利用Connectivity Map數(shù)據(jù)庫(kù)篩選抗菌藥物的初步研究

劉曼莉，舒 芬，張亞妮，方 偉，王開(kāi)梅，吳兆圓

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

細(xì)菌性傳染病是威脅人類(lèi)和動(dòng)物健康的重要病原，自20世紀(jì)20年代抗生素的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，抗生素仍是解決細(xì)菌性傳染病的重要手段，然而耐藥性問(wèn)題急需新型抗細(xì)菌感染的策略和藥物。

Connectivity map（Cmap）是Lamb等［1］利用1千多個(gè)小分子藥物處理人類(lèi)細(xì)胞后獲得的超過(guò)7 000個(gè)全基因組表達(dá)譜的數(shù)據(jù)庫(kù)。研究人員利用Cmap研究新化合物的活性、推論藥物的主結(jié)構(gòu)與藥理作用、找到疾病治療的新靶點(diǎn)。Gao等［2］發(fā)現(xiàn)celastrol和withaferin可作為化學(xué)伴侶和抗肥胖藥物；Dyle等［3］發(fā)現(xiàn)番茄堿可治療骨骼肌萎縮；Dudley等［4］發(fā)現(xiàn)托吡酯治療炎癥性腸??；Brum等［5］發(fā)現(xiàn)丁苯咪唑是治療骨關(guān)節(jié)炎的重要藥物等。Connectivity map是一個(gè)老藥新用、研究新化合物活性、篩選新靶點(diǎn)潛在的有廣泛應(yīng)用前景的工具。

生物堿類(lèi)化合物廣泛存在于動(dòng)植物中，是一類(lèi)含氮雜環(huán)的有機(jī)物，具有堿性和顯著的生理活性，是重要的天然產(chǎn)物之一。目前已鑒定的生物堿有超過(guò)2萬(wàn)個(gè)，一些生物堿因其抗腫瘤、抗菌和抗病毒活性，及低毒性、低成本成為研究的熱點(diǎn)。

本研究通過(guò)Cmap數(shù)據(jù)庫(kù)篩選潛在抗菌活性化合物的過(guò)程中，篩選到石蒜堿（Lycorine）、左旋水蘇堿（Betonicine）、玫瑰樹(shù)堿（Ellipticine）3個(gè)生物堿類(lèi)化合物具有潛在抗菌活性，并對(duì)它們的抑菌活性及抗溶血活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）ATCC 27853、金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）ATCC 25923由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存，豬丹毒桿菌（Ery?sipelothrix rhusiopathiae）WH13013、豬鏈球菌（Strep?tococcussuis）SC19由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)譚臣教授課題組提供。

1.2 試劑

大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基，由酵母粉、胰蛋白胨和氯化鈉按配方配制，固體培養(yǎng)基是在LB中加入瓊脂粉。酵母粉和胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID公司，氯化鈉和瓊脂粉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌使用含10%小牛血清的TSB和TSA培養(yǎng)基。TSB和TSA培養(yǎng)基購(gòu)自BD Difco公司按配方配制，小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司。

石蒜堿（B21169，≥98%）和頭孢匹羅（Cefpirome sulfate，S25863，98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。左旋水蘇堿（ZES-0605，N/A）購(gòu)自法國(guó)EXTRA?SYNTHESE公司。玫瑰樹(shù)堿（T4614，98.85%）、青霉素（Ampicillin，T0814L，99.27%）和鏈霉素（Strepto?mycin sulfate，0060，720IU）購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司。石蒜堿、左旋水蘇堿和玫瑰樹(shù)堿均使用DMSO溶解，青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅用無(wú)菌水溶解，化合物的儲(chǔ)存濃度均為10 mg/mL，試驗(yàn)時(shí)使用細(xì)菌培養(yǎng)基LB或TSB稀釋成相應(yīng)的使用濃度，同時(shí)設(shè)立DMSO和水的陰性對(duì)照孔。

綿羊紅細(xì)胞購(gòu)自廣州鴻泉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Connectivity map數(shù)據(jù)庫(kù)分析 將豬鏈球菌感染THP-1細(xì)胞中的差異表達(dá)基因（accession num?ber：GSE20508）分別以UP和DOWN文件輸入Con?nectivity map數(shù)據(jù)庫(kù)，除去不能識(shí)別的數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析，獲得6 100個(gè)化合物的Connectivity score，從Con?nectivity score為負(fù)的數(shù)據(jù)中進(jìn)行挑選。

1.3.2 藥物最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI 2012）推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行。將純化的細(xì)菌劃線接種于LB或TSA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于LB或TSB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h。將菌液按1∶1 000的比例接種于LB或TSB液體培養(yǎng)基，于37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.5（菌量約為1×108CFU/mL），再將菌懸液1∶100稀釋后備用。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入50μL倍比稀釋不同濃度的藥物，加入50μL稀釋的菌液，每種藥物每株菌3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)照藥物選擇青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅。置于37℃溫箱中孵育16～20 h，讀取測(cè)定結(jié)果。

肉眼觀察微量稀釋孔中以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的最高藥物稀釋濃度為該藥物對(duì)該種細(xì)菌的藥物最小抑菌濃度。平行操作3次，以3次結(jié)果的平均值作為此藥對(duì)該細(xì)菌的MIC。

1.3.3 藥物抗溶血試驗(yàn) 細(xì)菌于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜（37℃搖床220 r/min），1∶500擴(kuò)大培養(yǎng)4 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分裝成3 mL/細(xì)菌瓶，加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。取1 mL培養(yǎng)物離心（10 000 r/m，1 min）收集上清液，取150μL上清液于96孔板中，加入2%綿羊紅細(xì)胞150μL，同時(shí)分別做加入150μL的LB或TSB的陰性對(duì)照和加入150μL 1%Triton X-100的陽(yáng)性對(duì)照，于37℃作用2 h，8 000 r/min離心10 min。將150μL上清液移到新的96孔板中，用分光光度計(jì)測(cè)定OD540nm。樣品的溶血百分比=［（樣品OD540nm-陰性對(duì)照OD540nm）/（陽(yáng)性對(duì)照OD540nm-陰性對(duì)照OD540nm）］×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Connectivity map數(shù)據(jù)庫(kù)分析及抗菌化合物挑選

將豬鏈球菌感染THP-1細(xì)胞結(jié)果中的差異表達(dá)基因按Connectivity map網(wǎng)站的要求，分別以UP和DOWN的文件輸入數(shù)據(jù)，通過(guò)分析，獲得化合物的相關(guān)Connectivity值，共有1 685個(gè)化合物Connec?tivity值為負(fù)值。篩選出石蒜堿、左旋水蘇堿和玫瑰樹(shù)堿等3個(gè)具有潛在抗菌活性的生物堿類(lèi)化合物，相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3個(gè)化合物的Connectivity map分析結(jié)果

2.2 抗菌活性研究

將3個(gè)化合物與5株菌作用，研究化合物對(duì)G+和G-菌的抑菌情況，同時(shí)使用青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅作為陽(yáng)性對(duì)照。由表2可知，玫瑰樹(shù)堿對(duì)4種菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌和豬鏈球菌均有抑菌效果，且MIC與鏈霉素效果相當(dāng)或更優(yōu)。左旋水蘇堿和石蒜堿對(duì)5株菌均無(wú)明顯的抑菌效果。

表2 化合物的MIC結(jié)果

2.3 藥物抗細(xì)菌溶血活性

為了研究菌株的溶血活性，將5株菌分別培養(yǎng)6、12、24 h，離心取上清液與紅細(xì)胞在37℃共培養(yǎng)2 h，由表3可知，金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌有較強(qiáng)的溶血活性。

表3 5株菌的溶血活性

將3個(gè)化合物與金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌共作用12 h，取上清液與紅細(xì)胞進(jìn)行溶血試驗(yàn)。由圖1可以看出，玫瑰樹(shù)堿對(duì)2株菌均有明顯的抑制溶血活性。石蒜堿和左旋水蘇堿在64μg/mL對(duì)2株菌無(wú)明顯抑制溶血活性。

圖1 玫瑰樹(shù)堿抑制金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的溶血活性

3 討論

本研究利用豬鏈球菌感染的THP-1芯片信息，通過(guò)Cmap數(shù)據(jù)庫(kù)分析，獲得化合物的相關(guān)信息，從中挑選了石蒜堿、左旋水蘇堿、玫瑰樹(shù)堿3個(gè)生物堿類(lèi)化合物進(jìn)行抗菌活性研究。結(jié)果表明，石蒜堿和左旋水蘇堿對(duì)5株菌沒(méi)有明顯的抑菌活性。玫瑰樹(shù)堿對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌均有明顯的抑菌作用，但對(duì)綠膿桿菌沒(méi)有明顯的抑菌作用。而且玫瑰樹(shù)堿能抑制金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的溶血活性，說(shuō)明玫瑰樹(shù)堿具有廣譜的抗菌、抗溶血活性。

玫瑰樹(shù)堿是一種吲哚并異喹啉類(lèi)生物堿，主要是從夾竹桃科玫瑰樹(shù)屬植物古城玫瑰樹(shù)（Ochrosia elliptica）的葉中分離出的天然生物堿［6，7］，玫瑰樹(shù)堿及其類(lèi)似物具有抗腫瘤、抗病毒［8-10］及抗菌活性。玫瑰樹(shù)堿對(duì)豬鏈球菌和大腸桿菌有較好的殺菌作用，并能很好地抑制豬鏈球菌的溶血活性，減輕豬鏈球菌導(dǎo)致的小鼠肺損傷［11，12］。有研究表明，玫瑰樹(shù)堿的衍生物對(duì)角叉菜膠致大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎具有保護(hù)作用［13］，也可以削弱脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺炎［14］等。玫瑰樹(shù)堿的季銨鹽是D-丙氨酸-D-丙氨酸連接酶抑制劑，是細(xì)菌細(xì)胞壁合成必需的胞內(nèi)酶［15］。玫瑰樹(shù)堿的作用機(jī)制主要包括DNA嵌入、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、大分子共價(jià)烷基化和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力等［16-20］。

生物堿是一類(lèi)含氮雜環(huán)的有機(jī)物，已知的生物堿有上萬(wàn)種，主要存在于植物中。生物堿類(lèi)化合物有較強(qiáng)的生理活性，是中草藥中重要的有效成分之一。石蒜堿屬生物堿，具有抗菌、抗病毒、抗瘧疾、抗腫瘤等多方面的作用［21-26］。研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿抗腫瘤機(jī)制可能是通過(guò)干擾DNA的模板功能，影響DNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而抑制RNA的合成［27，28］。而且石蒜堿能抑制P38和STATs的激活并降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及小鼠死亡率［29］。左旋水蘇堿是益母草的主要活性成分之一，能拮抗LPS所致的病理?yè)p傷［30］。左旋水蘇堿的研究并不多，但有研究發(fā)現(xiàn)左旋水蘇堿能參與抑制細(xì)菌根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tume?faciens）的群體效應(yīng)［31，32］。

本研究中Cmap的篩選結(jié)果里包含了玫瑰樹(shù)堿、石蒜堿和左旋水蘇堿。玫瑰樹(shù)堿有較好的抗菌和抑制溶血的活性，但石蒜堿和左旋水蘇堿的直接殺菌和抑制溶血作用不明顯。因此，Cmap在藥物篩選過(guò)程中有重要的應(yīng)用價(jià)值，但仍需要通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。