蝦稻共作田有機(jī)質(zhì)降解菌的篩選和評價

鄭嬌莉，姚經(jīng)武，黃大野，楊 丹，王蓓蓓，曹春霞

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

蝦稻共作是一種新型的綠色養(yǎng)殖模式，利用稻田淺水環(huán)境和冬閑期進(jìn)行克氏原螯蝦養(yǎng)殖，水稻種植過程中減少化肥和農(nóng)藥的使用［1，2］。蝦稻共作模式下春季克氏原螯蝦生長旺盛、養(yǎng)殖密度高、投餌量加大，導(dǎo)致池塘底質(zhì)環(huán)境急劇惡化，有機(jī)物腐敗大量耗氧，并產(chǎn)生硫化氫、氨氮和亞硝態(tài)氮等有毒有害物質(zhì)，從而導(dǎo)致克氏原螯蝦免疫力降低，蝦病廣泛暴發(fā)［3-5］，底質(zhì)改良被認(rèn)為能夠有效改善蝦稻共作養(yǎng)殖環(huán)境［4］。

微生物修復(fù)（Microbial remediation）是指利用微生物的吸收、轉(zhuǎn)化、降解作用清除環(huán)境中污染物的一個受控或自發(fā)的過程［6］。微生物技術(shù)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的改良和修復(fù)，微生物菌劑能夠抑制水體中有害微生物的生長、分解殘餌廢料和動物排泄物等有機(jī)質(zhì)、維持養(yǎng)殖水體微生態(tài)平衡、增強(qiáng)養(yǎng)殖動物免疫力和促進(jìn)生長等功能。然而由于中國水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境變化很大，養(yǎng)殖種類豐富，微生物菌劑在使用過程中存在針對性和適應(yīng)性差等缺點(diǎn)，影響使用效果，因此從養(yǎng)殖環(huán)境篩選本土益生菌，開展本土菌株在養(yǎng)殖池塘污染調(diào)控及有益菌制劑的研發(fā)受到重視［7-9］，從南美白對蝦養(yǎng)殖池塘中分離篩選出1株凝結(jié)芽孢桿菌（Bacilluscoagulan），并研究了該芽孢桿菌的生長特性［10］，閆法軍等［8］從刺參養(yǎng)殖池塘中篩選出3株低溫降解菌，其對氨氮的去除率均高達(dá)95%以上，去除餌料浸出液中的COD為21.0%～50.0%，李步先等［9］將蝦蟹混養(yǎng)池塘底泥中篩選的4株本土菌制備成混合菌劑，使用5 d后對COD的降解率達(dá)70%。

本研究針對蝦稻共作田的環(huán)境改良需求，從湖北省典型蝦稻共作環(huán)境中分離有機(jī)質(zhì)降解菌，研究菌株的生長特性和降解性能，評價其應(yīng)用前景，為蝦稻共作養(yǎng)殖環(huán)境的微生物修復(fù)提供菌種資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

于2020年6月采集自湖北省不同年限、不同地區(qū)的蝦稻共作田土壤樣品，使用土鉆采集5～10個表層20 cm土壤樣品，混勻后放入4℃冰箱保存。采樣點(diǎn)樣品信息如表1所示。

表1 采樣點(diǎn)樣品信息

1.2 有機(jī)質(zhì)降解菌的分離和篩選

1.2.1 培養(yǎng)基配制1）富集培養(yǎng)基配方。取30 g蝦飼料充分研磨后加1 L無菌水，振蕩搖勻，密封后浸泡48 h以獲取上清液餌料的浸出液，離心后取出上清液進(jìn)行抽濾，重復(fù)此操作2～3次，取上清液，調(diào)節(jié)pH 7.8，分裝滅菌。2）分離培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基1 L，瓊脂25 g，pH 7.8，121℃，滅菌后倒平板。

1.2.2 樣品處理 取底泥與無菌的生理鹽水以1∶9的比例進(jìn)行混合，充分混勻后取上清液放在4℃冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 富集馴化 將制備好的樣品液接種于10 L無菌離心管，搖勻后90℃水浴20 min，盡可能除去其他微生物。然后分別將水浴處理后的各樣品液接種到富集培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，得到樣品的初始富集菌液。按1∶10的比例接種初始富集菌液于100 mL馴化培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)7 d，如此反復(fù)6個周期。

1.2.4 分離純化 取最后一次的富集液，采用平板涂布法，在分離培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株分離，涂布好后恒溫培養(yǎng)24～48 h，后挑去單菌落，在分離平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至獲得純化菌株，進(jìn)行斜面劃線并將各菌株編號保種。

1.2.5 菌株篩選 取10 mL活化菌于無菌離心管中，90℃水浴20 min，取水浴后菌液，采用平板劃線法，挑選24 h內(nèi)生長較好的菌株。試驗(yàn)以富集培養(yǎng)基作為菌株降解溶液，以不加菌的富集培養(yǎng)基作為對照，測定菌株的有機(jī)質(zhì)降解率，篩選降解率高的菌株。

1.3 菌株16S測序鑒定

采用通用引物對（27F/1492R）對菌株進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物送測序公司測序，16S測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對，對菌株進(jìn)行鑒定。

1.4 有機(jī)質(zhì)降解菌的生長和降解特性

挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，30℃、180 r/min過夜培養(yǎng)后，按照1%的比例接種于富集培養(yǎng)基中，每隔4 h取樣測定菌液的OD600nm，獲得不同菌株的生長曲線。

將培養(yǎng)過夜的LB菌液按照1%的比例接種于富集培養(yǎng)基中，分別于1、3、5、8 d后取樣測定培養(yǎng)基COD含量，從而獲得菌株的降解曲線。

1.5 有機(jī)質(zhì)降解菌的胞外酶活性測定

胞外酶活性測定培養(yǎng)基參考郭燦燦等［11］的方法，用牙簽將搖培的LB培養(yǎng)液菌株點(diǎn)接在預(yù)先準(zhǔn)備好的4種篩選平板上，每個處理4次重復(fù)，26℃培養(yǎng)48 h后測定水解圈直徑和菌落直徑。對于蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，可以通過比較水解圈直徑/菌落直徑數(shù)值來初步判斷菌株分泌胞外酶能力的大小，該值越大，菌株產(chǎn)酶能力越強(qiáng)；脂肪酶則是通過比較菌落中形成的紅色斑點(diǎn)區(qū)的大小來判斷，紅色斑點(diǎn)區(qū)越大，產(chǎn)脂肪酶能力越強(qiáng)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，通過單因子方差分析和Duncan多重比較進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各處理之間以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)質(zhì)降解菌的分離和篩選

經(jīng)富集馴化，共分離純化獲得36株菌株，降解活性如圖1所示。其中，菌株編號2、7、20、26、28、35具有較高的降解活性，這些菌株分別分離自咸寧20年蝦稻田土壤、丫角4年蝦稻田土壤，樣點(diǎn)信息如表2所示，將菌株分別命名為OC-1至OC-6。

表2 初篩有機(jī)質(zhì)降解菌基本信息

2.2 有機(jī)質(zhì)降解菌的分類

對這些菌株進(jìn)行16SrDNA序列分析，由圖2可以看出，OC-1至OC-6菌株均為芽孢桿菌，其中，OC-1、OC-2、OC-3 3株細(xì)菌均歸屬于阿氏芽孢桿菌（Bacillusaryabhattai）；OC-4初步鑒定為彎曲芽孢桿菌（Bacillusflexus）；OC-5初步鑒定為黃海芽孢桿菌（Bacillus marisflavi）；OC-6屬于芽孢桿菌（Bacillussp.）。

圖2 菌株OD-1至OD-6基于16Sr DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 有機(jī)質(zhì)降解菌的生長特性

從6種菌株的生長曲線（圖3）可以看出，OC-1、OC-3、OC-4和OC-6生長更為迅速，在接種后16 h即可達(dá)到穩(wěn)定期，而OC-2生長速率較低。值得注意的是OC-5菌株由于具有凝集特性，所以O(shè)D600nm測值偏低，在8～24 hOD600nm為0，需要用其他方法檢測其生物量。

圖3 有機(jī)質(zhì)降解菌的生長曲線

2.4 有機(jī)質(zhì)降解菌的氨氮去除特性

從表3可以看出，各菌株對氨氮有一定的去除效果，氨氮去除效果為28.89%～67.21%，培養(yǎng)4 d后OC-4和OC-6去除效果較低，分別為28.89%和30.67%，其余菌株的去除效果為50%左右。

表3 有機(jī)質(zhì)降解菌的氨氮去除特性 （單位：%）

2.5 有機(jī)質(zhì)降解菌的降解特性

菌株能夠快速降解餌料培養(yǎng)基中的有機(jī)質(zhì)，如圖4所示。OC-1至OC-3降解速率較高，培養(yǎng)1 d降解率即達(dá)70%左右，3 d達(dá)90%以上，隨著時間逐漸增加，降解率反而有所下降，這可能是由于這些菌株生長快速，高濃度的菌株分泌一些有機(jī)代謝產(chǎn)物，從而增加了培養(yǎng)基中有機(jī)質(zhì)含量。OC-4至OC-6降解速率相對較低，培養(yǎng)1 d降解率為50%左右，之后隨著培養(yǎng)時間的增加降解率逐漸升高，OC-4至OC-6降解率在培養(yǎng)3 d即達(dá)85%以上。

圖4 有機(jī)質(zhì)降解菌的有機(jī)質(zhì)降解特性

2.6 有機(jī)質(zhì)降解菌的產(chǎn)酶能力

對各菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究［11］，結(jié)果見圖5、圖6、圖7。6株菌株均能產(chǎn)生胞外蛋白酶，以水解圈/抑菌圈來反映各菌株的蛋白酶活性，發(fā)現(xiàn)OD-1至OD-3具有相對較高的蛋白酶活性（圖5）；僅OD-1至OD-3具有產(chǎn)胞外淀粉酶的能力，3種菌株淀粉酶活性相差不大（圖6），而OD-4至OD-6沒有產(chǎn)胞外淀粉酶的能力；OD-1、OD-2和OD-4具有產(chǎn)胞外纖維素酶的能力，其中OD-4產(chǎn)胞外纖維素酶活性的能力更高（圖7），其余3株菌種不產(chǎn)胞外纖維素酶；此外，6種菌株均不產(chǎn)脂肪酶。

圖5 有機(jī)質(zhì)降解菌產(chǎn)胞外蛋白酶特性

圖6 有機(jī)質(zhì)降解菌產(chǎn)胞外淀粉酶降解特性

圖7 有機(jī)質(zhì)降解菌產(chǎn)胞外纖維素酶降解特性

3 小結(jié)與討論

殘餌是水產(chǎn)養(yǎng)殖內(nèi)源性污染的主要來源，由于養(yǎng)殖過程中餌料利用率最高不到70%，大量餌料不能被養(yǎng)殖動物攝食，并不斷在底泥中積累，這些有機(jī)物在分解過程中需消耗大量的溶解氧，產(chǎn)生硫化氫、氨氮等有害物質(zhì)，嚴(yán)重污染水體，易導(dǎo)致疾病暴發(fā)，甚至養(yǎng)殖生物死亡。在蝦稻共作田中，春季投餌也導(dǎo)致水體溶氧驟降，氨氮和亞硝態(tài)氮等有機(jī)質(zhì)含量增加等問題。水產(chǎn)養(yǎng)殖微生態(tài)制劑因其具有分解有機(jī)物、降低氨氮和亞硝氮濃度、抑制有害微生物的繁殖、改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的作用，已被廣泛使用。本研究從長期蝦稻共作田中分離了6株有機(jī)質(zhì)降解菌，并研究了菌株的生長特性、有機(jī)質(zhì)降解特性和產(chǎn)酶能力。

從洪湖、后湖和咸寧等地長期蝦稻共作養(yǎng)殖環(huán)境（連續(xù)蝦稻共作12～20年）均分離到屬于阿氏芽孢桿菌的有機(jī)質(zhì)降解菌，且這些菌株降解活性高，能夠產(chǎn)生多種胞外酶，這表明這類細(xì)菌可能在蝦稻共作田中具有更廣泛的適應(yīng)能力。值得注意的是，從丫角4-3分離的黃海芽孢桿菌具有凝集聚團(tuán)的特性，細(xì)菌在培養(yǎng)液中形成顆粒性沉淀，細(xì)菌的自凝集能力與細(xì)菌表面疏水性直接相關(guān)［12］。自凝集能力對細(xì)菌的生存有重要意義，通過自凝集達(dá)到一定的數(shù)量以形成生物被膜或黏附到宿主黏膜表面來發(fā)揮生物學(xué)功能［13］，底泥是養(yǎng)殖環(huán)境重要的內(nèi)源性污染來源，若通過細(xì)菌自凝集直接作用于底泥污染物，可有效改善養(yǎng)殖環(huán)境，該菌株的應(yīng)用價值還需要進(jìn)一步研究。

本研究中分離的芽孢桿菌具有高效降解飼料浸出液有機(jī)質(zhì)的能力，其中OD-1至OD-3培養(yǎng)1 d降解率即達(dá)70%以上，培養(yǎng)3～5 d后，OD-1至OD-5的降解率最終能達(dá)90%左右，高于從其他養(yǎng)殖環(huán)境中分離的有機(jī)質(zhì)降解菌，如從羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中分離的有機(jī)質(zhì)降解菌在培養(yǎng)3 d后對飼料浸出液中有機(jī)質(zhì)的降解率為49%～53%［14］。從對蝦養(yǎng)殖池塘中篩選的有機(jī)質(zhì)降解菌在培養(yǎng)5 d內(nèi)對蝦餌料培養(yǎng)基的降解率為59%～79%［15］。這可能是由于本研究中有機(jī)質(zhì)降解菌分離自長期蝦稻共作養(yǎng)殖環(huán)境（連續(xù)蝦稻共作時間12～20年），長期養(yǎng)殖使得底泥積累了豐富的有機(jī)質(zhì)，從而富集大量有機(jī)質(zhì)降解菌。本研究中有機(jī)質(zhì)降解菌能利用飼料浸出液有機(jī)質(zhì)進(jìn)行快速生長［8］，大多在接種8 h后進(jìn)入對數(shù)期，在12～16 h即進(jìn)入穩(wěn)定期，此外有機(jī)質(zhì)降解能力與細(xì)菌的產(chǎn)胞外酶能力有關(guān)，OD-1、OD-2能夠產(chǎn)多種胞外酶，這或許能夠解釋其快速而高效的降解能力，而僅能產(chǎn)蛋白酶的OD-6，其降解速率則相對較低。

本研究篩選6株有機(jī)質(zhì)降解菌，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌，其中，OD-1、OD-2能夠快速而高效地降解餌料培養(yǎng)基中的有機(jī)質(zhì)，這可能與其能夠分泌較多種類胞外酶能力有關(guān)，這2種菌株具有一定的應(yīng)用潛力。