究，闡述雙酶共包埋鄰近效應(yīng)的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，共包埋于載體中的雙酶體系存在顯著的鄰近效應(yīng)，雙酶催化總效率隨著酶分子間距離的縮短而顯著提升，并且酶分子間的距離越短，反應(yīng)速率提升越快。該研究有助于了解密閉空間中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，為設(shè)計(jì)高效的多酶催化體系提供了重要指導(dǎo)。Wu等[49]通過調(diào)控原位包埋法中MOF前體濃度，制備了缺陷型和無定形的酶-MOF復(fù)合物。利用分子模擬結(jié)合現(xiàn)代表征技術(shù)闡明了缺陷對(duì)酶性能的調(diào)控機(jī)制。研究表明，通過降低有機(jī)配體與金屬離子的比例導(dǎo)致了MOF框架的重排和有序結(jié)構(gòu)的坍塌，進(jìn)而產(chǎn)生了更大的孔隙。具有較大孔隙的MOF促進(jìn)了底物傳質(zhì)，使酶的表觀活性得到了數(shù)倍提升。

Chen等[77]建立了多尺度分子模擬和Markov狀態(tài)模型相結(jié)合的酶催化過程模擬方法，揭示了CO2從本體溶液到碳酸酐酶活性位點(diǎn)的主要途徑，以及產(chǎn)物HC從碳酸酐酶活性位點(diǎn)脫離并擴(kuò)散到本體溶液中的途徑[78]；同時(shí)基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法探索了HC與酶活性中心相互作用的機(jī)制。該方法為酶催化過程的模擬以及酶分子改造提供了重要借鑒。此外，結(jié)合現(xiàn)代生物波譜學(xué)技術(shù)如熒光光譜、圓二色光譜等能直接反映酶分子結(jié)構(gòu)在固定化過程中的部分信息，有利于更好地研究納米結(jié)構(gòu)酶催化劑的構(gòu)效關(guān)系。

6 結(jié)論與展望

納米結(jié)構(gòu)酶催化劑在實(shí)現(xiàn)固定化酶催化活性和穩(wěn)定性的兼顧方面具有常規(guī)固定化酶所不具備的優(yōu)勢，同時(shí)，在非水相酶催化過程（例如氣相酶催化、有機(jī)相酶催化）方面展現(xiàn)出突出的性能，為應(yīng)用于工業(yè)催化過程的高效酶催化劑設(shè)計(jì)及構(gòu)建提供了有效途徑。在納米結(jié)構(gòu)酶催化劑制備過程中，如何根據(jù)工業(yè)酶催化環(huán)境、反應(yīng)物、溶劑來理性設(shè)計(jì)合適的催化載體是需要闡述的關(guān)鍵科學(xué)問題；如何開發(fā)通用、可調(diào)、綠色并且可規(guī)?；苽涞募{米固定化酶技術(shù)是需要解決的關(guān)鍵技術(shù)；發(fā)展能夠描述納米結(jié)構(gòu)酶催化劑的催化全過程并可展示分子細(xì)節(jié)的模擬方法對(duì)于酶催化劑的設(shè)計(jì)和制備具有理論指導(dǎo)意義。納米結(jié)構(gòu)酶催化劑創(chuàng)制為計(jì)算科學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)和生物學(xué)提供了學(xué)科交會(huì)點(diǎn)，而納米結(jié)構(gòu)酶催化劑的創(chuàng)新將會(huì)推動(dòng)和促進(jìn)化工工藝、裝備的創(chuàng)新和應(yīng)用。